Artigo de método

Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

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DOI:

10.3791/55585

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17 de abril de 2017

 ,  ,  , 
1Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, 2Core Facility Mass Spectrometric Proteomics, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Neste artigo

Resumo

gotículas lipídicas são organelos importantes para a replicação de vários agentes patogénicos, incluindo o vírus da hepatite C (HCV). Descreve-se um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas; ele pode ser utilizado sob uma variedade de condições, tais como infecção por vírus, stress ambiental, ou tratamento com droga.

Resumo

gotículas lipídicas são vitais para a replicação de uma variedade de diferentes agentes patogénicos, mais proeminentemente o vírus da hepatite C (VHC), tal como o local putativo de morfogese do viri. análise do proteoma de gotículas de gordura quantitativo pode ser usado para identificar proteínas que se localizam a ou são deslocadas a partir de gotículas lipídicas em condições, tais como infecções por vírus. Aqui, descrevemos um protocolo que tem sido utilizado com sucesso para caracterizar as alterações no proteoma de gotículas de gordura após a infecção com HCV. Usamos Stable Isótopos Etiquetagem com Aminoácidos em cultura celular (SILAC) e, assim, identificar o proteoma completa de uma população de células com aminoácidos "pesadas" para quantificar as proteínas por espectrometria de massa. Para o isolamento de gotículas de gordura, as duas populações de células (isto é, / "leves" aminoácidos infectados com HCV e / aminoácidos não infectadas de controlo "pesadas") são misturados 1: 1 e lisadas mecanicamente em tampão hipotónico. Após a remoção dos núcleos e de células debris por centrifugação a baixa velocidade, as proteínas associadas a gotícula de lípido são enriquecidos por dois passos de ultracentrifugação subsequentes seguidos de três passos de lavagem em tampão isotónico. A pureza das fracções de gotículas lipídicas é analisada por transferência de western com anticorpos que reconhecem diferentes compartimentos subcelulares. proteínas associadas a gotícula de lípido são então separados por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida por manchamento de Coomassie. Após digestão tríptica, os péptidos são quantificados por espectrometria de massa de cromatografia de ionização por electrospray-tandem líquido (LC-ESI-MS / MS). Usando este método, identificamos proteínas recrutados para gotículas lipídicas após infecção HCV que possam representar fatores do hospedeiro pró ou anti-virais. O nosso método pode ser aplicado a uma variedade de diferentes células e condições de cultura, tais como a infecção com agentes patogénicos, o stress ambiental, ou tratamento com droga.

Introdução

Gotículas lipídicas são altamente citoplasmáticos (e nucleares) organelos celulares dinâmicas compostas por um núcleo de lípidos neutros (triglicéridos (TG) e éster de colesterol (EC)) fechado por uma monocamada de fosfolípidos com proteínas incorporadas 1. Todos os tipos de células produzem gotículas lipídicas, mas que variam em tamanho, composição lipídica, e decoração proteína. gotículas lipídicas cumprir diversas funções, incluindo a servir como reservatórios de energia e precursores de membrana ou como depósitos de proteínas. Além disso, através da absorção de lípidos, que protegem as células de lipotoxicidade, lípidos de libertação como moléculas de sinalização, e estão envolvidas na degradação da proteína e respostas a stress do retículo endoplasmático (ER) 2. Como tal, uma série de proteínas ligar-se a gotículas de lípidos e regular a sua geração, degradação, tráfego e interacção com outros organelos. Entre elas estão a família de proteínas de ligação perilipin gotícula de lípido bona fide (PLIN1-5)f "> 3.

