Artigo de método

Isolamento Simultâneo de Cardiomiócitos de Alta Qualidade, Células Endoteliais e Fibroblastos de um Coração de Rato Adulto

DOI:

10.3791/55601

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19 de maio de 2017

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1Internal Medicine, Cardiology and Angiology, University Hospital Giessen

Neste artigo

Resumo

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Vários protocolos foram desenvolvidos e descritos para o isolamento de diferentes tipos de células cardíacas a partir de um coração de rato. Aqui, descreve-se um protocolo otimizado que permite o isolamento de tipos de células cardíacas maiores (cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos) de alta qualidade de uma única preparação, reduzindo os custos experimentais.

Resumo

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O rato é um modelo animal importante utilizado na investigação cardiovascular e as células cardíacas de rato são utilizadas rotineiramente para a análise in vitro dos mecanismos moleculares da progressão da doença cardiovascular, tais como hipertrofia cardíaca, fibrose e aterosclerose. Embora tenham sido feitas várias tentativas com sucesso variável para desenvolver linhas celulares imortalizadas a partir do sistema cardiovascular para compreender estes mecanismos celulares, as células primárias oferecem um ambiente mais natural e próximo ao ambiente in vivo para tais estudos. Por conseguinte, diferentes laboratórios que trabalham num tipo de célula particular desenvolveram protocolos para isolar tipos individuais de células cardíacas de ratos de interesse. Um protocolo que permite o isolamento de mais de um tipo de célula, no entanto, está faltando. Aqui é descrito um protocolo otimizado que permite o isolamento de tipos de células cardíacas principais de alta qualidade (cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos) a partir de uma única preparação e permiteR para análises celulares. Isso permite o uso mais eficiente dos recursos disponíveis, o que pode economizar tempo e reduzir os custos de pesquisa.

Introdução

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Os modelos de roedores têm sido usados ​​há muito tempo como ferramentas para ampliar nossa compreensão da fisiologia cardiovascular na saúde e na doença. 1 Embora estes modelos animais nos permitam compreender a fisiopatologia de uma doença a nível de órgãos e analisar a farmacocinética e a farmacodinâmica de vários agentes farmacológicos utilizados no tratamento de doenças cardiovasculares, a compreensão dos mecanismos moleculares do desenvolvimento de doenças cardiovasculares ea contribuição de uma determinada doença Tipo celular requer o uso de modelos de cultura celular in vitro . Para este fim foram desenvolvidas diferentes linh....

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Protocolo

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A investigação está em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (NIH Publication No. 85-23 1985) e foi aprovado pelo comitê de ética local da Universidade de Giessen. Utilizaram-se ratos Wistar machos adultos pesando 200 - 250 g neste estudo.

1. Autoclavagem

  1. Pelo menos um dia antes do procedimento a ser realizado, autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, pontas de pipeta e pipetas Pasteur para ser usado no procedimento de isolamento a 121 ° C por 30 min.

2. Preparação de meios e soluções

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Resultados

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O procedimento de isolamento resulta num rendimento de 70 a 80% de cardiomiócitos estriados viáveis, em forma de bastonete ( Figuras 2A e 2C ) que podem ser utilizados para experiências planeadas. No nosso laboratório, os cardiomiócitos são rotineiramente utilizados para análise da sinalização de Ca 2+ . A Figura 5A ilustra as oscilações intracelulares de cálcio [Ca2 + ] i em resposta à isquemia .......

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Discussão

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Neste artigo, descreve-se um protocolo reprodutível para o isolamento e cultura de miócitos cardíacos, células endoteliais e fibroblastos. Este protocolo descreve o isolamento simultâneo e de alta qualidade dos principais tipos celulares de tecido cardíaco, isto é , cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos em oposição a apenas um tipo de célula. Um passo crítico no procedimento de isolamento é a digestão adequada do tecido cardíaco. Se a digestão estiver incompleta, ainda pode ser obtido um grande núm.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

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O apoio técnico de L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas e A. Weber é reconhecido com gratidão. Os autores também desejam agradecer Dr. E. Martinson para extensa leitura de prova e edição de linguagem do manuscrito. O estudo foi apoiado pela Universidade de Giessen Anschubsfinanzierung concessão a M. Aslam e D. Gündüz.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
anti-vWFSanta Cruz Biotech.SC-14014
Cloreto de cálcioMerck102378
CarnitinaSigma-AldrichC0283
Colagenase tipo IIWorthingtonLS004176
CreatinSigma-AldrichC0780
D-GlicoseMerck108342
Dil-Ac-LDLThermo ScientificL3484
Solução EDTA (0,2 M)Biochrome AGL2113
Solução de incorporaçãoCitiflourAF1-25
Meio de células endoteliais MV2PromoCellC-22022
Soro fetal de bezerro (FCS)Biochrome AGS0615
GentamicinServa Chemicals47991
HEPESSigma-AldrichH0887
IsofluranoAbbottTU 061219
Laminina Roche/Sigma11243217001
M199 meioThermo Scientific11150059
M199 médio (Pó)Biochrome AGT061
Sulfato de magnésioSigma-Aldrich63138
Anticorpo CD31 de camundongo anti-rato (TLD-3A12)Thermo ScientificMA1-81051
(0,9%), EstérilB. Braun
Grânulos IgG de camundongo Pan (Dynabeads)Thermo Scientific11041
Paraformaldeído (PFA) 4% SoluçãoSanta Cruz Biotech.sc-281692
Penicilina-EstreptomicinaThermo Scientific15070-063
Tampão fosfato salina (PBS) 1x PAN-BiotechP04-36500
Consumíveis de plásticoGreiner Bio-One
Cloreto de PotássioMerck4933
Di-hidrogenofosfato de potássioMerck7873
Cloreto de SódioMerck6404
Solução de Hidróxido de Sódio (2 N)Merck109136
Estéril sistema de filtragemThermo Scientific5660020
TaurinaSigma-AldrichT8691
TO-PROThermo ScientificT3605
Tripsina-EDTA Solução (10x)Sigma-AldrichT4174
Água, EstérilB. Braun
Solução de NaCl 30820080

Referências

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  1. Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841(2011).
  2. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristic....

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