Artigo de método

Usando transmissão óptica extraordinária para quantificar biomarcadores cardíacos no soro humano

DOI:

10.3791/55597

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13 de dezembro de 2017

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1NUS Nanoscience and Nanotechnology Initiative, National University of Singapore, 2Cardiovascular Research Institute, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Department of Electrical and Computer Engineering, National University of Singapore, 4Institute of Materials Research Engineering, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research)

Neste artigo

Resumo

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Este trabalho descreve um método de litografia de nanoimprinting para fabricar matrizes de sensoriamento de alta qualidade que funcionam no princípio de transmissão óptica extraordinária. O biosensor é de baixo custo, robusto e fácil de usar e pode detectar troponina cardíaca eu no soro em concentrações clinicamente relevantes (99th percentil corte ∼10-400 pg/mL, dependendo do ensaio).

Resumo

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Uma plataforma de biosensing ter relevância clínica em configurações de point-of-care (POC), ensaio de sensibilidade, reprodutibilidade e capacidade de monitorar confiantemente analitos no contexto de soro humano são cruciais.

Litografia de Nanoimprinting (NIL) foi usada para fabricar, a um custo baixo, sensoriamento áreas tão grandes quanto 1,5 x 1,5 mm. A superfície de detecção foi feita de matrizes de alta-fidelidade de nanoholes, cada um com uma área de cerca de 140 nm2. A grande reprodutibilidade de NIL tornou possível empregar uma estratégia de um chip, um-medição em 12 superfícies fabricadas individualmente, com variação mínima de chip-a-chip. Esses chips de ressonância (LECC) de plasmon de superfície nanoimprinted localizada foram testados extensivamente em sua capacidade de medir confiavelmente um bioanalyte em concentrações variando entre 2,5 e 75 ng/mL em meio de fundo de um complexo biofluid-neste soro humano, caso. A alta fidelidade de NIL permite a geração de grandes áreas de sensoriamento, que por sua vez, elimina a necessidade de um microscópio, como este biosensor pode ser facilmente ligado com uma fonte de luz de laboratório comumente disponíveis. Estes biosensores podem detectar troponina cardíaca no soro, com uma alta sensibilidade, com um limite de detecção (LOD) de 0,55 ng/mL, que é clinicamente relevante. Eles também mostram baixa variação de chip-a-chip (devido a alta qualidade do processo de fabricação). Os resultados são comensuráveis com ensaio imunoenzimático amplamente utilizado (ELISA)-com base em ensaios, mas a técnica mantém as vantagens de uma plataforma sensoriamento LECC-based (ou seja, acessibilidade a miniaturização e multiplexação, tornando-se mais viável para aplicações de POC).

Introdução

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Sensores químicos baseados em matrizes de nanohole tem sido objecto de numerosas investigações desde o primeiro relatório sobre transmissão óptica extraordinária (EOT) foi publicado por Ebbesen et al . em 19981. Quando a luz colide com as matrizes periódicas de nanohole estruturas de dimensões de comprimento de onda secundário, reforçada a transmissão ocorre em comprimentos de onda específicos. Isso ocorre quando a luz incidente casais com Bloch-onda de superfície polariton (BW-SPP) e/ou localizadas plasmons de superfície (LSP)2.

O princípio físico subjacente explorado quando biosensing com tais matrizes periódicas é simples. Adsorção de moléculas sobre ou perto da interface de metal muda a constante dielétrica do meio em contato com o metal, por sua vez, mudando a localização das bandas no espectro de transmissão. O espectro em si pode ser ajustado por nano-engenharia da forma, tamanho e separação distância3,4,5. Por design, sensores com base em EOT têm bandas características em seus espectros que facilitam tarefas específicas6,7,8 durante a investigação de eventos de ligação molecular. Esta é uma vantagem crucial sobre plataformas de ressonância (SPR) de plasmon de superfície disponível comercialmente.

