Romance Ensaio para Fria nocicepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Resumo

Aqui demonstramos um novo ensaio para estudar nocicepção frio em larvas de Drosophila. Este ensaio utiliza uma sonda de Peltier-construído sob encomenda capaz de aplicar um estímulo frio nocivo focal e resulta em comportamento quanto ao frio quantificáveis. Esta técnica permitirá ainda dissecção celular e molecular da nocicepção frio.

Resumo

Como organismos perceber e responder a temperaturas nocivos ainda é mal compreendido. Além disso, os mecanismos subjacentes a sensibilização das máquinas sensorial, tal como em doentes com neuropatia periférica ou sensibilização induzida pela lesão, não estão bem caracterizados. O modelo de Drosophila geneticamente tratável foi usado para estudar as células e os genes necessários para a detecção de calor nocivo, que produziu vários genes conservados de interesse. Pouco se conhece no entanto sobre as células e receptores importantes para a detecção de frio nocivo. Embora, a Drosophila não sobreviver à exposição prolongada a temperaturas frias (≤10 ºC), e vai evitar fresco, preferindo temperaturas mais quentes em ensaios de preferência comportamentais, como eles detectam e possivelmente evitar estímulos nocivos frio só recentemente foi investigado.

Aqui nós descrever e caracterizar o primeiro frio nocivo (≤10 ºC) ensaio comportamentalDrosophila. Usando esta ferramenta e ensaio, mostramos um investigador como avaliar qualitativamente e quantitativamente comportamentos nociceptivos frias. Isto pode ser feito sob condições de cultura normais / saudáveis, ou presumivelmente no contexto de doença, lesão ou sensibilização. Além disso, este ensaio pode ser aplicado a larvas seleccionados para os genótipos desejados, que pode ter impacto thermosensation, dor, ou sensibilização nociceptiva. Dado que a dor é um processo altamente conservado, utilizando este ensaio para um estudo mais aprofundado nocicepção térmica provavelmente vai recolher compreensão importante de processos de dor em outras espécies, incluindo vertebrados.

Introdução

Drosophila tem provado ser altamente útil para a identificação de novos genes e conservada circuitos neuronais subjacentes a comportamentos complexos. Moscas fornecer um conjunto de ferramentas genéticas sofisticado e um sistema nervoso simplificado que permite a manipulação de precisão genética e neuronal ^{1, 2, 3, 4} para dissecar as bases celulares e moleculares da nocicepção ^{5, 6, 7.} As larvas são particularmente úteis para estas análises, dado que os ensaios comportamentais para toque suave ^{8, 9, 10,} o calor nocivo ^{11, 12, 13} e sensação mecânica de estímulos nocivos ^{4, 11} já foram estabelecidos, ea cutícula larval transparente permite imagens ao vivo ou fixo da epiderme e neurônios sensoriais subjacentes. Recentemente, um ensaio para frio nocivo também foi desenvolvido ^7, que descrevemos em mais detalhes aqui.

Usando uma sonda de frio fino, cónico de ponta, mostra-se que as larvas de Drosophila exibem um conjunto de comportamentos reactivos específicos do frio, distinto de comportamentos observados durante a locomoção normais, seguindo toque suave, ou após dura mecânica ou alta estímulos temperatura ^{7, 8, 11} . Os comportamentos específicos de frio incluem uma contracção robusta de corpo inteiro (CT), um aumento de 45-90º os segmentos posteriores (RP) e um aumento simultâneo do segmentos anterior e posterior em forma de U (US). A prevalência destes comportamentos aumenta com a diminuição da temperatura mas cada picos a slevemente diferentes temperaturas frias. Um trabalho recente sugere que as respostas CT são mediadas por diferentes neurónios sensoriais periféricos do que aqueles que respondem ao calor nocivo ou estímulos mecânicos dura ^7.

Muito como nociceptores vertebrados, Drosophila dendrítica múltipla (MD) neurónios sensoriais periféricos têm estruturas dendríticas complexos que arborize sobre a epiderme ^1. neurónios MD estão presentes em cada segmento do corpo das larvas, que se projecta seus axónios para o cordão nervoso ventral ^14. neurónios sensoriais md são separados em quatro classes diferentes (I-IV), com base em morfologia dendrítica e têm diferentes funções sensoriais ^{4, 9, 10, 15, 16, 17.} Embora os neurónios da classe IV, são necessárias para as respostas de rolo lateral do corpo larvaisa temperaturas elevadas ou estímulos mecânicos dura ^4, classe III são necessários para os neurónios respostas suave de ^{toque, 9} e ¹⁰ não são apenas activados por frio, mas também são necessárias para as respostas comportamentais evocadas ^frios-7. Ambas as classes III e IV neurónios utilizar canais discretos do receptor transiente potencial (TRP) para facilitar as respostas comportamentais a estímulos ^{9, 10, 17, 19} nocivo ^{7, 11, 18} e não nocivo. Além disso, nocicepção larval é sensibilizado lesão seguinte, nos níveis celular ²⁰ e comportamentais ^{12, 21.}

