Artigo de método

Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados Tribolium castaneum Os embriões

DOI:

10.3791/55629

⸱

28 de abril de 2017

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1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Neste artigo

Resumo

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Imagiologia da morfogénese de embriões de insectos com microscopia de fluorescência com base em folha de luz tornou-se o estado da arte. Este protocolo descreve e compara três técnicas de montagem apropriadas para os embriões Tribolium castaneum, introduz dois novos feitos sob linhagens transgênicas bem adequado para imagens ao vivo, discute controles essenciais de qualidade e indica limitações experimentais atuais.

Resumo

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A farinha vermelho besouro Tribolium castaneum tornou-se um importante organismo modelo inseto em genética do desenvolvimento e biologia evolutiva do desenvolvimento. A observação dos embriões Tribolium com microscopia de fluorescência com base em folha de luz tem várias vantagens sobre widefield convencional e microscopia de fluorescência confocal. Devido às propriedades únicas de um microscópio com base em folha de luz, imagens em três dimensões de espécimes vivos podem ser gravados com altas relações de sinal-para-ruído e reduzida significativamente foto-branqueamento, bem como foto-toxicidade ao longo de várias direcções ao longo de períodos que duram várias dias. Com mais de quatro anos de desenvolvimento metodológico e um aumento contínuo de dados, o tempo parece adequado estabelecer procedimentos operacionais padrão para o uso da tecnologia folha de luz na comunidade Tribolium, bem como na comunidade de insetos em geral. Este protocolo descreve três técnicas de montagem adequados fou finalidades diferentes, apresenta dois novos transgênicos linhas Tribolium feitos sob medida adequada para imagens ao vivo de longo prazo, sugere cinco corantes fluorescentes para rotular estruturas intracelulares de embriões fixos e fornece informações sobre o pós-processamento de dados para a avaliação atempada dos dados gravados. Os resultados representativos concentrar em imagens ao vivo a longo prazo, de corte tico e a observação do mesmo embrião ao longo de várias direcções. Os respectivos conjuntos de dados são fornecidos como um recurso para download. Finalmente, o protocolo discute controlos de qualidade para os ensaios de imagens ao vivo, as actuais limitações e a aplicabilidade dos procedimentos descritos para outras espécies de insectos.

Este protocolo destina-se principalmente para os biólogos do desenvolvimento que buscam soluções de imagem que superam equipamentos de laboratório padrão. Ela promove a tentativa contínua para fechar o intervalo entre os laboratórios tecnicamente orientadas / comunidades, que se desenvolvem e refinar microscopiar metodologicamente, e os laboratórios de ciências da vida / comunidades, que exigem soluções 'plug-and-play' para os desafios técnicos. Além disso, ele suporta uma abordagem axiomático que move as questões biológicas para o centro das atenções.

Introdução

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A farinha besouro Tribolium castaneum vermelho, que pertence à grande família de escaravelhos pretos (Tenebrionidae), tem uma longa história no âmbito das ciências agrícolas e de vida e é o segundo mais bem estudada organismo modelo inseto modelo após a mosca da fruta Drosophila melanogaster. Durante as últimas quatro décadas, tornou-se um poderoso e popular organismo inseto modelo em genética do desenvolvimento, em biologia evolutiva do desenvolvimento e, durante os últimos vinte anos, na morfogênese embrionária para uma variedade de razões:

Drosophila e Tribolium ambos pertencem ao Holometabola, mas divergiram aproximadamente 300 milhões de anos atrás, 1, 2, 3, 4. Embora o desenvolvimento embrionário de Drosophila é vulgarmente considerado como altamente derivados, Tribolium mostra um modo mais ancestral da mentomento que é encontrado numa proporção consideravelmente maior de espécies de insectos 5, 6, 7, 8, 9. Em primeiro lugar, Tribolium exibe desenvolvimento cabeça não-involuído, ou seja, as suas partes bucais e antenas já surgem durante a embriogénese 10, 11, 12, 13, 14, 15. Em segundo lugar, Tribolium segue os princípios do desenvolvimento de curto germe, ou seja, segmentos abdominais são adicionados sequencialmente a partir de uma zona de crescimento posterior durante o alongamento germband 16, 17, 18, 19. Em terceiro lugar, Tribolium desenvolve e degrada posterioresduas membranas extra-embrionárias ou seja, o âmnio, o qual abrange o embrião única ventralmente, e a serosa, o qual envolve completamente o embrião 20, 21, 22. Ambas as membranas desempenham um morfogenética cruciais 23, bem como papel de proteção contra microorganismos 24, 25 e dessecação 26. Em quarto lugar, as pernas embrionariamente em desenvolvimento são totalmente funcionais durante a fase de vida das larvas e servir como o primórdio para as pernas adulto durante a metamorfose de pupa 27, 28, 29, 30, 31.

