Estudos de estrutura e função em células-tronco embrionárias de camundongos usando troca de cassete mediada por recombinase

Summary

Proteínas, muitas vezes contêm vários domínios que podem exercer diferentes funções celulares. Gene knock-out (KO) não consideram essa diversidade funcional. Aqui, relatamos uma abordagem de estrutura-função com base na troca de cassete mediada por recombinação (RMCE) em KO células estaminais embrionárias que permite a dissecação molecular de vários domínios funcionais ou variantes de uma proteína.

Abstract

engenharia genética em embriões de ratinho ou células estaminais embrionárias (mESCs) permite o estudo da função de uma dada proteína. As proteínas são os laboriosos da célula e frequentemente consistem em vários domínios funcionais, que podem ser influenciados por modificações pós-traducionais. O esgotamento de toda a proteína em condicional ou constitutiva knock-out ratos (KO) não leva em conta essa diversidade funcional e regulação. Uma linha MESC e um modelo de ratinho derivado, em que um local de acoplamento para FLPe troca cassete mediada por recombinação (RMCE) foi inserida dentro do locus ROSA26 (R26), foi anteriormente relatado. Aqui, nós relatamos em uma abordagem de estrutura-função que permite a dissecção molecular das diferentes funcionalidades de uma proteína de múltiplos domínios. Para este fim, os ratos RMCE-compatível deve ser cruzados com ratinhos KO e mESCs KO então RMCE-compatíveis devem ser isoladas. Em seguida, um painel de construções de salvamento putativos pode ser introduzida no locus de R26 via RMCE targeting. Os cDNAs candidatos de resgate pode ser facilmente inserido entre os locais RMCE do vector de direccionamento utilizando recombinação clonagem. Em seguida, mESCs KO são transfectadas com o vector de direccionamento, em combinação com um plasmídeo de expressão da recombinase FLPe. RMCE reativa o gene de resistência à neomicina promotor-menos nos locais de ancoragem ROSA26 e permite a seleco do evento de direccionamento correcto. Desta forma, a eficiência elevada de segmentação perto de 100% são obtidas, permitindo a inserção de várias construções de salvamento putativos de uma forma semi-elevado rendimento. Finalmente, um grande número de construções de salvamento R26 accionadas podem ser testados quanto à sua capacidade para resgatar o fenótipo que foi observada em mESCs KO parentais. Apresenta-se um estudo de estrutura-função de prova de princípio em catenina p120 (p120ctn) mESCs KO usando diferenciação endoderme em corpos embrióides (EBS) como a leitura fenotípica. Esta abordagem permite a identificação de domínios importantes, vias a jusante putativos, e ponto de doença relevantesmutações que estão subjacentes fenótipos KO para uma determinada proteína.

Introduction

Estima-se que os genomas de mamíferos contêm cerca de 20.000 genes codificadores de proteínas. O splicing alternativo e modificações pós-tradução aumentam ainda mais o repertório de proteínas. As proteínas têm uma estrutura modular de ^um e muitas vezes conter vários domínios de interacção, que permitem o seu recrutamento para complexos proteicos diferentes e a sua participação em vários processos celulares ^2. Um exemplo é a proteína multi-funcional chamado p120ctn. p120ctn é codificada pelo gene Ctnnd1 e consiste de um grande domínio central tatu repetição flanqueado por um N-terminal e uma região C-terminal. O....

Protocol

Todos os experimentos com ratos foram conduzidos de acordo com os regulamentos animais institucionais, nacionais e europeus.

1. Isolamento de mESCs KO RMCE compatíveis

1. Raça ratinhos KO heterozigicos com ratinhos RMCE-compatíveis, tais como ratinhos ROSALUC ¹⁰ ou ROSA26-iPSC ratos ^21. Ambos os ratinhos RMCE-compatível foram mantidos num 129 / C57BL6 / fundo Swiss misto.
   NOTA: Cruzando com KO heterozigotos é aconselhado para superar letalidade embrionária em ratos KO homozigotos.
2. Utilizar PCR para selecionar ratinhos KO heterozigicos contendo uma cassete de RMCE no locus R26

Results

O procedimento para isolar linhas KO Mesc RMCE-compatível está representado na Figura 2. Dois cruzamentos consecutivos são necessários para obter blastocistos KO RMCE compatível. Primeiro, os ratinhos KO heterozigicos são cruzados com ratinhos RMCE-compatível, para obter ratinhos KO heterozigicos RMCE-compatível. Estes ratinhos são então utilizados para acasalamentos programados com outros ratinhos KO heterozigicos para se obter 3,5-DPC, RMCE-compatível, blastocistos KO .......

