Artigo de método

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

DOI:

10.3791/55623

⸱

13 de maio de 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences, University of Texas Health Science Center

Neste artigo

Resumo

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Um protocolo para experiências FRET de alta precisão no nível de molécula única é apresentado aqui. Adicionalmente, esta metodologia pode ser utilizada para identificar três estados conformacionais no domínio de ligação ao ligando do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar distâncias precisas é o primeiro passo para construir modelos estruturais baseados em experimentos FRET.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresenta-se aqui um protocolo sobre como realizar medições de distância de interdise de alta precisão usando a transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) no nível de molécula única no modo de detecção de fluorescência multiparâmetro (MFD). O MFD maximiza o uso de todas as "dimensões" da fluorescência para reduzir os artefatos fotofísicos e experimentais e permite a medição da distância interdye com uma precisão de até 1 Å em biomoléculas rígidas. Este m�odo foi utilizado para identificar tr� estados conformacionais do dom�io de liga�o ao ligando do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) para explicar a activa�o do receptor ap� liga�o ao ligando. Ao comparar as estruturas cristalográficas conhecidas com medidas experimentais, concordaram em menos de 3 Å para biomoléculas mais dinâmicas. Recolher um conjunto de restrições de distância que cobre toda a dimensionalidade das biomoléculas tornaria possível fornecer um modelo estrutural de biomolécula dinâmicaEs.

Introdução

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Um objetivo fundamental dos estudos de biologia estrutural é desvendar a relação entre a estrutura ea função das máquinas biomoleculares. A primeira impressão visual de biomoléculas ( por exemplo, proteínas e ácidos nucleicos) ocorreu na década de 1950 através do desenvolvimento de cristalografia de raios X 1 , 2 . A cristalografia de raios-X fornece informações estruturais estáticas de alta resolução restritas pela embalagem de cristal. Portanto, a imobilidade inerente dos modelos estruturais de raios X evita a natureza dinâmica das biomoléculas, um fator que afeta a maioria das funções biológicas 3 , 4 , 5 . A ressonância magnética nuclear (RMN) 6 , 7 , 8 proporcionou uma solução alternativa ao problema resolvendo modelos estruturais em soluções aquosas. Uma grande vantagemDe RMN é a sua capacidade de recuperar a natureza dinâmica intrínseca de biomoléculas e conjuntos conformacionais, o que ajuda a esclarecer as relações intrínsecas entre estrutura, dinâmica e função 3 , 4 , 5 . No entanto, a RMN, limitada pelo tamanho da amostra e grandes quantidades de amostra, requer estratégias de rotulagem complexas para sistemas maiores. Portanto, há uma necessidade premente de desenvolver métodos alternativos na biologia estrutural.

Historicamente, a transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) 9 não assumiu um papel importante na biologia estrutural devido ao equívoco de que o FRET fornece medições de distância de baixa precisão. O objetivo deste protocolo é revisar a capacidade do FRET de determinar distâncias na escala nanométrica, de tal forma que essas distâncias possam ser utilizadas na construção de modelos estruturais de biomoléculas. O primeiro verificador experimentalA dependência da dependência de R - 6 com a eficiência de FRET foi feita por Stryer em 196710, medindo poliprolinas de vários comprimentos como uma "régua espectroscópica". Um experimento semelhante foi realizado no nível de molécula única em 2005 11 . As moléculas de poliprolina revelaram-se não ideais e, assim, as moléculas de DNA de cadeia dupla foram utilizadas mais tarde 12 . Isto abriu a janela para medidas de distância precisas ea idéia de usar FRET para identificar propriedades estruturais de biomoléculas.

FRET é óptima quando a distância interdyte varia de ~ 0,6-1,3 R 0 , onde R 0 é a distância de Förster. Para os fluoróforos típicos utilizados em experiências FRET de molécula única, R0 é ~ 50 Å. Tipicamente, FRET oferece muitas vantagens sobre outros métodos na sua capacidade de resolver e diferenciar as estruturas e dinâmicas emHeterogêneos: (i) Devido à sensibilidade final da fluorescência, as experiências FRET de uma única molécula 13 , 14 , 15 , 16 podem resolver conjuntos heterogêneos contando diretamente e caracterizando simultaneamente as estruturas de seus membros individuais. (Ii) Vias de reação complexas podem ser decifradas diretamente em estudos FRET de molécula única, porque não é necessária sincronização de um conjunto. (Iii) FRET pode acessar uma ampla gama de domínios temporais que abrangem mais de 10 décadas no tempo, cobrindo uma ampla variedade de dinâmicas biologicamente relevantes. (Iv) Experiências de FRET podem ser realizadas em quaisquer condições de solução, in vitro e in vivo . A combinação de FRET com microscopia de fluorescência permite o estudo de estruturas moleculares e interações diretamente em células vivas 15 , 16 , Sup> 17 , 18 , 19 , mesmo com alta precisão 20 . (V) FRET pode ser aplicado a sistemas de praticamente qualquer tamanho ( por exemplo, oligómeros de poliprolina 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , transcriptase reversa de HIV 26 e ribossomas 27 ). (Vi) Finalmente, uma rede de distâncias que contém toda a dimensionalidade de biomoléculas poderia ser usada para derivar modelos estruturais de moléculas estáticas ou dinâmicas 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Portanto, a espectroscopia FRET de molécula única pode ser usada para derivar distâncias que são precisas o suficiente para serem usadas para modelagem estrutural restrita à distância 26 . Isto é possível tirando proveito da detecção de fluorescência multiparâmetro 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , que utiliza oito dimensões de informação de fluorescência ( isto é, espectro de excitação, espectro de fluorescência, anisotropia, tempo de vida de fluorescência, rendimento quântico de fluorescência, O tempo macroscópico, as intensidades de fluorescência e a distância entre fluoróforos) para proporcionar precisão e precisão de restrições de distância. Adicionalmente, a excitação intercalada pulsada (PIE) é combinada com MFD(PIE-MFD) 42 para monitorizar a fluorescência do receptor de excitação directo e para seleccionar eventos de molécula única resultantes de amostras contendo uma estequiometria de um dador para um aceitador de 1: 1. Uma configuração PIE-MFD típica usa laser de excitação intercalado de dois impulsos conectado a um corpo de microscópio confocal, onde a detecção de fótons é dividida em quatro canais diferentes em diferentes janelas espectrales e características de polarização. Mais detalhes podem ser encontrados na Figura 1 .