Devido ao seu tamanho e modestos pequenas demandas, cultivo de Tribolium em laboratório é bastante simples. As culturas de tipo selvagem (WT) estirpes ou linhas transgénicas consistem tipicamente de cerca de 100-300 adultos e pode ser mantido dentro de garrafas de um litro de vidro (80 cm pegada 2) cheios de três a quatro centímetros de altura (cerca de 50 g) com meio de crescimento que é constituída por grãos de trigo completo farinha suplementado com levedura seca inactivo. Um fornecimento de água não é necessária. Isto permite que mesmo pequenos laboratórios para manter dezenas de culturas besouro dentro de pequenas ou médias incubadoras de insecto comercialmente disponíveis. Fases posteriores de desenvolvimento de Tribolium (larvas após aproximadamente o quarto instar, pupas e adultos) são facilmente separados a partir do meio de crescimento por peneiração. embriões sincronizados são obtidos por incubação de adultos para curtos períodos em forma de postura de ovos. Para o desenvolvimento rápido, culturas besouro são mantidos a 32 ° C (cerca de quatro semanas por geração), mantendo estoque é tipicamente realizada a 22-25 ° C (cerca de 10 semanas por geração).

Na última década, muitos tec padrãohniques foram gradualmente adaptada e optimizado para Tribolium, como resumido nos livros Emerging modelo Organismos 32. De grande importância são avançados métodos genéticos, tais como embrionário 33, larval 34, 35 ou parental 36, 37 de ARN baseada em interferência silenciamento de genes, transformação da linha germinativa com quer o piggyBac 38, 39 ou o sistema de transposase Minos 40 e CRISPR / genoma baseados em cas9 engenharia 41. Além disso, o genoma Tribolium foi sequenciado cerca de uma década atrás 42, e está agora na terceira ronda de genoma conjunto de libertação 43, o qual permite a identificação eficiente e de todo o genoma e a análise sistemática de genes 44 ou outros elementos genéticos 45, 46. Além disso, os genomas de outros quatro espécies de coleópteros está disponível para abordagens genéticas comparativos 47, 48, 49, 50. Em associação com o genoma sequenciado, duas análises genéticas em larga escala têm sido efectuada, isto é um ecrã de mutagénese de inserção 51 e um gene knockdown tela à base de interferência de ARN sistemática 52, 53.

Fluorescência de imagens ao vivo com widefield, confocal ou microscopia de luz com base em folha (LSFM) permite observar a morfologia embrionária de Tribolium como uma função do tempo (isto é, a morfogénese) num contexto de multi-dimensional (Tabela 1). Na microscopia de campo amplo e fluorescência confocal, o excitção e emissão de luz é guiado através da mesma lente objetiva. Em ambas as abordagens, toda a amostra é iluminada por cada plano bidimensional gravado. Assim, as amostras são sujeitas a níveis muito altos de energia. Em LSFM, apenas os fluoroforos no plano focal está animado devido a uma dissociação de iluminação e detecção por meio de duas lentes objectivas dispostas perpendicularmente (Figura 1). LSFM vem em duas implementações canónicos - o único plano iluminação microscópio (SPIM) e a luz do laser digitalizada à base de folha de microscópio de fluorescência digitais (DSLM, Figura 2) - e oferece várias vantagens importantes em relação às abordagens tradicionais: (i) capacidade de corte óptico intrínseca, (ii) resolução boa axial, (iii) fortemente reduzido nível de foto-branqueamento, (iv) muito baixo foto-toxicidade, (v) relação elevada sinal-para-ruído, (vi) relativamente elevada velocidade de aquisição, (vii) imagiologia ao longo de várias direcções e (viii) penetração mais profunda do tecido devido ao uso de baixo numérica abertura iluminação lentes objectivas 54, 55, 56.

LSFM já foi aplicada com êxito em Tribolium para documentar quase toda a morfogénese embrionária 57 e para analisar os princípios da ruptura da membrana extra-embrionária, no início do fecho dorsal 23. Para aumentar a atratividade de LSFM na comunidade Tribolium e para a ciência de insetos em geral, é de grande importância para estabelecer procedimentos operacionais padrão e melhorar os métodos, protocolos e o conjunto de recursos para um nível onde o microscópio torna-se uma facilidade de -Use ferramenta padrão em laboratórios de biologia do desenvolvimento, e as questões biológicas ficar no centro das atenções.

