Method Article

Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

DOI:

10.3791/55578

⸱

May 5th, 2017

 ,  ,  , 
1Flow Cytometry Core Facility, Center for Translational Research-Technical Core, Institut Pasteur, 2Unit for Lymphopoiesis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, 3Stem-Cell Microenvironments in Repair/Regeneration Team, Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3s), INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, 4ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 5Stem Cells and Regenerative Medicine Team, UMRS 1166, ICAN - Institute of Cardiometabolism And Nutrition, UPMC - Université Pierre et Marie Curie - Paris 6, INSERM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve espectral citometria, uma nova abordagem em citometria de fluxo que usa as formas de espectros de emissão de distinguir fluorocromos. Um algoritmo substitui compensações e pode tratar auto-fluorescência como um parâmetro independente. Esta nova abordagem permite a análise adequada de células isoladas de órgãos sólidos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A citometria de fluxo foi usada para os últimos 40 anos, para definir e analisar o fenótipo da linfóide e outras células hematopoiéticas. Inicialmente restrita à análise de alguns fluorocromos, atualmente, existem dezenas de diferentes corantes fluorescentes, e até 14-18 corantes diferentes podem ser combinados em um momento. No entanto, várias limitações ainda prejudicar as capacidades analíticas. Devido à multiplicidade de sondas fluorescentes, análise de dados tornou-se cada vez mais complexa devido à necessidade de grandes, matrizes de compensação multi-paramétricos. Além disso, modelos de murganhos mutantes transportando proteínas fluorescentes para detectar e oligo tipos de células específicas em diferentes tecidos tornaram-se disponíveis, por isso, é necessária a análise (por citometria de fluxo) de suspensões celulares de auto-fluorescentes obtidas a partir de órgãos sólidos. Espectrais citometria de fluxo, que distingue as formas de espectros de emissão ao longo de uma ampla gama de comprimentos de onda contínuos, resolve alguns destes problemas. Os dados são analisados ​​wom um algoritmo que substitui matrizes de compensação e trata auto-fluorescência como um parâmetro independente. Assim, citometria de fluxo espectral deve ser capaz de discriminar fluorocromos com picos de emissão semelhantes e pode fornecer uma análise multi-paramétrico, sem exigências de compensação.

Este protocolo descreve o fluxo de citometria espectral análise, permitindo um 21 parâmetro (19 sondas fluorescentes) caracterização e a gestão de um sinal auto-fluorescente, proporcionar alta resolução na detecção população menor. Os resultados aqui apresentados mostram que o fluxo de citometria espectral apresenta vantagens na análise de populações de células a partir de tecidos difíceis de caracterizar em citometria de fluxo convencional, tal como o coração e o intestino. Espectrais citometria de fluxo, assim, demonstra a capacidade de análise multi-paramétrico de gestão de alto desempenho citometria de fluxo convencional, sem a exigência de compensação e permite auto-fluorescência.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nas últimas décadas, a citometria de fluxo (FCM) tornou-se um método analítico amplamente disponível, essencial para estudos de fenótipos celulares. Houve um aumento substancial nos corantes fluorescentes disponíveis, particularmente fluorocromos excitados pelo laser violeta (405 nm) ( por exemplo, Brilliant Violet e novos corantes Q-dot). No entanto, o crescimento de corantes fluorescentes disponíveis aumenta o risco de sobreposição de emissões e requer matrizes de compensação de mão-de-obra intensiva. A FCM tornou-se amplamente utilizada para analisar suspensões de células de tecido sólido, mas a presença de células auto-fluorescentes limita a discriminaçã....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Instituto Pasteur de Ética Carta e as orientações da UE e foram aprovados pelo Ministério da Agricultura francês.