Lipid gota biogénese provável começa no ER, em que as enzimas ER-residente catalisar a síntese de lípidos neutros que se acumulam no interior da bicamada da membrana, formando uma lente de lípidos neutros, um processo que foi recentemente visualizado bem em levedura 4. Membrana de dobragem e os níveis de ácido e diacilglicerol fosfatídicos elevadas são depois pensado para atrair as proteínas envolvidas na biossíntese de fosfolípido, como a síntese simultânea dos lípidos neutros e dos fosfolípidos do núcleo de blindagem é necessário para a geração de gotículas de gordura 5. Enzimas que albergam domínios transmembranares que residem no ER catalisar este processo. Expansão de grandes gotículas lipídicas requer a actividade de uma classe diferente de enzimas de síntese de lípidos que abrigam uma hélice anfipática e pode, assim, viajam do RE para gotículas lipídicas. A mobilização de lípidos de gotículas lipídicas ocorre através da activação local do triglicéridese diacilglicerol e lipases da lipase de triglicéridos adiposo (ATGL) e sensível a hormonas lipase (HSL) ou por diferentes vias autofágicos, tais como macro e microlipophagy ou autofagia 6 chaperona-mediada. Gotículas lipídicas interagir com outros organelos celulares, tais como as mitocôndrias (para beta-oxidação e a síntese de lípidos) e ER (para a síntese de lípidos e o tráfico de proteína), mas também com os lisossomas, endossomas, e os vacúolos induzidas por bactérias intracelulares 7. Com efeito bactérias, vírus, parasitas e mesmo alvo gotículas lipídicas para replicação e persistência, entre os quais o HCV 8.

Infecção pelo HCV é uma das principais causas de morbidade relacionada com o fígado e mortalidade no mundo, respondendo por cerca de 0,5 milhões de mortes por ano 9. O verdadeiro número de infecções por HCV é desconhecida, mas as estimativas recentes sugerem que 130 - 150 milhões de pessoas estão cronicamente infectadas. Sem vaccine existe, mas os antivirais de actuao directa recentemente aprovados aumentar dramaticamente a resposta terapêutica em comparação com a terapia à base de interferão padrão. No entanto, em todo o mundo, o tratamento de pacientes provavelmente será restrito devido aos custos extremamente elevados das novas terapias. Cerca de metade de todos os indivíduos cronicamente infectados com VHC desenvolvem a doença de fígado gordo (esteatose), uma condição caracterizada pela acumulação excessiva de gotículas lipídicas em hepatócitos. De forma intrigante, gotículas lipídicas também surgiu como organelos celulares vitais para a replicação do HCV, putativamente servir como locais de montagem virais 10, 11.

Em células infectadas com HCV, a proteína do núcleo virai e NS5A localizar de gotículas lipídicas em um processo de que depende a biossíntese de triglicéridos, como inibidores de diacilglicerol aciltransferase-1 (DGAT1) prejudicar o tráfico de gotículas lipídicas e subsequente produção de partículas de HCV 12 >, 13, 14, 15. Além disso, as mutações nos domínios de ligação de gotículas lipídicas de qualquer núcleo ou NS5A suprimir montagem de VHC 16, 17. Núcleo e, em seguida, NS5A recrutar todas as outras proteínas virais, bem como complexos de replicação do ARN viral, para as membranas estreitamente associadas com lípidos gotas 16. É necessária uma acção concertada de todas as proteínas virais para a produção bem sucedida de progenitura viral infecciosa 10, 11. As proteínas estruturais são parte dos viriões, e as proteínas não estruturais promovem as interacções proteína-proteína necessárias para este processo. Curiosamente, o bona fide lípido-proteína de ligação de gotículas PLIN3 / TIP47 é necessário para a replicação do ARN de HCV e a libertação de viriões de 18, 19 , 20. Apesar destes avanços recentes, os detalhes mecanísticos, especialmente das interacções vírus-hospedeiro durante as fases tardias da replicao do HCV, permanece mal definida, e a função precisa das gotículas lipídicas é desconhecido.

Aqui, descrevemos um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas. Utilizando este método, foram encontradas alterações profundas no proteoma gotícula de lípido, durante a infecção pelo HCV e identificado anexina A3 como uma proteína hospedeira que co-fracciona com gotículas lipídicas e é necessário para a maturação de HCV eficiente 21.

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Protocolo

1. Preparação de Meios para Stable Isótopos Etiquetagem com Aminoácidos em cultura celular (SILAC)

NOTA: Aqui, a quantificao Kit SILAC Proteína - DMEM suplementado com 50 mg de 13 C 6 L-Arginina-HCl foi utilizado para rotulagem SILAC. O dialisado Soro Fetal de Vitelo (FCS) é fornecido com o Kit de Quantificao SILAC proteína.