Sensores usando EOT normalmente envolvem uma fonte de luz alinhada opticamente tal que um feixe colimado é incidente na superfície de sensoriamento. Técnicas para gerar nanohole grandes superfícies, tais como modelos de co-polímero e interferência e nanosphere litografia, tem pobre reprodutibilidade9. Devido a essas limitações na fabricação com precisão as grandes superfícies que mostram o fenômeno EOT, microscópio óptico era necessário para posicionar corretamente a fonte de luz e o detector. Para simplificar a técnica, litografia de alta qualidade nanoimprinting (NIL)10 foi empregado. Isso possibilitou a produção de sensor de grandes áreas de superfície11 (mm-escala), eliminando a necessidade de um microscópio procurar a superfície de detecção em um chip. Em vez disso, este sensor pode facilmente ser interfaceado com um padrão de fibra óptica cabo.

Desde que os picos de transmissão para essa matriz de nanohole estão contidos no visível a região do infravermelho próximo (NIR), é perfeitamente adequado para detecção de eventos de ligação de biomoléculas em um ambiente aquoso. O comportamento esperado de óptico da matriz nanohole foi simulado. O resultado foi verificado através de estudos com líquidos de padrão índices de refração (RI). Esta matriz foi então usada para medir a concentração de troponina cardíaca I (cTnI) em segundo plano complexo de soro humano. cTnI é clínico padrão-ouro para o diagnóstico de infarto agudo do miocárdio.

Usando este sensor, é possível detectar e quantificar a cTnI no soro humano em um limite de detecção (LOD) de 0,55 ng/mL, que é clinicamente relevante. A detecção é muito mais rápida do que o mais comumente utilizado tecnologia neste domínio, ensaio imunoenzimático (ELISA). Além disso, a superfície de detecção pode facilmente ser regenerada e, por conseguinte, reutilizados. Portanto, este trabalho demonstra a promessa de matrizes de nanohole como tecnologia viável (POC) point-of-care para biosensing dentro do complexo biofluids.

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Protocolo

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1. a fabricação do Sensor e aquisição dos dados