É importante notar que o FRET deve ser combinado com métodos computacionais para obter modelos estruturais de tipo atomístico que sejam consistentes com os resultados do FRET 26 , 30 . Não é o objetivo do presente protocolo examinar a metodologia associada para construir modelos estruturais com distâncias derivadas de FRET. No entanto, estas abordagens foram aplicadas em combinação com outras técnicas ( por exemplo, dispersão de raios-X de ângulo pequenoOu ressonância paramagnética eletrônica), dando origem ao campo da biologia estrutural integrativa 43 , 44 , 45 , 46 . O objetivo atual é abrir caminho para a FRET como ferramenta quantitativa na biologia estrutural. Como exemplo, esta metodologia foi utilizada para identificar três estados conformacionais no domínio de ligação ao ligando (LBD) do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). O objetivo final é superar as limitações acima mencionadas e trazer FRET entre os métodos integradores utilizados para a determinação estrutural de biomoléculas, proporcionando distâncias medidas com alta precisão.

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Protocolo

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1. Preparação de tampão de PBS e tratamento de câmara

NOTA: Use um revestimento de laboratório e luvas descartáveis ​​ao realizar experimentos químicos úmidos. Use proteção para os olhos quando alinhar o laser.

  1. Preparação tampão PBS
    1. Dissolver 4,5 g de Na2HPO4, 0,44 g de NaH2PO4 e 3,5 g de NaCl em 400 mL de água destilada. Assegurar um pH de 7,5 e esterilizar a solução por autoclave num ciclo de líquido durante 1 h (dependendo do sistema de autoclave).
    2. Tomar 15 mL da solução de PBS e misturá-la com 0,1 g de carvão. Filtrar a mistura usando um filtro de seringa normal de 20 mL com um tamanho de poro de 0,2 μm . Selar e armazenar o tampão PBS à temperatura ambiente.
  2. Microscópio câmara de tratamento de cobertura de vidro
    1. Adicionar 500 μL de água destilada e 5 μL de surfactante não-iónico polissorbato 20 (ver Lista de Materiais)Para um sistema de vidro de cobertura em câmara (consulte a lista de materiais) e misture bem. Deixe molho durante 30 min. Remover a solução de polissorbato 20 e lavar a câmara com água destilada duas vezes. Deixe secar.
      NOTA: A câmara está agora pronta a ser utilizada.

2. Preparação da amostra de ADN

OBSERVAÇÃO: Use as fitas de DNA rotuladas projetadas (veja a Lista de Materiais) para a criação de amostras padrão de ADN de cadeia dupla (dsDNA). Oligos projetados não devem ter corantes na extremidade de um polímero, a fim de evitar artefatos que podem comprometer a distância determinada. A sequência de DNA deve ser escolhida para se comportar como um corpo rígido.

  1. Adicionar 1,5 μL de uma cadeia de ADN marcada com dador e 4,5 μL de uma cadeia de ADN complementar (aceitável ou não marcada) num tubo de microcentrífuga e misturá-los com 24 μL de água livre de nuclease.
    NOTA: Dependendo da mistura dos oligonucleótidos seleccionados, serão geradas as seguintes amostras: não-FRET, loW-FRET, ou dsDNAs de alta FRET.
  2. Hibridizar o ADN utilizando um misturador térmico e o seguinte processo: 95 ° C durante 10 min, 90 ° C durante 10 min, 80 ° C durante 10 min, 70 ° C durante 10 min, 60 ° C durante 10 min, 50 ° C Durante 10 min, 40 ° C durante 10 min, 30 ° C durante 10 min, 20 ° C durante 10 min, 10 ° C durante 10 min e mantendo-se a 5 ° C.
    NOTA: Os padrões de dsDNA gerados podem ser mantidos em um freezer de -20 ° C para armazenamento de longo prazo ou podem ser usados ​​imediatamente.