Este protocolo começa com as noções básicas de Tribolium </ em> cultivo, ou seja, manutenção, reprodução e colheita de embriões. Em seguida, duas estratégias experimentais encontram-se ilustrados: (i) imagens ao vivo de linhas transgénicas feitos por medida e (ii) imagiologia de embriões fixos que foram coradas com corantes fluorescentes (Tabela 2). Subsequentemente, três técnicas de montagem com fins ligeiramente diferentes são explicados em detalhe (Figura 3 e Tabela 3): (i) a coluna de agarose, (ii) o hemisfério de agarose e (iii) o titular da teia romance. O protocolo, em seguida, explica o procedimento de aquisição de dados com LSFM. modalidades de imagem e considerações importantes são delineadas. Finalmente, a recuperação embrião é explicado e sugestões para processamento de dados básicos são fornecidos. Nos resultados representativos, os dados de imagem ao vivo de dois novos feito por encomenda e as 58 linhas transgénicas glia-azul são mostrados e os respectivos conjuntos de dados de imagem são fornecidos como um recurso para download. Além disso, a imagemdados de embriões fixos que foram coradas com uma variedade de corantes de fluorescência são apresentados. A discussão centra-se em controle de qualidade, as actuais limitações da abordagem imagens ao vivo e a adaptação do protocolo para outras espécies.

O protocolo é escrito para microscópios de fluorescência baseado em folha de luz, que estão equipados com uma câmara de amostras e um mecanismo de fixação pode rodar para suportes normalizados de amostra 54, 59, 60, que são tipicamente elementos em forma de cilindros feitos de metal, de plástico ou de vidro com um diâmetro na gama de milímetros. O protocolo também é adequado para ambas as implementações canónicos, ou seja SPIM e DSLM, bem como para as configurações com duas ou mais de iluminação e de detecção de braços 61, 62, 63. Os resultados representativos mostram dados em dois canais espectrais, verde (ILluminação com um laser de 488 nm, detecção por meio de um filtro passa banda 525/50) e vermelho (iluminação com um laser de 561 nm, detecção por meio de um filtro passa banda 607/70), mas o protocolo pode ser expandido para três ou quatro canais espectrais.

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Protocolo

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1. Criação de Culturas Tribolium

NOTA: As condições padrão são definidas como uma temperatura de incubação de 25 ° C e 70% de humidade relativa dentro de 12 h / 12 h brilhantes ciclo escuro. Para mais informações sobre Tribolium criação, respectivas diretrizes estão disponíveis 64. Este protocolo requer dois meios diferentes à base de farinha, que podem ser preparados em quantidades kg e armazenados durante vários meses.

  1. Antes de trabalhar com farinha e fermento seco inactivo, armazenar as embalagens fechadas, a -20 ° C durante 24 h e depois deixá-los aquecer até à temperatura ambiente. Este procedimento elimina potenciais agentes patogénicos.
  2. Passe farinha de trigo de grão completo e levedura seca inactiva através de um peneiro com tamanho de malha de 710 um, em seguida, se preparar o meio de crescimento, completando a farinha de grão completo peneirada com 5% (w / w) de fermento seco peneirado inactivo.
  3. Passar 405 farinha de trigo fina e levedura inativa seca através de uma peneira com 250 & #181; m malhagem, em seguida, preparar o meio de postura de ovos, completando o 405 farinha de trigo fina peneirada com 5% (w / w) de fermento seco peneirado inactivo.
  4. Passar a respectiva cultura Tribolium através uma peneira com 800? M de tamanho de malha. Descartar o restante meio de crescimento. Transferir as larvas, pupas e adultos para um grande prato de vidro.
  5. Se não houver uma cultura descendência, transferir cerca de 80 larvas e / ou pupas de uma nova garrafa de vidro para estabelecer uma nova cultura descendência. Se não houver larvas e / ou pupas estão presentes, levar cerca de 40 adultos em seu lugar. Adicionar 50 g de meio de crescimento e incubar sob condições padrão.
  6. Recolha cerca de 300 adultos (500-700 mg) em um outro novo frasco de vidro para estabelecer a cultura de imagem. Adicionar 50 g de meio de crescimento e incubar sob condições padrão. Permitir que a cultura de imagem que se contentar com, pelo menos, 24 h em meio de crescimento fresco antes de colheita de embriões.
  7. Substituir o meio de crescimento da cultura de imagem pelo menos a cada dois nósEKS, o que pode ser feito em conjunto com a recolha de embriões (ver 3.2). Depois de dois a três meses, substituir a cultura de imagem completamente por novos adultos a partir da cultura descendência.
  8. Se uma linha transgénica homozigótica não é usado, curador as culturas de progenia frequentemente removendo animais não transgénicos. Idealmente, gerar linhas homozigóticas se o respectivo transgene não é letal ou causa esterilidade quando presente em ambos os cromossomas. culturas homozigóticas têm tipicamente um nível de fluorescência média mais elevada e as condições experimentais gerais são mais estreitas, uma vez que apenas um genótipo está presente.