  1. Preparação do molde de níquel
    1. Casaco um 220 nm-grossa camada de feixe de elétrons negativos resistir até uma bolacha de 600 µm de espessura 4-em silicone. Escreva a matriz nanohole projetado nesta bolacha usando um sistema de litografia de feixe de elétrons.
      1. Para acelerar o feixe e a escrever, escrever os padrões com uma baixa dotmap (N) de 20k para cada tamanho de campo 300 µm (A) (ou seja, lá são 0,4 bilhões pontos mapeados em cada área de2 300 µm, e cada ponto será também exposto pelo e-feixe ou não dependendo do projeto do teste padrão). Definir a dose de exposição de resistir e-feixe para a resistir a 110 µC cm− 2 e escrever em uma corrente (I) de 800 PA.
        Nota: Por escrito e-feixe, a dose de exposição (D) é controlada pelo tempo de exposição para cada ponto (Tponto), calculado pela figure-protocol-1 . Da dose de exposição em 110 µC cm− 2, o tempo de moradia e-feixe em cada ponto exposto é de 0,5 µs12. Desde que a matriz capta uma área de 1,8 mm2, há um total de 36 patches de áreas de campo de2 300 µm costuradas juntos para uma matriz de nanohole grande, ouro formulário.
    2. Desenvolver a resistir imergindo a bolacha de silicone de 4 polegadas na solução de desenvolvedor para 10 s e deixando a bolacha secar no ar.
    3. Deposite uma camada de sementes de um metal, como níquel, cobre ou alumínio, o wafer de silício.
    4. Galvaniza a bolacha em um sistema em um banho de sulfamate de níquel. Realize a galvanoplastia em duas etapas. Na primeira etapa, 95min duradoura, usar uma densidade de corrente de 0,7 A dm− 2; Isso preenche completamente o nanopatterns com níquel. Na segunda etapa, duração 125 min, use 12 A dm− 2 para chegar a 300 µm como a espessura do molde final níquel (20 nm). Certifique-se de que o valor de pH é em 3,5-3,8 e que a temperatura está a 52-54 ° C.
    5. Separe o molde de níquel o substrato de silício, aplicando uma força mecânica suave. Mergulhe o molde de níquel em cerca de 100 mL de reagente positivo fotorresiste remoção durante a noite para lavar o resíduo de resistir o e-feixe.
    6. Alimentar o molde de níquel em um forno e seca-a 100 ° C por 3 h. limpá-lo em um plasma gravura sistema com gás de2 O no sccm 10 e 100 W por 3 min.
  2. Fabricação do ouro nanostructure
    1. Casaco de 150 µ l de heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl triclorosilano (FDTS) sobre o molde de níquel em um self-assembly máquina de revestimento monocamada (SAM) a 80 ° C.
      Nota: Isto irá formar uma camada de anti-adesiva, que permitirá a separação do molde do fotorresiste ("desmoldagem") após a conclusão da etapa de nanoimprinting. O tempo de vaporização deve ser 180 s e o tempo de reação devem ser 900 s.
    2. Imprimi o nanopatterns em um 4 - em vidro bolacha que foi revestida com uma camada de espessura nm 300 de foto-curável NIL resistir usando um nano-impressora a uma pressão de 10 bar e temperatura de 40 ° C por 10 min.
    3. Transferir o molde, o fotorresiste e a bolacha de vidro para uma luz de UV curar o sistema e photocure com 75 mW cm-2 de exposição aos raios UV por 30 s.
      Nota: Se todos os passos foram seguidos corretamente, o molde de níquel deve facilmente ser desenformado do fotorresiste.
    4. Em um íon reativo gravura sistema (RIE), executar um ataque ácido em branco do fotorresiste sobre o substrato de vidro, com um fluxo de gás de2 O do sccm 10, 50 W para 2 s para expor o vidro nas áreas recuados.
    5. Deposite uma 5 nm de espessura camada de cromo (Cr) para a adesão de metal e uma camada de 100 nm de ouro (Au), para o sensor plasmônico da pastilha de vidro em uma máquina de deposição de feixe de elétrons. Usar uma taxa de deposição de 1 Å s− 1 para Cr e 2 Å s− 1 para Au.
    6. Realizar lançamento do fotorresiste por plasma de2 O condicionamento por 3 min, seguido por uma etapa de sonorização 15-s em acetona.
    7. Dados da amostra em fichas de 5 × 5 mm. A matriz de nanohole vai ocupar o central 2 mm × 2 milímetros do chip.
  3. Aquisição dos dados
    1. Configure o aparelho para fazer as medições ópticas, tal que um feixe de luz branca saindo através da extremidade da fibra óptica transmissor é colimado e é incidente na superfície do sensor (matriz nanohole) em 90°.
      Nota: Luz é transmitida através da matriz de todo nanohole.
    2. Coletar o sinal transmitido com a fibra óptica do receptor e gravá-la com um espectrômetro UV-visível, operando dentro da faixa de 300 a 1.000 nm.
    3. Defina o tempo de aquisição de cada quadro de 20 ms. média 100 frames para obter o espectro final para reduzir o ruído nas medições.
    4. Use software de plotagem para analisar os dados com base em picos de transmissão identificados anteriormente (usando um método baseado em Lorentz).

2. teste de sensibilidade do sensor Bulk

  1. Deposite o líquido padrão do RI para a célula de líquido, com o RI varia de 1,31 a 1.39.
  2. Mergulhe o chip do sensor no líquido padrão do RI e alinhá-lo com o feixe de luz branca. Obter o espectro de transmissão.
  3. Limpe o chip sensor após cada medição com um reagente de limpeza tensoactivos e secá-lo com gás nitrogênio.

3. sensor modificação da superfície

  1. Antes de qualquer modificação química, limpe os chips sensores por imersão sequencial em isopropanol, acetona e água deionizada. Seco à temperatura ambiente em um fluxo de gás nitrogênio seco.
  2. Incube os chips sensores em uma solução etanólica de 0,4 mM 10-carboxi-1-decanethiol e 1,6 mM 1-octanethiol para 12 h à temperatura ambiente.
    Nota: Isto irá formar uma amina-reativa Self-assembly monolayer (SAM).
  3. Use álcool etílico para enxaguar e secar à temperatura ambiente.
  4. Faça uma mistura de 75mm sulfo-N-Hidroxisuccinimida (sulfo-NHS) e 15 mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimida (EDC). Mergulhe as fichas nesta mistura durante 15 min.
    Nota: Isto irá activar o grupo carboxílico do SAM.
  5. Local 50 µ l de solução de anticorpo antitroponina 200 µ g/mL em um tampão de acetato pH 4.5 na superfície do sensor e incube por 30 min.
  6. Desative os ésteres não tenha reagidos, imergindo o chip sensor em solução de etanolamina-HCl 1 M por 15 min.
  7. Enxágue o chip com água desionizada e seque-o em um fluxo de gás nitrogênio seco à temperatura ambiente.