3. Preparação de amostras de proteínas

Nota: Começando com ADN recombinante para a expressão da proteína de interesse em sistemas bacterianos, é possível mutar os resíduos a partir dos quais as distâncias devem ser medidas em cisteínas. Para isso, use técnicas padrão de mutagênese dirigida ao local 47 . Para facilitar a purificação da proteína, clonar o ADN recombinante e mutado num vector contendo um marcador de purificação ( por exemplo,Uma His-tag). Utilizou-se o domínio de ligação ao ligando da subunidade 1 de glutamato (LBD) do receptor ionotrópico de glutamato NMDA (GluN1) LBD ( isto é, NMDA GluN1 LBD clonado no vector pET-22b (+)).

  1. Expressão proteica
    1. Transforme o plasm�eo de ADN de constru�o no sistema de express� de escolha 48 .
      NOTA: Os passos seguintes pressupõem que a expressão de uma proteína solúvel é transformada em Escherichia coli . É também possível a purificação de, por exemplo, células de mamífero transfectadas 49 ou células de insecto transduzidas 50 , e podem ser encontradas pormenorizadas etapas em outros locais. Assegurar que a estirpe de E. coli seleccionada é apropriada para a proteína de interesse. Por exemplo, a expressão de proteínas que contêm pontes dissulfureto requer uma estirpe de células competentes com um compartimento intracelular menos redutor (ver a Lista de Materiais).
    2. Inocular um iniciador E. Coli utilizando uma ponta de pipeta estéril para recolher uma única colónia transformada 48 . Colocar em 100 mL de meio LB selectivo (ver lista de materiais) e deixar crescer a cultura durante a noite a 37 ° C.
    3. Prepare o caldo LB (veja a Lista de Materiais). Autoclave para esterilizar.
    4. Inocular culturas em grande escala de E. coli transformada adicionando a cultura durante a noite a 2 L de meio LB selectivo numa proporção de 1: 500.
    5. Durante as próximas horas, avalie o crescimento da cultura monitorizando as leituras de absorvância (Abs) da cultura a 600 nm, às vezes referida como a densidade óptica a 600 nm (OD 600 ), ou usando um medidor de densidade celular. Note que as leituras aumentam ao longo do tempo.
    6. Induzir a expressão da proteína com uma concentração final de 0,5 mM de isopropil-p-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) quando a cultura atinge uma DO600 de 0,7. Agitou-se E. coli induzida a 20 ° C durante 20-24 h.
    7. Após a indução da proteína, sedimentar a E. coli por centrifugação durante 20 min a 3000 xg e 4 ° C. Descartar o sobrenadante e armazenar o sedimento de E. coli contendo a proteína intracelular a -80 ° C até à sua utilização.
  2. Purificação de proteínas
    1. Lyse E. coli utilizando um método de lise de escolha ( por exemplo, sonicação, prensa francesa, cavitação com azoto, etc. ) 51 .
    2. Girar a membrana e detritos celulares por centrifugação do lisado durante 1 h a 185.000 xg e 4 ° C.
    3. Para uma proteína marcada com His, carregue o sobrenadante numa coluna de cromatografia de afinidade de metal imobilizada (IMAC), equilibrada, carregada com níquel, utilizando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) (ver Tabela de Materiais ) 52 .
      NOTA: tampão de equilíbrio para o NMDA GluN1 LBD: NaCl 200 mM, Tris 20 mM e Glicina 1 mM, pH 8. Tampão de eluição para NMDA GluN1 LBD: NaCl 200 mM, Tris 20 mM, Glicina 1 mM e Imidazole 400 mM, pH 8.
      1. Lavar a coluna IMAC com tampão contendo uma pequena quantidade (~ 12 mM) de imidazole.
      2. Eluir a proteína da coluna IMAC utilizando um gradiente linear de imidazole de 12 mM a 400 mM.
    4. Dializar a proteína durante a noite em tampão de equilíbrio sem imidazol 53 colocando o eluído do passo 3.2.3.2 no tubo de diálise e submergindo-o no tampão de equilíbrio sob agitação contínua durante 2-3 horas. Repita pelo menos mais uma vez.
      NOTA: Os passos 3.2.3-3.2.6 assumem a purificação de uma proteína marcada com His. Se purificar através de algum outro método, ajustar o protocolo em conformidade.
    5. Quantificar a quantidade de proteína tomando a absorvância a 280 nm da proteína dialisada e usando a Lei de Beer ( unidade de Absorção = ε L c , onde ε É o coeficiente de extinção (M -1 cm -1), Que pode ser obtido aqui 54 ; L é o comprimento do caminho da luz (cm); E c é a concentração de proteína (M)).
      NOTA: Est� dispon�eis v�ios ensaios de quantifica�o de prote�as, incluindo o ensaio de Bradford e o ensaio com �ido bicinchon�ico. Ambos fornecem resultados precisos.
  3. Rotulagem de proteínas
    1. Adicionam-se fluoróforos doadores (corante verde ciano maleimida) e aceitáveis ​​(corante vermelhos reactivos de maleimida) à proteína purificada a uma razão molar proteína: dador: aceitador 1: 1: 8.
    2. Incubar a proteína e a mistura de fluoróforo em gelo durante 30 min. São possíveis tempos de incubação mais longos.
    3. Embalar uma coluna de 0,5 mL de Ni-Nitrilotriacético (Ni-NTA) agarose (ver Lista de Materiais) e equilibrá-la utilizando o mesmo tampão de equilíbrio que no passo 3.2.3 enquanto a proteína está a incubar.
      NOTA: Manter a quantidade de proteína carregada de acordo com a capacidade de ligação da resina.
    4. Após os 30 minCuba�o, carregar a mistura de prote�a / fluor�oro na coluna preparada no passo 3.3.3 e purificar por fluxo de gravidade.
    5. Lavar o excesso de fluoróforo com 5 mL de tampão de equilíbrio.
    6. Eluir a proteína marcada por gravidade a partir da coluna quatro vezes com 0,5 mL de tampão de eluição. Uma vez que a proteína já foi purificada a partir de outras proteínas, não é necessário gradiente.
    7. Verificar cada eluato com um espectrómetro UV-Vis para identificar qual fracção contém a proteína marcada. Digitalizar a absorvância de 230-700 nm para poder assegurar que os picos de absorvância da proteína (280 nm) e cada fluoróforo (493 nm para o fluoróforo ciano-verde e 651 nm para o fluoróforo vermelho distante) são visíveis na Eluente.
      NOTA: Tipicamente, a proteína será eluída na fracção 2.
    8. Equilibrar uma coluna de dessalinização (ver Tabela de Materiais ) com PBS tratado com carvão (passo 1.1).
    9. Coloque a proteína marcada na coluna de dessalinização por fluxo de gravidade.
      NOTA: Manter a quantidade de proteína carregada de acordo com a capacidade da coluna de dessalinização seleccionada 55 .
    10. Eluir utilizando 3,5 mL de PBS tratado com carvão por fluxo de gravidade e recolher 0,5 mL de fracções do eluído.
    11. Utilizar um espectrómetro UV-Vis para varrer a absorvância de cada eluído de 230-700 nm para identificar qual fracção contém a proteína marcada.
      NOTA: Os passos 3.3.8-3.3.11 servem basicamente como um passo de troca de buffer. Outros protocolos que servem para este fim também são possíveis ( eg, diálise extensa). Alternativamente, pode-se ir direto para o passo 3.3.8 da etapa 3.3.2.