  1. Remover 50 mL de cada frasco de meio DMEM e adicionar 50 ml de FCS dialisado.
  2. Dissolve-se 50 mg de 13 C 6 L-Lisina-2HCl e 50 mg de 13 C 6 L-Arginina-HCl em 1 mL de meio. Misturar bem e adicionar os ácidos aminados ao meio DMEM + FCS.
  3. Adicionar 1x Pen / Strep e 1x substituto L-glutamina. Esterilizada por filtro do meio utilizando um filtro de 0,45. Rotular o frasco como meio SILAC "pesado".
  4. Para preparar o meio de "luz", repetir os passos 1,1-1,3 usando 50 mg de L-Arginina-HCl e 50 mg de L-Lisina-2HCl. Rotular o frasco como "luz" médio SILAC.

2. SILAC-rotulagem e Controlo de Aminoácidos Incorporação

  1. Tripsinizar as células (1x tripsina-EDTA) e de divisão de 1 x 10 5 células Huh7.5 em 2 pos de uma placa de cultura de 6 cavidades contendo 2 mL de meio, um poço com a forma SILAC "pesadas" e um com a "luz" meio SILAC.
  2. Cultura das células durante, pelo menos, 6 passagens (relação de divisão 1:: 6); depois de 6 passagens, a incorporação dos aminoácidos "pesadas" deve ser mais do que 95%.
  3. Colheita 1 x 10 6 culas do "pesado" - população celular marcado com e "luz" para analisar a eficácia de incorporação. Lavam-se as células em PBS 1x e peletizar as células por centrifugação durante 5 min a 160 xg e 4 ° C.
  4. Ressuspender as peletes de células em 150 uL de SM-tampão (150 mM de NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, e EDTA 1 mM suplementado com um cocktail inibidor de protease 1x) e incuba-se as células em gelo durante 30 min. Lyse o cells por ultra-sons a 4 ° C.
    NOTA: A seguir estão as configurações de sonicação usados ​​aqui: temporizador, segure; de controlo de saída, 8; ciclo de serviço, 80%; e 2 x 30 pulsos.
  5. Remover os resíduos celulares por centrifugação durante 10 min a 11000 xg e 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e determinar a concentração de proteínas com um ensaio de proteína compatíveis com detergentes.
  6. Misturar 75 ug de proteína com tampão de amostra de 6x (Tris-HCl a 375, pH 6,8, 25,8% de glicerol, 123 mg / ml de SDS, azul de 600 ug / bromofenol mL, e 60 uL / ​​mL β-mercaptoetanol), fervura em 95 ° C, durante 5 minutos, e separar as proteínas por SDS-PAGE em SDS tampão de corrida (3,02 g / base Tris, 18,8 g / l de glicina, e 1 g / L de DPS) a 180 V durante aproximadamente 1 h, ou de acordo com os fabricantes "instruções.
  7. Transferir o gel em solução coloidal coloração com Coomassie. Extirpar a mesma banda de proteína de cada pista. Digerir as proteínas com tripsina e analisar a eficácia de incorporação por MS analysis, tal como descrito 22.