2. Instalação Microscópio e Calibração

NOTA: O embrião Tribolium tem um comprimento ântero-posterior de cerca de 600-660 ^ m e um diâmetro transversal de cerca de 300-330? M. A maioria das câmaras CCD modernos têm um tamanho do chip do sensor de cerca de 9 mm x 7 mm, ou seja, um diâmetro de 11,4 um, e um raio de pixel do pixel de 6,45? M.Quando combinada com uma lente objectiva 10X de ampliação, o embrião pode ser representada por imagem in toto com uma densidade de pixéis de 0,645? M. A maioria das câmaras modernas scmos têm um tamanho maior do chip do sensor de cerca de 16 mm x 14 mm, isto é, um diâmetro de 21,3 um, e um raio de pixel do pixel de 6,5? M. Quando combinada com uma lente objectiva de 20x de ampliação, o embrião pode ser representada por imagem in toto com uma densidade de pixéis de 0,325? M.

  1. Anexar as lentes de iluminação e objetivos de detecção para o microscópio. Certifique-se de que os lasers e filtros de fluorescência corresponde a absorção fluoróforo e espectros de emissão muito bem.
  2. Anexar a câmara de amostras para o microscópio. Encher a câmara de amostras com PBS a pH 7,4 ou qualquer outro tampão de imagiologia apropriada.
  3. Ligar e calibrar o microscópio. rotinas e diretrizes de solução de problemas para microscópios à base de folha de luz custom-built (mais especificamente para a implementação DSLM) calibração abrangente foram publicados previously 65. Para dispositivos comerciais, siga as instruções do fabricante com muito cuidado. Manuseamento incorrecto pode esgotar a câmara de amostras do meio e causar estragos ao instrumento bem como a amostra.

3. Recolha de transgênicos ou WT embriões

  1. Passar a colónia de imagem através de um peneiro com tamanho de malha de 800? M. Recolhe escaravelhos adultos em um novo frasco de vidro e adiciona-se 10 g de meio de postura de ovos. Incubar a cultura de postura de ovos durante 1 h a 25 ° C e 70% de humidade relativa em luz.
  2. Passar a cultura de postura de ovos através de um peneiro com tamanho de malha de 800? M para separar os adultos a partir do meio de postura de ovos, o qual contém cerca de 30-100 embriões. Transferir adultos para um novo frasco de vidro e adicionar o antigo ou 50 g de meio de crescimento fresco.
  3. Se observação deve começar na fase de blastoderme uniforme (exemplo de conjunto de dados DS0002), incubar a forma de postura de ovos durante 15 h a 25 ° C e 70% de humidade relativa. TO começar no início de retracção germband (exemplo conjuntos de dados DS0001 e DS0003), incubar os embriões durante 23 h a 32 ° C e 70% de humidade relativa. Se outros estágios de desenvolvimento são desejados, referem-se à respectiva literatura 64, 65 e adaptar o tempo e / ou temperatura de incubação conforme necessário.

4. Embryo dechorionation

NOTA: O cório é a camada exterior da casca do ovo e consiste em proteínas e polissacarídeos. É fortemente a luz absorvente, mas não essencial para o desenvolvimento adequado e pode, assim, ser removido quimicamente.