1. células em suspensão Preparação de rato adulto Órgãos

  1. Isolamento de esplenócitos
    1. Eutanásia ratos adultos por deslocamento cervical. Faça uma incisão na linha média do abdômen e abra a pele com uma tesoura. Colheita do baço com uma pinça.
    2. Esmagar o baço entre duas lâminas de vidro de microscópio para dissociar as células e dilui-los em 5 ml de solução salgada equilibrada de Hank (HBSS) contendo 1% de soro fetal de vitelo (FC....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

21 parâmetros painel FCM espectral para analisar esplenócitos

A Figura 1 mostra os resultados obtidos com o painel 19-fluorescente-anticorpo aplicado a células esplénicas compreendendo anticorpos que reconhecem diferentes subconjuntos de T, B, NK, dendríticas e células mielóides, enquanto CD45 etiquetas todas as células nucleadas hematopoiéticas. O painel também inclui um corante de viabilidade (PI), assim como o.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FCM convencional baseia-se na detecção de fotões emitidos após a excitação de sondas fluorescentes. A emissão de fluorescência de um fluorocromo detectada num detector concebido para medir o sinal de outro fluorocromo induz sobreposição física. Este transbordamento entre os espectros de emissão precisa ser corrigido por compensações.

FCM espectral e o processamento de dados pelo algoritmo de desmistura desconvolução permite a combinação de fluorocromos com picos de emissão estreitos sem comp.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reconhecemos as contribuições técnicas e teóricas em citometria espectral K. Futamura, que também revisou criticamente o manuscrito. Nós também estamos em dívida com C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, e P. Pereira pela leitura crítica do manuscrito e para aconselhamento técnico interminável e apoio. Agradecemos também P. Pereira pelo dom dos anticorpos marcados anti Vγ7-APC e Vδ4-biotina. Nós aknowledge do Centro d'Enseignements do Instituto Pasteur de boas-vindas e apoiar a logística de filmagem. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Pasteur, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); Science Foundation e Pasteur Bourse Roux ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CamundongosJanvier LabsCD45.2Fonte de células
Etanol 70%VWR83801.36Esterilização
DPBS (Ca2+, Mg2+)GIBCO ThermoFisher14040-174Coleta de embriões
salina balanceada de Hanks (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+)GIBCO Life ThermoFisher14025092Soluções de dissociação, digestão e coloração
salina balanceada de Hanks (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-)GIBCO Life ThermoFisher14175095Soluções de dissociação, digestão e coloração
Soro fetal de bezerro (FCS)EUROBIOCVFSVF00-0USoluções de dissociação, digestão e coloração
ColagenaseSigmaC2139Solução enzimática
90 x 15 mm,
placas de Petri para cultura de tecidos plásticos.		TPPT93100Coleção de embriões e corações
35 x 15 mm,
cultura de tecidos plásticos Placas de Petri.		TPPT9340Coleção Corações
Tesoura de íris finaFerramentas de Ciência Fina14090-09Ferramentas de dissecação
Pinça bruta (pinça de padrão estreito, curvada 12 cm)Ferramentas11003-12Ferramentas de dissecação
Pinça fina (pinça Dumont no. 7)Ferramentas de Ciência Fina11272-30 Ferramentas dedissecação
Bisturi;VWR21909-668Ferramentas de dissecação
LEICA MZ6 Microscópio de dissecaçãoLEICAMZ6 10445111Amostragem; Ocular W-Pl10x/23
Fonte de lâmpada friaSCHOTT VWRKL1500 compactSampling;
Tubos FACS adaptados a duas fibras de pescoço de ganso
VWR60819-310Células de digestão
Placa de 96 poços (fundo redondo)VWR10861-564Células de coloração
Tecido de nylon de malha esterilizado
peças de 50/50 mm.		SEFAR NITEXSEFAR NITEXFiltração celular
UltrasComp eBeads
Anticorpos marcados com fluorescênciaBiolegendNúmero de catálogo, consulte a tabela abaixoCélulas de coloração
Solução Solução de Ciência Fina

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
  2. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spectral Flow CytometryCell Suspension IsolationSolid Tissue AnalysisAutofluorescence ManagementMulti parameter AnalysisCompensation free DetectionHeart Intestine Cell IsolationPropidium Iodide StainingAntibody Panel StainingFlow Cytometry Gating

Related Articles