O ensaio aqui descrito permite a quantification de qualquer normal, ou potencialmente alterados respostas comportamentais a temperaturas baixas que variam de frio nocivo (≤ 10 ºC), arrefecer inócuo (11-17 ° C), a temperaturas ambiente (18-22 ° C). As temperaturas frias utilizados neste ensaio são capazes de activar directamente classe III neurónios sensoriais, provocando robustos, reprodutíveis e cálcio aumenta as respostas comportamentais evocadas a frio, que pode ser qualitativamente e quantitativamente analisadas ^7. Este ensaio pode ser aplicado a virtualmente qualquer larvas de genótipo, bem como para as larvas expostas a diversas condições ambientais (nutrição alterada, ferimentos, agentes farmacológicos) para determinar os factores genéticos e ambientais que têm impacto sobre a nocicepção frio, sensibilização nociceptiva ou plasticidade nociceptiva. Dado que thermosensation é ubíqua em muitas espécies, este ensaio proporciona uma ferramenta valiosa para o estudo da nocicepção e pode descobrir novos alvos gicos ou interacções neuronais que irão melhorarnossa compreensão da nocicepção vertebrados.

A sonda fria com especificação (ver sonda fria, Tabela de Materiais) utiliza uma temperatura de circuito fechado controlado dispositivo Peltier, o qual arrefece o eixo de alumínio e ponta cónica através de condução térmica. Um termistor é incorporado no interior da ponta cónica alumínio relata a temperatura em tempo real na unidade de controlo. Um dissipador de calor e do ventilador estão ligados ao módulo termoeléctrico, para regular a carga do efeito Peltier calor (Qc) de modo que o intervalo de temperatura desejado de (22-0 ° C) pode ser obtida (ver a Unidade de Controlo térmica, Tabela de Materiais). O estímulo frio nocivo da ponta da sonda a frio é aplicada à mão à linha média dorsal, ao segmento (s) equidistante das extremidades anterior e posterior (aproximadamente segmento A4, ver Figura 1A) da larva. Em resposta a estímulos frios, geralmente larvas produzir um dos três comportamentos evocado a frio a cerca de 10 s de corte: um corpo completocontracção (CT), um aumento de 45-90º segmentos anterior e posterior em forma de U (US), ou um aumento dos segmentos posteriores (PR) (descritos nos resultados). Nenhum desses comportamentos são realizadas durante a locomoção peristáltico normal ou comportamento de forrageamento. Estes comportamentos são também distintas das respostas de toque suave e a resposta de rolamento aversivo a alta temperatura ou estulos mecicos nocivos.

Protocolo

1. Preparação de Larvas

1. Levante ações ou cruzamentos genéticos em uma incubadora de 25 ºC.
   1. Se o cultivo de uma cruz, use 20-25 fêmeas virgens e 15-20 machos por frasco contendo media milho mosca regular. Permitir fêmeas põem ovos por aproximadamente 48 h antes de transferi-los para um novo frasco de alimentos.
2. 4-5 dias após a postura de ovos, recolher 3 ^rd instar larvas do genótipo desejado por esguichando suavemente uma corrente de água para a comida mole e larvas, e despejar o conteúdo em, um prato de Petri limpo de tamanho médio (60 mm x 15 milímetros).
3. Em seguida, delicadamente classificar larvas por tamanho usando uma pinça ou um pincel para impedir maior "vagando ^3º instar" ou pequenas larvas doentia de ser testado. Rejeitar larvas contendo quaisquer marcadores ou equilibradores genéticos indesejados.
4. Tenha um colega de laboratório pratos rótulo ou recipientes onde as larvas classificadas serão colocados de modo que o experimentador pode ser "cego" ao excondição perimental ou genótipo do larvas se for o caso. O experimentador pode aplicar etiquetas descodificados aos dados recolhidos após a experiência utilizando uma chave gerada por um laboratório-membro.
5. Usando um scoopula, transferir uma quantidade do tamanho de dime-de alimento fresco para um (35 milímetros x 10 mm ou 60 mm x 15 mm) limpa, marcada placa de Petri cheia de meio caminho com água à temperatura ambiente.
6. mover-se suavemente as larvas classificadas na alimentos (para evitar a fome ou dessecação se o teste é antecipado para tomar mais do que 20 min) usando uma pinça ou pincel.