  1. Passar o meio de postura de ovos através de um peneiro com tamanho de malha de 300? M. Recolher os embriões em um filtro de células com tamanho de malha de 100 um e rejeitar a forma de postura de ovos sobra.
  2. Prepara-se uma placa de 6 pos como se segue: encher a A1, A2, A3 e B3 poços com 10 mL de PBS pH 7,4 e os poços B1 e B2 com 9 ml de PBS. Então, cuidadosamente adicionar1 ml de hipoclorito de sódio a B1 e B2. Observar o andamento das etapas 4.3 a 4.8 sob o microscópio estéreo. CUIDADO hipoclorito de sódio é corrosivo.
  3. Inserir o filtro de células no poço A1 (PBS, pH 7,4) e lavar os embriões, durante um minuto, sob agitação suave. partículas de farinha maiores devem separar os embriões.
  4. Transferir o filtro celular para o bem B1 (hipoclorito de sódio em PBS de pH 7,4) e agitar a placa vigorosamente durante 30 s. As partículas de farinha restantes deve destacar completamente a partir dos embriões.
  5. Transferir o filtro celular para o bem A2 (PBS, pH 7,4) e lavar os embriões, durante 1 minuto, sob agitação suave.
  6. Para dechorionation, transferir o filtro celular para o bem B2 (hipoclorito de sódio em PBS de pH 7,4). Agitar a placa vigorosamente até que as rupturas córion e separa-se os embriões. O córion se parece com uma membrana fina, semi-transparente com bordas dilacerados, enquanto embriões dechorionated têm uma silhueta simples.
  7. th de transferênciacoador e celular para o bem A3 (PBS, pH 7,4) e lavar os embriões, durante 1 minuto, sob agitação suave. Se quaisquer fragmentos córion ainda est ligados aos embriões após a lavagem, repetir o passo 4.6.
  8. Armazenar os embriões no bem B3 (PBS pH 7,4). Armazenamento por várias horas não prejudique os embriões, mas tenha em mente que o desenvolvimento continua.
  9. Para as linhas de transgénicos não homozigóticos, remover quaisquer embriões não fluorescentes, se possível. Para a fixação e coloração de WT ou embriões transgénicos, continuar com o passo 5. Para imagens ao vivo de embriões transgénicos, continuar com o passo 6.

5. Vitelino Membrane permeabilização, Fixação e Coloração

NOTA: A membrana vitelina é a camada mais interior da casca do ovo. É impermeável para corantes fluorescentes e, portanto, tem de ser quimicamente permeabilizadas antes da coloração.

  1. Encher um frasco de cintilação com solução de fixação / permeabilização (1,5 ml de 4% (w / v) de paraformaldeo em PBS pH 6,9 de umND 1,5 mL de n-heptano). Transferir embriões com um pincel para os frascos. frascos de cobertura com uma folha de alumínio para proteger da luz fluoróforos e incubar durante 30 minutos numa plataforma de agitação a 50 rotações por minuto. CUIDADO paraformaldeído é tóxico e corrosivo, de n-heptano é inflamável e tóxica.
  2. Remover solução de fixação e o tratamento de embriões três vezes durante 15 minutos em 3 mL de 0,1% (v / v) de Triton X-100 em PBS pH 7,4 e subsequentemente uma vez durante 15 minutos em 3 mL de 1% (v / v) de Triton X-100 em PBS pH 7,4 numa plataforma de agitação a 50 rotações por minuto. CUIDADO Triton X-100 é corrosivo.
  3. Remover a solução de permeabilização e adiciona-se 0,5 mL de solução de coloração para o frasco. Exemplos de soluções de coloração são apresentados na Tabela 2. Stain embriões durante a noite a 4 ° C sobre uma plataforma de agitação a 50 rotações por minuto. Para os corantes propostos na Tabela 2, a lavagem não é necessário.

6. Preparação de montagem de agarose

  1. Adicionar 1 g de baixo ponto de fusãode agarose a 100 mL de PBS pH 7,4 e aquecer a mistura durante 2-3 minutos num forno de microondas a 800 W. Se as pequenas partículas de agarose estão ainda presentes, repetir o processo de aquecimento em intervalos de 30 seg até que as partículas se dissolvem completamente. A agarose de montagem não precisa de ser preparada de fresco cada vez, o solidificado de agarose pode ser re-liquefeito por meio de aquecimento tal como descrito acima. Este processo pode ser repetido 5-6 vezes, antes demasiada água se tenha evaporado.
  2. Permitir que a agarose a arrefecer para cerca de 40-45 ° C, em seguida, encher dois tubos de reacção de 1,5 mL com a agarose aquecido e manter os tubos a 35 ° C em um termobloco.