4. Medições Necessárias em Ensemble Condições (em Cuvete)

  1. Determinação da constante de Förster
    1. Scan f D , a emissão de fluorescência do fluoróforo (cps), num fluorímetro, excitando o doador a 15 nm para o seu comprimento de onda máximo de absorvência para obter o em completoEspectro de emissão. Monitorizar a emissão começando 5 nm após o comprimento de onda de excitação e terminando 150 nm mais tarde. Use as condições de ângulo mágico ajustando o polarizador de emissão para 54,7 ° E os polarizadores de excitação para 0 ° 56 .
      NOTA: Para o fluoróforo dador utilizado aqui, o Abs máximo ocorre a 490 nm; 475 nm é utilizado como o comprimento de onda de excitação, e a emissão de 480-650 nm é monitorizada. Para o aceitador, o Abs máximo ocorre a 645 nm; 630 nm é utilizado para o comprimento de onda de excitação, e a emissão de 635-735 nm é monitorizada.
    2. Use o fluorímetro para realizar uma varredura de excitação do fluoróforo aceitador (Abs A ) variando de 400-700 nm e usar condições de ângulo mágico ajustando o polarizador de emissão para 54,7 ° E os polarizadores de excitação para 0 ° 56 . Definir o monocromador de emissão para 15 nm após o comprimento de onda de emissão máxima. Normalize para o máximo de excitaçãoTação.
    3. Em tabelas publicadas, localize o coeficiente de extinção do aceitador, ε A (M -1 cm -1 ) 56 , ou valores de uso fornecidos pelo fabricante.
      NOTA: O valor publicado para o fluoróforo aceitador usado neste manuscrito é ε A647 = 270.000 cm -1 M -1 56 .
    4. Calcule a sobreposição espectral usando J = Σf D · (Abs A · ε A ) · λ 4 , onde f D , Abs A e ε A foram definidos acima de λ e é o comprimento de onda (nm). Use uma planilha para listar em colunas todos os valores dependentes do comprimento de onda obtidos nos passos 4.1.1-4.1.3. Alinhe-os de acordo com o comprimento de onda. Realizar a soma a partir do comprimento de onda mínimo da emissão do dador (λ min ) até ao comprimento de onda máximo da absorção do aceitadorE (Xmax).
    5. Calcula-se a constante de Förster (R o ) utilizando a seguinte fórmula R o 6 = 8,79 x 10 -5 · J · κ 2 · Φ F, D · n -4 , em que J é a sobreposição espectral previamente calculada no passo 4.1.4, K 2 É o fator de orientação, ΦF , D É o rendimento quântico de fluorescência do fluoróforo dador, e n é o índice de refracção do meio no qual o fluoróforo está situado.
      NOTA: Utilizar n = 1,33 (se for utilizado tampão aquoso) e κ 2 = 2/3.
    6. Localize o valor de rendimento quântico do fluoróforo dador (ΦF , D , Dependente do ambiente) em tabelas publicadas (ver Referência 57) e utilizar o valor da sobreposição espectral obtida no passo 4.1.4 para calcular o valor final da constante de Förster utilizando a equaçãoDo passo 4.1.5.
      NOTA: Se o rendimento quântico não estiver disponível, siga o passo 4.2, abaixo, para o calcular. Neste caso, use ΦF , D = 0,8, o que corresponde a uma vida útil do doador τD , r = 4,0 ns.
  2. Determinação do rendimento quântico de fluorescência
    Observação: O procedimento a seguir assume apenas quenching dinâmico. Para considerar a extinção estática, consulte a Referência 56. No entanto, os experimentos PIE-MFD também são úteis na determinação do rendimento quântico, mesmo no caso de extinção estática (ver os Resultados).
    1. Seleccione um fluoróforo de referência com perfis de absorção e de emissão semelhantes para os fluoróforos aceitadores e doadores para os quais o rendimento quântico (Φ r ) foi determinado.
      NOTA: Para o doador, Φ r = 0.8 e τ r = 4 ns, enquanto que para o aceitador, Φ r = 0.32 e τ r = 1.17 ns, WQue correspondem ao Φ r e τ r para o fluoróforo verde-ciano e oligonucleótidos rotulados com fluoróforo vermelho, respectivamente 57 .
    2. Medir a decomposição de fluorescência resolvida no tempo (f (t)) utilizando o método de contagem de um único fotão (TCSPC) correlacionado no tempo em condições de ângulo mágico.
    3. Ajustar o decaimento da fluorescência com uma função de decaimento mono- ou multi-exponencial na forma de f (t) = Σ i x i e -t / τ i , onde x i É a fração da população e τ i É a vida da fluorescência da população.
    4. Calcular as vidas médias da espécie, <τ> x = Σx i τ i , Onde x i É a fração da população e τ i É a vida da fluorescência da população.
    5. UseE fórmula Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r Para calcular o rendimento quântico de fluorescência do fluoróforo dador, ligando o tempo de vida de fluorescência e o rendimento quântico da referência, bem como a vida de fluorescência do fluoróforo dador.
      Observação: Este método assume dinâmico quenching. Para outras determinações ΦF, D , siga Lakowicz 56 .