2. Fria Probe Assay

1. Ligar a unidade de sonda fria permitindo um min poucos que arrefeça para a temperatura desejada. Se definir a temperaturas mais baixas, a condensação irá provavelmente formar ao longo da sonda.
2. Enxugar qualquer excesso de humidade com um laboratório limpar antes da aplicação para a larva. Quando não está em uso imediato, lugar isolante tampa em ambos sonda para isolar e manter a ponta limpa e evitar danos.
3. Coloque um meio 3 ^rd instar larva sobre uma folha fina de escuro vinil móvel (tipicamente, usar uma pequena peça cortada a partir de uma pasta do caderno) sob um microscópio de campo brilhante. Os auxiliares de vinil preto em contraste visualização e em movimento a larva sem tocá-lo para alinhar adequadamente com a sonda.
4. Ajustar o microscópio (ver Tabela de Materiais) e unidade de luz (ver Tabela de Materiais) de brilho médio (50-75% de brilho máximo) para proporcionar o contraste e a impedir que a larva de secar demasiado depressa.
5. Descarte qualquer larvas que não primeira exposição locomoção peristáltico normal, como eles poderiam confundir os resultados. A larva deve ser húmido a partir da placa de Petri de água de outro modo a larva vai ficar com o vinil inibir locomoção normal. A água não deve poça em torno da larva.
6. Avançar a sonda com a mão em direcção a larva em um ângulo de 90º em relação ao eixo ântero-posterior do corpo, usando o vinilo para mover a larva em CRposição rect (ver Figura 1A).
7. Orientar a ponta da sonda a colocar suavemente através da superfície dorsal meados da larva com a sonda a aproximadamente um ângulo de 45º para a platina do microscópio.
8. No momento do contacto da sonda, iniciar um temporizador de laboratório. Aplicar pressão descendente suficiente para recuar ligeiramente a superfície da cutícula larvar permitindo ainda para a frente ou para trás, movimento.
9. Manter a sonda no lugar até 10 s ou até que uma resposta comportamental evocado a frio é observado - o que ocorrer primeiro. Em seguida, remover a sonda.
10. Grave a resposta comportamental observada ea latência de resposta. Larvas que não respondem dentro de 10 s são considerados "não-respondedores". Latência também podem ser gravadas para respondedores e usadas para medir as alterações em resposta robustez / amplitude.
11. Descarte larva e preparar a próxima.
12. Repita os passos 2,3-2,11 até que o número desejado de larvas de teste é alcançada (três conjuntos de n = 20-40 larvas foram used aqui).

Resultados

Drosophila larvas movimento com um movimento peristáltico que inclui pausas ocasionais, vira a cabeça, e mudanças de direção ^22. Em resposta ao pedido focal de um estímulo frio nocivo no entanto, as larvas apresentam um conjunto de comportamentos únicos, ao contrário do rolo de lateral aversiva para calor nocivo e estímulos mecânicos. Estes comportamentos são também diferentes de respostas ao toque suave ^8,

Discussão

O ensaio aqui descrito pode ser utilizado para avaliar quantitativamente e qualitativamente nocicepção ou sensibilização nociceptiva em larvas de várias origens genéticas, as influências ambientais, e / ou condições induzidas por danos. Uma vez que este ensaio permite a aplicação de um estímulo de foco frio, com esta ferramenta pode-se avaliar a função de um subconjunto de neurónios sensoriais periféricos especificamente em resposta a temperaturas frias. Curiosamente, estes comportamentos evocou a frio parecem utilizar ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sonda Fria	Pro-Dev Engineering	Construído sob medida sob demanda	Números de peça e detalhes de construção podem ser fornecidos a pedido
Unidade de Controle Térmico	Tecnologia TE	Gabinete personalizado	Números de peça e detalhes de construção podem ser fornecidos a pedido
Microscópio Zeiss Stemi 2000	Zeiss	NT55-605
Fiber-Lite MI-150 Iluminador	de Alta IntensidadeIndústrias Dolan-Jenner.	A20500
Schott Dual Gooseneck 23 polegadas Guia de Luz de Fibra Óptica	Schott North America, Inc.	Fórceps Schott A08575
	FST	FS-1670	Usado para classificar e manusear larvas. Certifique-se de alisar e cegar levemente as pontas dos fórceps para diminuir o risco de perfurar ou ferir acidentalmente as larvas
Pincel	Dick Blick Art Materials	06762-1002	Usado para classificar e manusear larvas. É útil se o pincel estiver úmido durante o uso.
Placa de Petri de Poliestireno de 35 mm x 10 mm	Falcon	351008
60mm x 10 mm Placa de Petri de Poliestireno	Falcon	351007
Peça de vinil preto (pelo menos 2 polegadas x 2 polegadas)			Usada para fornecer contraste e orientar as larvas para a sonda fria
Espátula Scoopula da Fisherbrand	Fisher Scientific	14-357Q	Usada para mover alimentos
Kimtech Science Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Usado para secar as larvas e sonda fria se houver excesso de umidade