3. Lipid gota Isolamento de células Huh7.5 marcado com SILAC

  1. Infectar uma população de células (por exemplo, os marcados com aminoácidos "leves"), com um virus repórter VHC por incubação com reservas de vírus (por exemplo, Jc1 NS5AB-mKO2-BSD, MOI 1) durante 4 h a 37 ° C, tal como descrito 21 .
    NOTA: Jc1 NS5AB-mKO2-BSD é um vírus HCV transportando um repórter fluorescência (monomérica Kusabira laranja 2, mKO2) para monitorizar as taxas de infecção, seguida por um gene de resistcia a blasticidina (DEB) entre um local de clivagem duplicado NS5A-NS5B, descrito anteriormente 21, 23. Trabalho com HCV requer BSL2 + (EUA) ou S3 ** (Alemanha) contenção e práticas em nível de biossegurança. Em vez de infecção com HCV, as células podem ser infectadas com diferentes agentes patogénicos.
  2. Expandir as células infectadas pelo HCV "light" e não infectados & #34;. As células pesadas", Durante a passagem das culturas, fixar-se uma alíquota com 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS e determinar as taxas de infecção de HCV por citometria de fluxo da proteína marcador fluorescente (por exemplo, mKO2), tal como descrito 21; a as taxas de infecção deve ser maior do que 90% de lípido gota isolamento. NOTA: Se usando o Jc1 NS5AB-mKO2-BSD estirpe de HCV, adicionam-se 10 ug / ml de blasticidina S para a forma "luz" para seleccionar as células-HCV positivo.
  3. 1 d antes do isolamento de gotículas de gordura, lava-se as células com PBS, trypsinize, ressuspender em "luz" e "pesados" médio, e contar as células utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Semente de 7 x 10 6 culas de cada população em uma placa de cultura de 150 centímetros 2 célula. Prepare pelo menos 5 pratos por população de células "light" e "pesado". Cultura das células em 30 mL de meio / placa S / N.
  4. Remover o meio e lava-se as células em PBS 1x. Separe as células em 1xPBS utilizando um raspador de células.
  5. Contagem de ambas as populações de células utilizando uma câmara de contagem de Neubauer e reunir os números de células iguais em um tubo de centrífuga de 50 mL. Sedimentar as células por centrifugação durante 5 min a 160 xg e 4 ° C.
  6. Remover o PBS e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de tampão de sacarose (sacarose 0,25 M, EDTA 1 mM, e DTT a 1 mM, suplementado com um cocktail inibidor de protease). Transferir a suspens celular para um homogeneizador de Dounce apertada e lisar as células com 200 batidas em gelo.
    NOTA: Confirme a lise celular completa utilizando a coloração azul de tripano.
  7. Transferir o lisado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e girar para baixo os núcleos e fragmentos de células durante 10 min a 1000 xg e 4 ° C.
  8. Após centrifugação, armazenar-se uma alíquota de 25 uL da fracção pós-nuclear (SNP) a -20 ° C como um controlo de entrada.
  9. Coloque o restante da fracção de PNS na parte inferior do tubo de centrifugação (11 x 60 mm) e sobrepor com tampão de lavagem de lípidos gota (~ 3 mL; 4 mL totai) (50 mM de tampão de fosfato de potássio pH 7,4, cloreto de potássio 100 mM, EDTA 1 mM e fluoreto de fenilmetano-sulfonilo 1 mM).
  10. Centrifugar durante 2 h a 100.000 xg e 4 ° C. Colher a fracção de gotículas de gordura flutuante usando um dobrado, cânula romba a partir do topo do tubo (aproximadamente 250-500 ml, dependendo da quantidade de gotículas lipídicas). Coloque a fracção de gotículas de gordura em um tubo de ensaio (11 x 60 mm), sobreposição com tampão de lavagem de lípidos gota (~ 3,5 mL; 4 mL no total), e repetir a etapa de centrifugação.
  11. Colher a fracção de gotículas de gordura flutuante usando um dobrado, cânula romba a partir do topo do tubo e transferir as gotículas lipídicas para um novo tubo de microcentruga de 1,5 mL. Adicionar 500 mL de tampão de lavagem de gotículas de gordura e centrifugação durante 20 min a 21000 xg e 4 ° C.
    NOTA: gotículas lipídicas aparecer como uma banda branca que flutua no topo do tampão.
  12. Remover o tampão de lavagem subjacente utilizando uma ponta de pipeta de carga do gel e repetir este passo de lavagem três vezes.
  13. Após a remoção final do tampão de lavagem utilizando uma ponta de pipeta de carregamento de gel, misturar 5 uL de fracções de gotículas lipídicas com 10 ul de NP-40 tampão de lise (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM e NP-40 a 1% , suplementado com um cocktail inibidor de protease). Incubar a amostra em gelo durante 1 hora para inactivar o vírus se trabalhar com material infeccioso. Determinar o nível de proteína com um ensaio de proteína de detergente-compatível; pelo menos 35 ug de proteína são necessárias para MS-análise.
  14. Armazenar as fracções de gotículas de lípidos, a -20 ° C.
  15. Mistura-se o volume correspondente da fracção de gotículas de gordura com 4x carga de corante. Incubar em gelo durante 1 hora para inactivar o vírus se trabalhar com material infeccioso. Ferver a 95 ° C durante 5 min.
  16. Separaram-se as proteínas utilizando SDS-PAGE de acordo com o protocolo dos fabricantes. Transferir o gel em solução coloidal coloração com Coomassie. Excisar todas as bandas de proteína a partir do gel. Depois da digestão tríptica no gel 24 </ Sup>, evapora-se as amostras e os dissolver em ácido fórmico a 0,1%. Analisar por LC-MS / MS.
    NOTA: Aqui, LC-MS / MS foram realizadas análises em um espectrômetro de massa Quadrupole-Time-of-Flight (Q-TOF) ou em uma armadilha Linear Quadrupole (LTQ) Orbitrap espectrômetro de massa. Ambos os instrumentos foram acoplados com uma ESI-fonte para um sistema de nano-UPLC. Análise dos dados e análises de LC-MS / MS no Q-TOF e no espectrómetro de massa Orbitrap foram realizadas como descrito 21, 22. Tome muito cuidado para não contaminar a amostra com queratina humana. Utilize sempre pontas de pipeta isentas de queratina e tubos. Preparar tampões sob a câmara de fluxo laminar com produtos químicos isentos de queratina. Antes da utilização, limpar todas as superfícies e dispositivos com água destilada e etanol. Use sempre luvas e uma bata de laboratório.