7. Embryo Montagem e Inserção na Câmara Amostra

  1. Opção 1: Coluna de agarose (Figura 3A-C, a primeira coluna; Tabela 3, a segunda coluna)
    1. Encher uma seringa de 1,0 mL com água destilada e coloque-o uma das aberturas capilares de vidro utilizando um tubo de borracha pequena.Encher a meio caminho capilar com água destilada.
    2. Escolher um embrião com um pincel e colocá-lo sobre o lado interno da outra abertura capilar de vidro. Avançar rapidamente para a próxima etapa antes de o embrião seca.
    3. Furar o capilar para a agarose líquido e lentamente desenhar algumas uL de agarose líquido ao lado do embrião dentro do capilar. Em seguida, rapidamente aumentar a força de desenho para que o embrião é arrastado juntamente com a agarose. No final, alguns mL de agarose deve estar acima e abaixo do embrião. Defina o capilar de lado por alguns minutos e deixar a agarose solidificar.
    4. Encurtar o capilar com um cortador de vidro de diamante com um comprimento de cerca de 5 mm. O fragmento restante deve ser completamente preenchido com agarose e o embrião deve estar dentro do segundo quartil.
    5. Inserir o cilindro de aço com o pino para dentro da câmara da amostra, e em seguida, manter o fragmento capilar na parte superior do pino. A coluna de agarose deve sobressair um milímetro poucos fROM O fragmento capilar com a parte que contém o embrião.
  2. Opção 2: hemisfério de agarose (Figura 3A-C, a segunda coluna; Tabela 3, a terceira coluna)
    1. Desenhar 200 uL de agarose líquido numa seringa de 1,0 ml, então usá-lo para encher o tubo de aço a partir do topo com agarose até se formar um hemisfério, na abertura inferior. O diâmetro hemisfério deve ser igual ao diâmetro do tubo. Aguardar alguns minutos até que a agarose foi solidificada.
    2. Escolher um embrião com um pincel e reorganizar-lo na ponta do pincel de modo a que a extremidade anterior torna-se acessível. Mergulhar o hemisfério de agarose em agarose de líquidos para cobri-lo com uma fina película.
    3. Coloque o embrião com a sua extremidade anterior na posição vertical sobre o pólo do hemisfério de agarose. Girar o tubo de aço em volta e corrigir a posição do embrião com a escova. Se necessário, a estabilizar o embrião por adição de 2 ul de agarose para a fronteira embrião / hemisfério. Ideally, menos do que metade da superfície do embrião deve ser coberto de agarose e os flancos deve ser tão íngreme como possível.
    4. Inserir o tubo de aço com o hemisfério e embrião lentamente para dentro da câmara da amostra.
  3. Opção 3: Suporte de teia de aranha (Figura 3A-C, terceira coluna; Tabela 3, a quarta coluna)
    1. Escolher um embrião com um pincel e reserve.
    2. Cobrir o orifício oblongo do suporte da teia com 5-8 ul de agarose líquida, em seguida, remover a maior parte da agarose até que apenas um filme de agarose fino permanece.
    3. Coloque o embrião sobre a película de agarose e ajustar a sua posição. mover-se cuidadosamente o embrião ao centro do eixo x do orifício oblongo, e alinhar o seu eixo ântero-posterior alongada com o eixo alongado da abertura escatelada.
    4. Inserir o suporte da teia com o embrião montado lentamente para dentro da câmara da amostra. Posicione o suporte da teia de modo que não interfira com a excitação e emissãoluz, isto é, 45 ° em relação à x e z-eixo.

baseada em folha 8. Luz Microscopia de Fluorescência

  1. Decidir junto quantas direções (e ao longo do qual orientações) o embrião deve ser trabalhada. Quatro direcções (ao longo das orientações de 0 °, 90 °, 180 ° e 270 °) fornecem tipicamente um bom compromisso entre a cobertura e de carga de energia.
  2. Configure o número de canais de fluorescência. Os principais parâmetros para cada canal são a linha de laser, o filtro de fluorescência, a potência do laser e o tempo de exposição. Para geração de imagens ao vivo de longo prazo, é importante que a carga integrada de energia não exceda a tolerância do embrião. Um tempo de exposição de 25-50 ms garante imagens rápido, enquanto uma potência do laser entre 100 e 300 mW não deve afetar a viabilidade do embrião. Para amostras fixos, tempo de exposição e potência do laser pode ser pelo menos o dobro.
  3. Para ensaios de imagens ao vivo, configure o lapso de tempo. o complete embriogénese de Tribolium leva cerca de sete dias a temperatura ambiente (23 ± 1 ° C) e um pouco menos de três dias a 32-35 ° C 64. Definir o intervalo de tempo de acordo com os eventos morfogenéticos que devem ser observados. Para intervalos temporais curtos, considerar a redução do tempo de exposição e potência do laser (ver 8.2).
  4. Posição do embrião no modo de luz de transmissão ao longo da xey eixos para o centro do campo de visão sem expor-lo para o laser. Rodar o embrião por 360 ° em 90 ° etapas para examinar o embrião por quaisquer danos que possam ter ocorrido durante o processo de montagem.
  5. Rodar o embrião adequadamente em torno do eixo-y para alinhar os eixos embrionários com o microscópio de eixos, por exemplo, o eixo lateral com o eixo-x, ou seja, o eixo dorsoventral com o eixo z. Quando se utiliza a técnica de suporte de teia, o alinhamento pode não ser possível.
  6. No modo de fluorescência, definir o z-pilha for cada direcção. Adicionar 25-50? M como tampão espacial em frente de e atrás do embrião. Incluindo o tampão, o típico z-pilha abrange cerca de 350-400 mm para um embrião Tribolium. Definem também o z-o espaçamento, que deve ser de quatro vezes o espaçamento lateral, isto é, o espaçamento ao longo dos eixos X e Y-eixos 66.
  7. Se dois ou mais embriões são gravadas em paralelo, reinicie em 8,4 com o próximo embrião.
  8. Para imagiologia de longo prazo, garantir que a câmara da amostra é preenchido com suficiente PBS pH 7,4 ou outro tamp de imagem. cobrir também a abertura da câmara de amostra.
  9. Inicie o processo de imagem. Para geração de imagens ao vivo de longo prazo, monitorar a aquisição correta ao longo de todas as direções em todos os canais para todos os embriões. verifique ocasionalmente durante os próximos dias que os embriões estão vivos e na posição apropriada.