5. Alinhamento da Experiência para Detecção de Molécula Única de PIE-MFD (SMD)

NOTA: É melhor desligar as luzes ao fazer medições.

  1. Ajuste do equipamento (Figura 1)
    NOTA: Para esta experiência é utilizada uma configuração MFD construída em casa ilustrada na Figura 1 , com dois lasers pulsados ​​e 4 canais de detecção num corpo de microscópio invertido. Existem sistemas comerciais semelhantes.
    1. Ligue os lasers 485-nm e 640-nm e todos os detectores da configuração MFD. Abra o software que controla a aquisição TCSPC e lasers. Certifique-se de que a taxa de repetição do laser é de 40 MHz.
    2. Definir a potência do laser pulsado de 485 nm a 60 μW num plano de imagem do objectivo de imersão em água de 60X1,2 NA e a potência do laser pulsado de 640 nm a 23 μW no modo de excitação intercalada por impulsos (PIE-MFD) 42 .
      NOTA: Para definir PIE-MFD, os dois pulsos de laser estão atrasados ​​no software do controlador de laser. Para a excitação do laser de 485 nm, os canais TCSPC de detecção (canais TAC) são 1-12.499 (canal "prompt"). Para a excitação do laser de 640 nm, os canais TCSPC de detecção (canais TAC) são 12.499-50.000 (canal de "atraso").
    3. Adicionar líquido de imersão objetiva (uma gota de água duplamente destilada) entre a lente objetiva do microscópio e uma lâmina de vidro de cobertura. Para garantir que o plano de imagem está dentro da solução e longe do vidro surfaGire o botão de ajuste uma vez e meia depois de encontrar o segundo ponto focal brilhante devido à reflexão dos lasers na interface vidro-líquido.
    4. Adicionar 1 μL de Rhodamine 100 nM 110 a 50 μL de água destilada para o centro do vidro de cobertura. Certifique-se de que a solução também está no centro do objetivo do microscópio.
    5. Ajuste as posições pinhole (tamanho: 70 μm) (direção x e y uma de cada vez) enquanto monitoriza a taxa de contagem de fótons no software de aquisição para maximizar o número de fótons detectados.
  2. Medição padrão SMD (trabalho em um quarto escuro)
    1. Use o exemplo da etapa 5.1.4 e registre 120 s da taxa de contagem clicando no botão "Iniciar" no painel de controle resolvido com tempo etiquetado (TTTR) no formato "* .ht3" 58 no software de aquisição.
    2. Calcular a espectroscopia de correlação de fluorescência offline (FCS) 59 , </ Sup> 60 , 61 ( ie, medição FCS) para determinar o tempo característico de difusão, o número de moléculas no volume confocal, a cinética do estado triplete eo brilho molecular 62 .
      1. Abra o software para FCS (Kristine, MFD suite). Selecione as configurações experimentais clicando em "Opções" -> "Selecionar Configurar". Selecione um arquivo com configurações experimentais semelhantes e clique em "get parameters from file" para ler as informações de cabeçalho no arquivo.
      2. Selecione "Operate" -> "Correlate" para executar FCS.
        NOTA: Certifique-se de que os números de canal estão devidamente especificados e de que o "TAC Gate" (canais TCSPC) é verificado para seleccionar em conformidade os canais de aviso ou atraso.
      3. Selecione "Operar" -> "Ajuste Global de Curvas de Correlação" para abrir a rotina de ajuste. Use a "equação # 24" noE e clique em "iniciar".
        NOTA: A equação # 24 no software descreve a função de autocorrelação ( G c ) de moléculas fluorescentes de difusão livre sobre um perfil de iluminação gaussiano tridimensional, tal como 61 :
        figure-protocol-1
        Onde N é o número médio de moléculas no volume de detecção, x T é a fração de moléculas que exercem a cinética de triplete com o tempo característico t T , t c , é o tempo de correlação, t diff é o tempo de difusão relacionado à geometria Parâmetro ω , e ω descreve o perfil de iluminação gaussiano. Após o ajuste, tome nota do tempo de difusão e do número de moléculas no volume confocal.
    3. Adicionar 10 μL de Rhodamine 101 100 nM a 50 μL de solução destiladaÁgua e misture bem. Coloque esta mistura sobre a tampa do vidro e certifique-se de que a gota está no centro da lente de objetivo. Clique no botão "Iniciar" no painel de controle TTTR para gravar 120 s de dados no formato TTTR.
    4. Adicionar 1 μL de 100 nM de fluoróforo far-vermelho em 50 μL de água destilada e misturar bem. Coloque esta mistura no centro da lente objetiva. Clique no botão "Iniciar" e gravar 120 s de dados em formato TTTR.