4. Análise of Lipid Gota Pureza

  1. Dilui-se alíquotas de fracções de lípidos de gotículas 1: 2 e as fracções de entrada (ver passo 3.9) 01:10 com NP-40 a Lysé tampão. Incubar as amostras sobre gelo durante 1 hora para inactivar o vírus se trabalhar com material infeccioso. Determinar o nível de proteína com um ensaio de proteína compatíveis com detergentes.
  2. Misture quantidades iguais de proteína com tampão de amostra de 6x e incuba-se as amostras em gelo durante 1 hora para inactivar o vírus se trabalhar com material infeccioso. Prosseguir com SDS-PAGE e transferência das proteínas para uma membrana de nitrocelulose por blotting tanque a 80 V durante 90 min.
    NOTA: Depois de bloquear a membrana em tamp de bloqueio (5% seca-se leite magro em pó em TBS-T (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM de NaCl, e 0,05% de Tween 20)), incubar com anticorpos dirigidos contra marcadores de gotículas de gordura (por exemplo, , PLIN1, PLIN2, ou PLIN3) e os marcadores de outros compartimentos subcelulares (por exemplo, Calr, MnSOD, ou tubulina), seguido por anticorpos acoplados a HRP secundário. Use de quimiluminescência para a detecção de proteínas.

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Resultados

gotículas lipídicas são vitais para a infecção por HCV, como os locais putativos de montagem do virião, mas os mecanismos moleculares da morfogénese e saída de viriões são em grande parte desconhecida. Para identificar os factores de dependência hospedeiro novos envolvidos neste processo, foi realizada a análise do proteoma de gotículas de gordura quantitativa de células infectadas com HCV 21 (Figura 1A). Foi estabelecido um protocolo para a purif...