Discussion

Nosso método de isolamento MESC é user-friendly e não requer habilidades avançadas ou equipamentos, tais como a microcirurgia de blastocistos. Assim, esta tecnologia é acessível a uma grande parte da comunidade científica. Qualquer pessoa com experiência básica de cultura celular pode propagar outgrowths ICM e estabelecer mESCs linhas. No entanto, a lavagem e manuseio de blastocistos requer alguma prática. Uma pipeta de boca é usado para transferir os blastocistos e consiste de uma micropipeta, um suporte de micropipeta.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ROSALUC Camundongos	feitos em casa		esperma congelado disponível mediante solicitação
Camundongos R26-iPSC	feitos em casa		esperma congelado disponível mediante solicitação
Sonda de vaso	Fine Science Tools	10160-13	para verificar se há tampões de cópula
M2 médio	Sigma-Aldrich	M7167	faça alíquotas e armazene a -20 ° C
Pinça fina (Dumont #5 Ponta padrão Pinça de estudante)	Ferramentas Fine Science	11251-10	pulverize com 70% de EtOH antes de usar (não autoclave)
Agulhas de 23 G	Fine-ject	8697
Seringas de 1 mL	Soft-ject	6680
Placas de grau bacteriano de 60 mm (para lavagem)	Gosselin	BB60-01
Pipeta de boca	feita em casa		veja a discussão
Fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs, TgN (DR4)1 Jae scep	ATTC	SCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae camundongos	The Jackson Laboratory	3208
Mitomicina C	Sigma-Aldrich	M0503
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio ou magnésio	Gibco	14190-094
Tg(DR4)1Jae/J camundongos	JAX	3208	que contêm quatro genes selecionáveis por drogas e DR4 MEFS confere resistência à neomicina, puromicina, higromicina e 6-tioguanina
0,1% Gelatina	Sigma-Aldrich	G1393	Dissolver 0,5 g em 500 ml de água destilada, autoclave e conservar a 4 °C.
Tripsina (0,25%)	Gibco	25200-056
2 μ M pluripotin	Cayman Chemical	10009557
pRMCE-DV1	Coleção BCCM/LMBP	LMBP 08870	público disponível na coleção BCCM/LMBP (http://bccm.belspo.be)
Coleção pRMCE-DV1	BCCM/LMBP excisada por cre-extirp	LMBP 08195	público disponível na coleção BCCM/LMBP (http://bccm.belspo.be)
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA	Addgene	20733
resistente a choques térmicos DH5&alfa; bactérias	feito em casa
Vetor Gateway pDONR221	Thermo Fisher	12536-017	contém gene de resistência à canamicina
BP clonase II mix	Thermo Fisher	11789-020
LR clonase II mix	Thermo Fisher	11791-020
Caldo Luria (LB)
Ampicilina
Analisador de DNA Applied Biosystems 3730XL	Thermo Fisher	3730XL
G418	Thermo Fisher	11811-023
Reagente de transfecção Lipofectamine 2000 Reagente de transfecção	Thermo Fisher	11668027
Lipofectamine LTX	Reagente
Effectene	Qiagen	301425
GATEWAY pENTR 1A vector	Thermo Fisher	A10462	anticorpo
monoclonal de camundongo vetor	Transduction Laboratories	610134
anticorpo monoclonal anti-Ecadherin	Transduction Laboratories	610181
General equipment
Ferramentas de dissecção			estéreis tesouras finas e fórceps para dissecar o útero
Pipetas estéreis: 5 mL, 10 mL e 25 mL
Tubos de centrífuga cônicos de 15 mL e 50 mL Placas
de cultura de 96 poços Fundo em forma de V e fundo plano)
Placas de cultura: 24 poços, 12 poços e 6 poços Pipetas
multicanal (para pipetar 30, 50, 100 e 200 μ L)
Reservatórios
Acesso a um fluxo
Acesso a uma incubadora a 37 graus; C com 5% de CO2
Acesso a um microscópio
Acesso a uma centrífuga
Acesso a um microscópio estéreo com luz transmitida
Meios de cultura
MEF Medium			stored at 4 ° C; quente 30 min a 37 > C antes de usar
Dulbecco' s Águia modificada' s medium (DMEM)	Gibco	41965-062
10% soro fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F-7524
L-glutamina (2 mM)	Gibco	25030-024
Piruvato de sódio  (0,4 mM)	Gibco	11360-039
penicilina (100 U/mL)	Gibco	15140-122
estreptomicina (100 µ g/mL)	Gibco	15140-122
meio mESC baseado em SR			armazenado a 4 &graus; C; quente 30 min a 37 > C antes do uso
DMEM/F12	Gibco	31330-038	misturado em uma proporção de 1:1
15% de reposição de soro knock-out (SR)	Gibco	10828– 028
L-glutamina (2 mM)	Gibco	25030-024
0,1 mM de aminoácidos não essenciais	Gibco	11140-050
penicilina (100 U/mL)	Gibco	15140-122
estreptomicina (100 µ g/mL)	Gibco	15140-122
β-mercaptoetanol (0,1 mM)	Sigma-Aldrich	M 3148
2.000 U/mL de camundongo recombinante LIF	(Instalação de serviço de proteína IRC/VIB)
meio mESC baseado em FBS (semelhante ao meio mESC baseado em SR)			armazenado a 4° C; quente 30 min a 37° C antes de usar
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
Differention Medium			stored at 4 ° C; quente 30 min a 37 > C antes
de usar Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	21980-032
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
5% CD Hybridoma Médio(1x) líquido	Gibco	11279-023
2 mM L-glutamina	Gibco	25030-024
0,4 mM 1-tioglicerol	Sigma-Aldrich	M-6145
50 μ g/mL de ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	A-4544
penicilina (100 U/mL)	Gibco	15140-122
estreptomicina (100 µ g/mL)	Gibco	15140-122
2i
1 μ Inibidor de M Erk PD0325901	Axônio Medchem	Axônio 1408
3 μ Inibidor de M Gsk3 CHIR99021	Axônio Medchem	Axônio 1386