9. Embryo Recuperação e Controle de Qualidade

  1. Uma vez imaging for concluído, retire o suporte da amostra comos embriões a partir da câmara de amostras. Somente embriões de ensaios de imagens ao vivo tem que ser recuperado. embriões fixados e corados podem ser descartados.
  2. Se um ensaio de imagens ao vivo foi realizada, a transferência do embrião para um slide objecto. Para a técnica de agarose coluna, extrair os embriões de torno de agarose com um bisturi, de micro-faca ou lâmina de barbear. Para a técnica de agarose hemisfério, transferir o hemisfério com o lado plano para o objecto deslize. remoção embrião não é necessário. Para a técnica de suporte de teia de aranha, suavemente desmontar os embriões a partir da película de agarose com um pincel. Incubar a lâmina objeto em um pequeno prato de vidro em atmosfera saturada de humidade, em condições padrão até que as larvas eclodem.
  3. Após incubação, a transferência das larvas para poços individuais de uma placa de 24 cavidades e adicionar 500 mg de meio de crescimento em cada cavidade. Incubar, sob condições padrão. Comparar o tempo total de desenvolvimento e morfologia das larvas fotografada para WT sem imagem e LarV transgénicoae (ver discussão). Nos ensaios que caracterizam o desenvolvimento WT, há aberrações morfológicas óbvias devem, idealmente, ser perceptível.
  4. Uma vez que as larvas se desenvolvem em adultos saudáveis, proporcionar-lhes parceiros WT apropriadas da mesma cepa de fundo. Depois de duas semanas, para verificar a produção de progênie. Considere também para verificar a fertilidade da prole por meio de cruzamentos los inter pares. Só quando os embriões fotografada desenvolver em adultos férteis que produzem descendência fértil, o procedimento de imagiologia pode ser considerado não-invasiva.

10. Imagem de Processamento de Dados

NOTA: Para o processamento de dados de imagem, o open-source de processamento de imagem software ImageJ 67 ou seu FIJI derivado 68 são recomendados. Ambas as versões, bem como documentação completa são encontrados em www.imagej.net. O formato de arquivo padrão para dados LSFM é o formato de arquivo de imagem com marcas (TIFF). A opção recipiente intrínseca permite o storaiva de pilhas de imagens, tais como Z-pilhas ou série de projecções tempo máximos z dentro de um único ficheiro que pode ser aberto em ImageJ ou FIJI por meio de arrastar e largar.