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Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo para isolar gotículas lipídicas para análise quantitativa do proteoma gotícula de lípido para comparar o enriquecimento e empobrecimento de proteínas associadas com gotículas lipídicas sob diversas condições de cultura, tais como infecções virais. Como um método alternativo, a análise do proteoma pode ser realizada com quantificações, livre de marcador com base no total de intensidades de pico. Este método não tem nenhuma limitação da gama dinâmica e evita problemas metabólicos. A vantagem...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos R. Bartenschlager (Universidade de Heidelberg) para as construções JC1, CM Rice (Universidade Rockefeller) para as células Huh7.5, J. McLauchlan (Virologia Unidade Medical Research Council) para o JFH1 construir, T. Wakita (Instituto Nacional de Doenças infecciosas, Japão) para o JFH1 e B. Webster e WC Greene (Instituto Gladstone de Virologia e Imunologia) para as construções repórter HCVcc. Este trabalho foi apoiado por fundos da DFG (HE 6889 / 01/02 (EH), INST 337 / 15-1 2013, e INST 337 / 16-1 2013 (SH)). O Instituto Heinrich Pette, do Instituto Leibniz para Experimental Virologia é apoiado pela Cidade Livre e Hanseática de Hamburgo e do Ministério Federal da Saúde. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de Quantificação de Proteínas SILAC - DMEMThermo Fisher89983 
13C6 L-Arginina-HCl 50  mgThermo Fisher88210
Roti-Load 1Roth GmbHK929.1
Roti-Blue 5x ConcentradoRoth GmbHA152.2 
10x SDS-Tris-Glicina - TampãoGeyer Th. GmbH & Co.KG A1415,0250 
GlutaMAX (100x)Life Technologies GmbH;350500038 
Solução de Penicilina/Estreptomicina para Cultura de CélulasSigma-Aldrich Chemie GmbH P4333-100ml 
DPBS 1x Solução salina tamponada com fosfato da DulbeccoSigma-Aldrich Chemie GmbH D8537 
Tripsina-EDTASigma-Aldrich Chemie GmbH T3924-100ML 
Cloreto de Sódio BioChemicaAppliChem GmbHA1149,1000
Tris Ultrapure   AppliChem GmbHA1086,5000A 
EDTA BioChemicaAppliChem GmbHA1103,0250
Inibidor de Protease Coquetel 5 mLSigma-Aldrich Chemie GmbH P8340-5ML 
D(+)-Sacarose BioChemicaAppliChem GmbHA3935,1000
Ácido clorídrico (HCl) 37% puro Ph. Eur., NFAppliChem GmbHA0625
DC Protein Assay Bio-Rad Laboratoris GmbH 500-0116 
GlycerolAppliChem GmbH151339
SDS UltrapureAppliChem GmbHA1112
Azul de bromofenolAppliChem GmbHA2331
β-Mercaptoetanol AppliChem GmbHA4338
BlasticidinaInvivogenant-bl-1 
Cloreto de potássioAppliChem GmbHA1039
Fluoreto de Fenilmetanossulfonil AppliChem GmbHA0999
Fosfato de Potássio MonobásicoSigma-Aldrich Chemie GmbH 
Hidrogenofosfato DipotássicoSigma-Aldrich Chemie GmbH Pág. 3786 
DTT AppliChem GmbHA2948
NP-40AppliChemA1694
TWEEN 20AppliChemA4974
Leite em pó desnatadoAppliChemA0830
Anti-ADFP/ ADRP abcamab52355
M6PRB1/TIP47 100 µ gabcamab47639
Calreticulina, pAb 200 µ gEnzo Life Science GmbH;ADI-SPA-600-F 
Anti-β-Tubulina Sigma-Aldrich Chemie GmbH T6074 200µ l  
Etanol absoluto (EtOH)Geyer Th. GmbH & Co.KG A3678,0250  
Anti-MnSODEnzo Life Science GmbHADI-SOD-110-F
Anti-rato HRPThermo Fisher Pierce32430
Anti-coelho HRPThermo Fisher  Pierce32460
Amersham Hiperfilme ECLGE Healthcare28906836
Lumi-Light Western Blotting SubstrateSigma-Aldrich Chemie GmbH 
Placa de Cultura de Células de 96 PoçosGreiner Bio-One GmbH 655 180 
Seringa Terumo 1 mLTerumoSS-01T
Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 µ m SARSTEDT 83.1823.100 
Géis Pré-moldados Mini-PROTEAN TGX, Qualquer gel de resolução kDBio-Rad Laboratoris GmbH 456-9034 
Placa de Cultura de Células de 6 PoçosGreiner Bio-One GmbH 657160 
Pratos Nunclon 150/20 Fisher Scientific GmbH10098720 - 168381 
Raspador de célulasneoLab Migge GmbH C-8120 
Tubo, 50 mLGreiner Bio-One GmbH 227261 
Tubo SafeSeal livre de RNase SARSTEDT 72.706.400 
Tubos de Centrífuga Ultra Clear 11 x 60 mmBeckman Coulter GmbH 344062 
Agulhas de SucçãoTranscodent6482
Biosphere Fil. Ponta 1000 SARSTEDT 70.762.211 
Biosfera Fil. Ponta 200SARSTEDT 70.760.211 
Biosfera Fil. Dica 10SARSTEDT 70.1130.210 
Moedor de Tecidos DounceFisher Scientific GmbH 
Pilões Para Moedores de Tecido Todo em Vidro DounceFisher Scientific GmbH 
Orbitrap Fusion
Branson Sonifier 450
Thermomixer comfort, com Thermoblock 1.5 mLEppendorf5355  000.127
Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module e PowerPac Basic Power Supply, BioRad165-8033
Mini-PROTEAN 3 Câmara Multi-FundiçãoBioRad165-4110
PowerPac HCBiorad164-5052
 Centrífuga Eppendorf5424R
 Eppendorf5424
Optima L-90KBeckman Coulter GmbH 365670
SW 60 Ti RotorBeckman Coulter GmbH 
Infinite M1000 PROTecan
221309120151960011188372210389444 Fonte de Alimentação Centrífuga 335649

Referências

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