    5. Coloque 50 μL de água destilada no centro da lente objetiva. Clique no botão "Iniciar" e gravar 300 s de dados em formato TTTR.
    6. Colocar 50 μL de tampão PBS no centro da lente objetiva. Clique no botão "Iniciar" e gravar 300 s de dados em formato TTTR.
    7. Tomar 1 μL da mistura do passo 5.1.4 e misturar com 50 μL de água destilada. Coloque esta mistura sobre a tampa de vidro. Primeiro, clique no botão "Iniciar" e coletar 10 s de dados no modo TTTR. Em seguida, analise o TTTR usando o software de análise de vida de fluorescência de integração (BIFL) Burst (Paris, suite MFD), conforme descrito no passo 5.3.
      NOTA: Verifique o número de rajadas por segundo a partir do software de seleção e análise de rajadas 26 , 61 . Se o nível de rebentamento estiver em torno de 35 a cada 10 s, é apropriado para a medição de uma única molécula.
    8. Continue a registrar a taxa de contagem em formato TTTR por 1,5 h ( ou seja, TCSPC na SMD) para tratar como um padrão de medição de uma única molécula.
      Observação: devido ao tamanho de arquivo grande, dividir arquivos "* .ht3" raw em arquivos de menor tamanho para carregar e processar usando BIFL.
  3. Análise de amostras padrão utilizando BIFL
    1. Abra o software BIFL (Paris).
    2. Selecione a configuração para PIE na janela pop-up automática "Confirmar configuração" e leia o cabeçalho selecionando o arquivo com configurações experimentais semelhantes. Clique em "get parameters fromM ". Clique em" OK ". Note que a janela pop-up fecha e está integrada no front-end de Paris. Clique em" OK "em" Next ".
    3. Escolha os arquivos a analisar clicando em "Selecionar" em "Matriz de caminho de dados" para selecionar a medida a ser analisada.
      1. Clique em "Green scatter" (para uma medição de água), "Green BG" (para uma medição de tampão), "Green thick" (para uma medição de Rhodamine 110 2nM), "Red scatter" (para uma medição de água) Red BG "(para uma medição de tampão ou água)," Red thick "(para uma medição de Rhodamine 101 de 20 nM)," Yellow scatter "(para uma medição de água)," Yellow BG "(para uma medição de tampão) e "Amarelo Grosso" (para uma medida de fluoróforo far-vermelho de 2 nM).
      2. Clique em "OK" em "Avançar".
        NOTA: O canal "Verde" corresponde ao sinal dos detectores verdes nos canais TCSPC "prompt". o4 "Vermelho" corresponde ao sinal dos detectores vermelhos nos canais TCSCP "prompt" O canal "Amarelo" corresponde ao sinal dos detectores vermelhos nos canais TCSPC de atraso.
    4. Clique em "Ajustar" ao lado de "Corte de dados Burstwise" para ajustar os parâmetros de seleção de uma única molécula. Na nova janela pop-up, selecione eventos de molécula única com dois desvios padrão do tempo médio de chegada de interphoton ("dt"), alterando o tempo de chegada de interphoton sob "Threshold" e o número mínimo de fótons por evento de molécula única em "min -benzóico. Clique em "Voltar" para fechar a janela pop-up. Clique em "OK" em "Avançar".
      NOTA: O limite, em unidades ms, depende da taxa de contagem de segundo plano. O número mínimo típico de fótons utilizado é 60.
    5. Ajustar o tempo de vida da fluorescência inicial "Parâmetros de ajuste de cor" ( por exemplo , de, para e convolução) para a geraçãoD parâmetros de decaimento da fluorescência nas cores "Verde", "Vermelho" e "Amarelo". Na mesma janela, ajuste os valores "de" e "para" para "Prompt" e "Delay". Clique em "Voltar" para fechar a janela pop-up. Clique em "OK" em "Avançar".
      NOTA: Certifique-se de que a caixa de seleção de excitação de duas cores esteja selecionada. "De" e "para" correspondem às caixas inicial e final no histograma de decaimento de fluorescência (número de canal TAC). Se os parâmetros de ajuste inicial forem selecionados corretamente, uma função de ajuste é adicionada aos decaimentos de fluorescência em cada canal.
    6. Selecione o local no disco rígido para o qual salvar todos os arquivos ASCII processados ​​em uma pasta pai.
      NOTA: Paris processa todos os bursts selecionados e cria vários arquivos de saída ascii do que pode ser usado por outros programas para visualização ( por exemplo, Margarita MFD suite).

