Braçadeira de tensão Fluorometria em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos Usando Aminoácidos Fluorescentes Não-naturais

Resumo

Este artigo descreve um aumento da Fluorometria Voltagem-Clamp convencional (VCF) onde Fluorescente Aminoácidos Não-naturais (fUAA) são usados ​​em vez de corantes maleimida, para sondar rearranjos estruturais em canais iônicos. O procedimento inclui injeção de DNA de oócito de Xenopus , coinjeção de ARN / fUAA e medições simultâneas de corrente e fluorescência.

Resumo

A Fluorometria de Voltage-Clamp (VCF) tem sido a técnica de escolha para investigar a estrutura e função das proteínas de membrana eletrogênicas, onde as medidas em tempo real de fluorescência e correntes relatam simultaneamente rearranjos locais e função global, respectivamente. Enquanto que as técnicas estruturais de alta resolução, como a microscopia de crio-elétrons ou a cristalografia de raios-X, fornecem imagens estáticas das proteínas de interesse, o VCF fornece dados estruturais dinâmicos que nos permitem relacionar os rearranjos estruturais (fluorescência) com dados funcionais dinâmicos (eletrofisiologia). Até recentemente, a química tiol-reactiva utilizada para a marcação fluorescente dirigida ao local das proteínas restringia o âmbito da abordagem porque todas as cisteínas acessíveis, incluindo as endógenas, seriam rotuladas. Foi assim necessário construir proteínas isentas de cisteínas endógenas. A rotulagem também se restringiu a locais acessíveis a partir dolado. Isto mudou com o uso de Aminoácidos Não-naturais Fluorescentes (fUAA) para incorporar especificamente uma pequena sonda fluorescente em resposta à supressão do codão de paragem utilizando um par ortogonal de tRNA e tRNA sintetase ² . A melhoria do VCF requer apenas um procedimento de injeção de dois passos de injeção de DNA (par tRNA / sintetase) seguido por co-injeção de ARN / fUAA. Agora, a rotulagem tanto intracelular e locais enterrados é possível, eo uso de VCF se expandiu significativamente. A técnica VCF torna-se assim atraente para o estudo de uma vasta gama de proteínas e, mais importante, permite investigar numerosos mecanismos reguladores citosólicos.

Introdução

Mais de 200 aminoácidos não naturais de várias propriedades químicas e físicas foram geneticamente incorporados em proteínas em células de E. coli , leveduras e mamíferos ³ . O aminoácido não natural é incorporado em resposta a um codão de paragem específico através de um par tRNA / sintetase engendrado ortogonalmente. A abordagem genética para modificar proteínas forneceu insights valiosos sobre a estrutura ea função da proteína. Aqui, apresentamos um protocolo para o uso de Fluorometria de Voltagem-Clamp (VCF) em combinação com uma UAA fluorescente.

No VCF, a observação simultânea de dados funcionais e r....

Protocolo

As manipulações de rãs foram realizadas de acordo com as diretrizes canadenses e foram aprovadas pelo comitê de ética (CDEA, protocolo # 15-042) da Universidade de Montréal.

1. Preparação de mRNA para incorporação de fUAA

1. Escolha um local de interesse na proteína onde mudanças conformacionais são esperadas para ocorrer. Selecione um aminoácido nesta região para substituir o fUAA.
   NOTA: A escolha da posição baseia-se nos rearranjos estruturais esperados. Se existir uma estrutura de alta resolução e uma hipótese dos movimentos esperados, o anap deve ser colocado de modo que o ambiente químico altere; Isto pode ser uma muda....

Resultados

A Figura 4 mostra um exemplo de gravações de VCF obtidas a partir de um ovócito que expressa canais de Shaker com inactivação rápida removida (IR), L382stop-W434F na presença de pAnap e Anap. A mutação W434F bloqueia as correntes iônicas de potássio, o que torna possível medir os deslocamentos transitórios de carga de gating (correntes de gating). As gravações simultâneas das correntes de passagem (traçado superior) e das alterações de intensidade de fluorescência de Ana.......

Discussão

A aminoacilação in vivo de tRNAs que estão continuamente a ser transcritos em conjunto com a tRNA-sintetase, torna possível obter níveis de expressão elevados para medições de fluorescência. Para a incorporação eficiente de fUAA, é crítico que o pAnap seja corretamente injetado no núcleo. Devido à incerteza da localização exacta do núcleo, espera-se que 10-40% das injecções de ADN falhem, resultando em oócitos que não expressam (ou que expressam fugas). Portanto, é importante verificar a expressão na ausência d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solutions
solução de Barth
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	90 mM
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	3 mM
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-9397	0,82 mM
CaCl2	Sigma-Aldrich	C-7902	0,41 mM
Ca(NO3)2	Sigma-Aldrich	C-1396	0,33 mM
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	5 mM
NaOH hidrato	BDH	BDH7225-4	pH 7,6
Penicilina	Invitrogen	15140122	100 U/mL
Estreptomicina	Invitrogen	15140122	100 µ g/mL
de Kanamicina	Invitrogen	15160054	10 mg/100mL
de Soro de Cavalo (HS)	Invitrogen	16050122	5%
SOS Standard Oocyte Solution
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	102 mM
KCl	Sigma-Aldrich	746436	3 mM
MgCl2	Sigma-Aldrich	M9272	1 mM
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	5 mM
Solução de gravação externa
N-metil-D-glucamina (NMDG)	Alfa Aesar	L14282	115 mM
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	10 mM
Hidróxido de cálcio	Sigma-Aldrich	239232	2 mM
Hidrato MES	Sigma-Aldrich	258105	pH 7,2
Solução de registro interno
N-metil-D-glucamina (NMDG)	Alfa Aesar	L14282	115 mM
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	10 mM
Ácido Etilenodiamina Tetracético (EDTA)	Fisher Scientific	E478-500	2 mM
MES hidrato	Sigma-Aldrich	258105	pH 7.2
Solução de rotulagem
KOH	Fisher Scientific	P250-1	115 mM
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	10 mM
Hidróxido de cálcio	Sigma-Aldrich	239232	2 mM
MES hidrato	Sigma-Aldrich	258105	pH 7.2
TMR stock solution
Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR)	Molcular Probes da Life Technologies	T6027	5 mM em DMSO
solução de estoque Anap
Anap	ABZENA (TCRS)	Síntese personalizada TCRS-170	1 mM em água livre de nuclease e 1% NaOH 1 N
Nome<	strong>Empresa	Número de catálogo<	strong>Comentários
Material/Equipamento
pAnap	Addgene	48696
Braçadeira de oócitos de alto desempenho	Dagan Corporation	CA-1B
Gpatch Software	de aquisição Departamento de Anestesiologia, Universidade da Califórnia, Los Angeles
Software de análise	Departamento de Anestesiologia, Universidade da Califórnia, Los Angeles
Câmara de Gravação	usinado
	Dagan Corporation	PhotoMax-200/PIN
Driver de obturador elétrico	UNIBLITZ	VCM-D1

Sistema de detecção de diodo fotográfico personalizado