4. ensaio de cTnI

  1. Bloquear qualquer inespecificas por manchar a 100 µ l de solução de albumina de soro bovino (BSA) 1% para a superfície.
Incube durante 15 min.
  • Enxágue os chips sensores três vezes em tampão fosfato de solução fisiológica (PBS). Inserir o chip para a célula de medição para gravar o espectro de transmissão.
    Nota: Este é o espectro de referência.
  • Local 50 µ l de cTnI padrão para a superfície do chip e incubar em um ambiente úmido durante 30 min.
  • Enxágue os chips sensores três vezes em solução de PBS e inseri-lo na célula de medição para gravar o espectro de transmissão.
    Nota: Este é o espectro depois da ligação.
  • Mergulhe os chips em glicina 50mm-HCl (pH 2) por 1 min e depois enxaguar em solução de PBS três vezes para regenerar a superfície do chip. Medir o espectro de transmissão na PBS para verificar o sucesso da etapa de regeneração.

    • 5. superfície Plasmon ressonância (SPR) medição

    1. Execute o chip de sensor SPR multiplexado no sistema SPR com tampão PBS-T.
      Nota: A composição do tampão PBS-T é at-fosfato de 20 mM, 150 mM NaCl e 0,05% Tween 20. O pH é de 7,4.
    2. Usar padrão de cTnI e o anticorpo, conforme descrito na etapa 4.
    3. Ative 3 das 6 canais disponíveis com uma mistura de EDC (0,2 M) e sulfo-NHS (0,05 M) 5 min. realizar uma injeção de 5 min de 50 anticorpo µ g/mL 560 e uma injeção de 5 min de solução de etanolamina-HCl 1 M.
    4. Gire o chip sensor de 90º e injetar os cTnI padrões em diferentes concentrações (75, 30, 7.5 e 2,5 ng/mL).
    5. Observe a conjugação ao anticorpo em pontos de interação no chip em tempo real através da leitura do SPR.
    6. Regenere o chip injetando glicina 50mm-HCl (pH 2) por 1 min.

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    Resultados

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    A configuração óptica durante a medição é mostrada na figura 1A. Uma imagem da matriz real nanohole é dada na figura 1B. Para compreender a física de condução do processo de detecção, o software de simulação de COMSOL foi usado para simular a distribuição do campo plasmônico em um ambiente aquoso. Os resultados da simulação então estavam relacionados com a medição real. Um estudo publicado anteriormente contém detalhes sobre as s...

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    Discussão

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    Simulando a interação entre a luz incidente e as nanoestruturas torna possível identificar o pico apropriado (no espectro de transmissão), cujo turno pode ser gravado como uma função da concentração do analito. É importante notar que a localização das bandas com relação a estrutura do sensor é crucial para a escolha da banda direita, cuja mudança pode ser rastreada para sentir o analito. A visualização pode ser conseguida através de simulações. Isto também é fundamental para a concepção de uma estrutura ideal que permite...

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    Divulgações

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    Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes.

    Agradecimentos

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    AP reconhece o apoio do Prof T Venkatesan, diretor, NUS nanociência e nanotecnologia iniciativa e escritório do presidente adjunto (Universidade Nacional de Cingapura) (R-398-000-084-646). CID reconhece o apoio de Singapura Ministério de saúde médica Conselho de pesquisa nacional sob seu médico cientista regime de financiamento, NMRC/CSA/035/2012 e a Universidade Nacional de Cingapura. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