6. Padrões dsDNA e Sample MeasReforços

  1. Adicionar 500 μL de tampão PBS a um vidro de cobertura em câmara e colocar uma gota de água destilada entre a câmara ea objectiva. Clique no botão "Iniciar" no pedal de controle e coletar 5 min de dados no modo TTTR para usar para análise.
  2. Tome uma pequena quantidade (geralmente cerca de 0,1 μL, concentração de cerca de 1 μM) de padrão de dsDNA, adicione-o ao tampão PBS e misture bem. Primeiro, colete 10 s de dados clicando em "Iniciar". Em seguida, verifique a explosão para obter 35 rajadas por 10 s (como nos passos 5.2.7 e 5.3). Finalmente, colete> 2 h de dados em formato TTTR, conforme descrito acima.
  3. Analisar os dados recolhidos para as amostras de dsDNA, como no passo 5.3.3.
  4. Visualize os histogramas de ruptura usando o conjunto MFD (Margarita) e exiba a eficiência de FRET versus <τ D (A) > f ou o F D / F A versus <τ D (A) > f .
    1. AbertoEle Margarita software e selecione "Arquivo" -> "Importar todos *. 4 e *. MTI arquivos." Selecione a pasta pai contendo várias subpastas.
    2. Selecione os parâmetros a visualizar clicando ao lado de "X" (abscissa) de um dos parâmetros derivados de Paris ( por exemplo, tau verde ou <τ D (A) > f ); Similarmente, repita isto para a ordenada "Y" para selecionar o parâmetro desejado para visualizar ( eg, eficiência de FRET, F D / F A ou S PIE PIE).
      NOTA: Nesse caso, FRET eficiência, F D / F A ou S PIE corrigir taxa de contagem de fundo adequada nos canais verde, vermelho e amarelo; Para rendimentos quânticos do dador e aceitador; Para o rácio de eficiência de detecção (g G / g R ); E para crosstalk (α). Aqui, g G / g R = 3,7 e α = 0,017, dependendo apenas do instrumento. Taxas de contagem de antecedentesDependem do tampão usado, e os valores de rendimento quântico são previamente determinados.
    3. Adicione uma linha FRET abrindo a janela "Overlay Equation" clicando em "Display" -> "Overlay Equation". Selecione a linha FRET estática no menu pop-up. Selecione os tempos de vida do doador e os parâmetros de rendimento quântico adequados para gerar a linha FRET adequada.
      NOTA: As linhas FRET para correlação de vários indicadores FRET podem ser geradas.
  5. Determine o fator de correção para a excitação do aceitador pela fonte de excitação do doador (β) usando o parâmetro de estequiometria exibindo a eficiência de FRET versus estequiometria (S PIE ) em Margarita (Equação 1, abaixo).
    NOTA: P é escolhido de tal modo que a amostra do dador tenha um pico em S PIE = 1,0 na escala de estequiometria; A amostra apenas aceitadora deve ter uma estequiometria de S PIE = 0,0, e o dsDNA com ambos os rótulos deve ter uma estequiometria de S PIE ~ 0,5
    NOTA: O instrumento está agora pronto, e é possível medir amostras marcadas com FRET.
  6. Medir e analisar as amostras marcadas com FRET preparadas na secção 3 seguindo os passos 6.3-6.4.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Em experiências típicas de smFRET utilizando uma configuração MFD (linhas de laser: 485 nm a 60 μW e 640 nm a 23 μW, secção 5.1), a amostra de fluorescência é diluída para uma concentração de baixo-picomolar (10-12M = 1 pM) e colocada Em um microscópio confocal, onde um pulso de laser de sub-nanossegundo excita moléculas marcadas que se difundem livremente através de um volume de excitação. Um volume confocal típico é <4 femtolitros (fL). Em concentrações tão baixas, apenas moléculas ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste trabalho, apresenta-se o protocolo para alinhar, calibrar e medir distâncias de interdise com alta precisão usando experimentos FRET de molécula única PIE-MFD. Ao calibrar cuidadosamente todos os parâmetros instrumentais, pode-se aumentar a precisão das distâncias medidas e alcançar a precisão de Angstrom. Para isso, são utilizados vários histogramas multidimensionais para analisar e identificar populações para posterior caracterização. Utilizando o tempo macro médio para verificar a estabilidade das amostras medi...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes com o conteúdo deste artigo.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VJ e HS reconhecem apoio de NIH R01 GM094246 a VJ. HS reconhece fundos de arranque do Clemson University Creative Inquérito Programa e do Centro de Materiais Ópticos Ciência e Engenharia de Tecnologias Clemson University. Este projeto foi também apoiado por uma bolsa de treinamento do Centro Keck para Treinamento Interdisciplinar de Biociências dos Consórcios da Costa do Golfo (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) e da Fundação Schissler para Estudos Translacionais de Doenças Humanas Comuns a DD. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
carvão MerckKGaAK42964486 320
filtro de seringaFisherbrand09-719Ctamanho: 0.20 µ m
lamínula com câmaraFisher Scientific1554091,5 vidro de borosilicato, 8 poços
de vidro de cobertura de microscópioFisher Scientific063014-9tamanho: 24 x 60-1,5
Água livre de nucleaseFisher Scientific148859
tween-20Thermo Scientific28320Solução a 10% de fita de DNA aceitadora de polissorbato 20
( High FRET)Integrated DNA Technologies1781248955&agudo;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
fita de DNA aceitadora (Low FRET)Integrated DNA Technologies1779564245&agudo;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TAT TGC)
fita de DNA doadorIntegrada DNA Technologies1779514375&agudo; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
fita de DNA (Sem FRET)Integrated DNA Technologies5&agudo; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TAT
termocicladorEppendorfE6331000025gradiente
de nexoAlexa Fluor 488 C5  MaleimideThermo ScientificA10254denominado fluoróforo ciano-verde no manuscrito Alexa
Fluor 647 C2  MaleimideThermo ScientificA20347denominado fluoróforo vermelho distante no manuscrito
Rodamina 110Sigma-Aldrich83695-250MG
Rodamina 101Sigma-Aldrich83694-500MG
LB Broth, MillerFisher ScientificBP1426Para cultura de E. coli
AmpicilinaSigma-AldrichA0166Usado em 100 µ g/mL de concentração final em meio LB seletivo para manter a seleção de plasmídeos
Tetracilina Calbiochem58346Usado em 12.5 µ g/mL de concentração final em meio LB seletivo para manter a mutação gor (flutationa redutase) em cepas de Origami B(DE3) para facilitar a oxidação da ligação dissulfeto
KanamicinaFisher ScientificBP906-5Usado em 15 µ g/mL de concentração final em meio LB seletivo para manter a mutação trxB (riorredoxina redutase) em manchas B(DE3) para facilitar a oxidação da ligação dissulfeto
Origami B(DE3) Células CompetentesMillipore70837-3Células competentes E. coli para expressão de proteínas com pontes dissulfeto
Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG)Fisher ScientificBP1755Para indução de expressão de proteína E. coli
HiTrap Chelating HPGE Life Sciences17-0409-01Para purificação FPLC em larga escala da proteína marcada com His
ImidazolSigma-Aldrich56749
Ni-NTA Agarose Qiagen30210
PD-10GE Life Sciences17-0851-01
AktaPurifierInstrumento 28406264 FPLC da GE Life Sciences
Tubulação de diáliseSpectrum labs13256215 kD MWCO 24 mm Largura do flate, 10 metros/rolo
DichroicsSemrockFF500/646-Di01-25x36500/646 BrightLight
50/50 Polarizador de divisor de feixeQioptiq Linos G33 5743 000Polarizador de filme 10 x 10
Filtro de passagem verdeChromaET525 / 50mET525 / 50m Montagem de 25 mm de diâmetro
Filtro de passagem vermelhoChromaET720 / 150mET720 / 150m Montagem de 25 mm de diâmetro
Medidor de potênciaThorLabdPM200
VarianCary300Bio
Fluorolog 3 FluorômetroHoribaFL3-22-R3
Fluorohub TCSPC controladorHoribaFluorohub-BTCSPC eletrônica para medições de conjunto
NanoLed 485LHoriba485LLaser de diodo azul
NanoLed 635LHoriba635LLaser de diodo vermelho
Olympus IX73 Microscópio OlympusIX73P2FMoldura de microscópio
PMA 40 Detector híbridoPicoQuant GmbH932200, PMA 40Otimizado para detecção de verde
Detector híbrido PMA 50PicoQuant GmbH932201, PMA 50Otimizado para sensibilidade do câmbio ed
Laser de 485 nmPicoQuant GmbHLDH-D-C-485
Laser de 640 nmPicoQuant GmbHLDH-D-C-640
Hydraharp 400 e software de aquisição TTTRPicoQuant930021Temporizador de evento de picossegundos e unidade de coutning de fóton único correlacionado ao tempo, inclui software de aquisição
TTTR SEPIA II SLM 828 ede laser de 910028PicoQuantpara pulsos de picossegundos, inclui controlador de software SEPIA.
computadorDelloptiplex 7010cpu: i7-3770 ram:16GB
FRET Software de posicionamento e triagem (FPS)Heinrich Heine UnviersityInclui o Accesibel Volume clacualtor disponível na suíte MFD http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
Heinrich Heine UnviersityInclui o pacote de software BIFL Paris; Margarita para visualização dos hisotrams multiparâmetros, e software de Análise de Distribuição de Probabilidade disponível em http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html
livre de nuclease ) Coluna de Dessalinização Espectrofotômetro UV-Vis driver do software SEPIA

Referências

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