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    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    Configuração de Litografia por Feixe de ElétronsElionix ELS 700
    o-XilenoSigma Aldrich95662
    EB resistSumitomoNEB-22A2
    Reagente reveladorShipley CompanyMicroposit MF 321
    Máquina de GalvanoplastiaTechnotrans AG RD 50
    Stripper fotorresistente Rohm and Haas Electronic Materials  LLCMicroposit Remover 1165
    Sistema de GravaçãoTrion Phantom
    Heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrodecil)triclorossilano Gelest (PA, EUA)78560-44-8
    Revestidor SAM Sorona Inc.AVC 150M
    foto-curável NIL resistmicro resist technology GmbHmr-UVCur21-300nm
    Sistema de fotopolimerizaçãoDymax inundação
    Denton Explorer
    espectrômetro UV-visível Ocean optic HR2000+ (Dunedin, FL, EUA)
    Líquidos de índice de refração padrão Cargill Inc (Cedar Grove, EUA)18032
    Software de plotagemOriginOrigin Pro 9
    10-carboxi-1-decanethiol Dojindo Laboratories (Japão)C385-10
    1-octanetiolSigma-Aldrich, MO, EUA471386
    Sulfo-N-hidroxisuccinimida e 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida BioRad (CA, EUA)1762410
    Anticorpo anti-troponina 560Hytest (Finlândia)4T21
    Solução de etanolamina-HClBioRad (CA, EUA)1762450
    Configuração de ressonância plasmônica de superfícieBioRad XPR36 (Haifa, Israel)
    Chip SPR multiplexadoBioRadGLC
    Humano cTnI padrãoPhoenix Produtos farmacêuticosEK -311-05
    Glicina-HClBioRad (CA, EUA)1762221
    Máquina de deposição de feixe de modelo 2000

    Referências

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Ebbesen, T. W., Lezec, H. J., Ghaemi, H., Thio, T., Wolff, P. Extraordinary optical transmission through sub-wavelength hole arrays. Nature. 391 (6668), 667-669 (1998).
    2. Krishnan, A., et al. Evanescently coupled resonance in surface plasmon enhanced transmission. Optics Comm. 200 (1), 1-7 (2001).
    3. Yang, J. -C., et al. Enhanced optical transmission mediated by localized plasmons in anisotropic, three-dimensional nanohole arrays. Nano letters. 10 (8), 3173-3178 (2010).
    4. Kim, J. H., Moyer, P. J. Transmission characteristics of metallic equilateral triangular nanohole arrays. Appl Phys Lett. 89 (12), 121106(2006).
    5. Liu, H., Lalanne, P. Microscopic theory of the extraordinary optical transmission. Nature. 452 (7188), 728-731 (2008).
    6. Shon, Y. -S., Choi, H. Y., Guerrero, M. S., Kwon, C. Preparation of nanostructured film arrays for transmission localized surface plasmon sensing. Plasmonics. 4 (2), 95-105 (2009).
    7. Xiang, G., Zhang, N., Zhou, X. Localized surface plasmon resonance biosensing with large area of gold nanoholes fabricated by nanosphere lithography. Nanoscale Res Lett. 5 (5), 818(2010).
    8. Valsecchi, C., Brolo, A. G. Periodic metallic nanostructures as plasmonic chemical sensors. Langmuir. 29 (19), 5638-5649 (2013).
    9. Gates, B. D., et al. New approaches to nanofabrication: molding, printing, and other techniques. Chem Rev. 105 (4), 1171-1196 (2005).
    10. Guo, L. J. Nanoimprint lithography: methods and material requirements. Adv Mater. 19 (4), 495-513 (2007).
    11. Wong, T. I., et al. High throughput and high yield nanofabrication of precisely designed gold nanohole arrays for fluorescence enhanced detection of biomarkers. Lab on a Chip. 13 (12), 2405-2413 (2013).
    12. Deng, J., Wong, T. I., Sun, L. L., Quan, C., Zhou, X. Acceleration of e-beam lithography by minimized resist exposure for large scale nanofabrication. Microelect Eng. 166, 31-38 (2016).
    13. Wu, L., Bai, P., Li, E. P. Designing surface plasmon resonance of subwavelength hole arrays by studying absorption. JOSA B. 29 (4), 521-528 (2012).
    14. Ding, T., et al. Quantification of a cardiac biomarker in human serum using extraordinary optical transmission (EOT). PloS one. 10 (3), 0120974(2015).
    15. Im, H., Sutherland, J. N., Maynard, J. A., Oh, S. -H. Nanohole-based surface plasmon resonance instruments with improved spectral resolution quantify a broad range of antibody-ligand binding kinetics. Anal Chem. 84 (4), 1941-1947 (2012).
    16. Bhagawati, M., You, C., Piehler, J. Quantitative real-time imaging of protein-protein interactions by LSPR detection with micropatterned gold nanoparticles. Anal Chem. 85 (20), 9564-9571 (2013).

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