  1. Se necessário, rodar os Z-pilhas para alinhar o eixo ântero-posterior do embrião com o eixo y (Imagem → Transformar → Rodar). Por favor, note que os parâmetros de rotação tem que ser definido individualmente para cada sentido, mas não para o lapso de tempo e os canais de fluorescência.
  2. Cortar os Z-pilhas ao longo do x, y e z-eixos, de modo que apenas o fundo mínimo (20 - 40 pixels ao longo da xey eixos, 5 - 10 planos ao longo do eixo z) permanece (por ox - e eixos y, use a ferramenta de seleção retangular, então imagem → Cortar, porque o eixo z, de uso de imagens → Pilhas → Ferramentas → Fatia Keeper). Por favor, note que os parâmetros de corte tem que ser definido individualmente para cada sentido, mas não para os pontos de tempo e os canais de fluorescência.
  3. Calcular a projecção máxima z para cada z-pilha(Imagem → Pilhas → Z Project, escolha Max Intensidade). cálculos de projecção intensidade são procedimentos de simplificação dados que removem uma dimensão espacial.
  4. Para dados de imagens ao vivo de longo prazo, considere o uso de um ImageJ ou script FIJI que realiza etapas de processamento 10,1-10,3 para todas as direções, todos os momentos e todos os canais de fluorescência 65. Idealmente, todas as projecções concatenar Z máxima por canal e direcção e guardá-las como uma série de tempo em um recipiente TIFF. Em alternativa, o plug-in 69 BigDataViewer para Fiji pode ser utilizado para navegar através de terabytes grandes conjuntos de dados.
  5. Dependendo das modalidades de linha de imagem e transgênicos, os ajustes de intensidade dinâmica das pilhas de tempo pode ser desejável devido ao foto-branqueamento e / ou flutuações de expressão fluoróforo. Ou o ImageJ- ou intrínseca FIJI-função Bleach Correction (Imagem → Ajuste → Correção Bleach, escolha Histograma Matching) ou dedicasoftware ted 65 são sugeridas.
  6. Se o embrião foi gravado e / ou ao longo múltiplas direções e em vários canais de fluorescência, combinação horizontal das direções (Imagem → Pilhas → Ferramentas → Combine) e merge canal (Imagem → Cor mesclar → Canais) são recomendados.
  7. Registo e fusão de z-pilhas adquiridos ao longo múltiplas direcções 70, eventualmente, em combinação com desconvolução 71, permite o cálculo de imagens tridimensionais superiores de qualidade uniforme e isotrópico resolução. Ambos os plug-ins são de código aberto e pré-instalado em Fiji, mas eles exigem a presença de marcos (microesferas fluorescentes, por exemplo, contas) em torno da amostra.
  8. Estruturas de software de código aberto para grande escala de extração de dados quantitativos e análise também estão disponíveis, por exemplo, para a segmentação e rastreamento de núcleos de células 72 ou cell reconhecimento de forma 73.

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Resultados

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Este protocolo descreve um modelo experimental para imagiologia por fluoresccia de vida ou embriões Tribolium fixadas e coradas com LSFM. Devido aos baixos níveis de foto-branqueamento e foto-toxicidade, uma consequência directa da sua capacidade de seccionamento óptico, LSFM é particularmente bem adequado para imagens ao vivo a longo prazo.

O novo AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 linha transgénica expressa uma proteína d...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Controle de qualidade

Em ensaios de imagens ao vivo, o processo de preparação e de gravação deve ser não-invasivo, isto é, nem a mecânica e de manuseamento de produtos químicos (recolha, dechorionation, de montagem no suporte da amostra) nem a carga de energia integrada durante a observação deve afectar a viabilidade do espécime. Para estudos que caracterizam o desenvolvimento WT, recomenda-se usar dados apenas a partir de experimentos em que o embrião sobrevive o p...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Autor Contribuições

FS e EHKS concebeu a pesquisa. FS gerado as linhas AGOC transgénicos. imagiologia por fluorescência baseado em folha de luz foi realizado por FS e SK. FS e EHKS escreveu o manuscrito com a entrada de SK.

Agradecimentos

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Agradecemos Sven Plath para suporte técnico. A linhagem transgênica Glia-azul era um presente amável de Gregor Bucher (Göttingen, Alemanha). A pesquisa foi financiada pelo Cluster de Excelência Frankfurt am Main para Complexos Macromoleculares (CEF-MC, EXC 115, orador Volker Dötsch) concedido em parte para EHKS no Instituto Buchmann Molecular Ciências da Vida (BMLS, diretor Enrico Schleiff) no Goethe Universität Frankfurt am Main pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
farinha de trigo integralDemeter e.V.1.13E + 08EUA: farinha de trigo integral, Reino Unido: farinha integral
405 farinha de trigo finaDemeter e.V.1.13E+08EUA: farinha de pastelaria, Reino Unido: farinha macia
fermento seco inativoFlystuff / Genesee Scientific62-106
Saine tamponada com fosfato (PBS), pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010-023
hipoclorito de sódio, ~12% Cl ativoSigma Aldrich425044-250MLCuidado: o hipoclorito de sódio é uma
agarose corrosiva de baixo ponto de fusãoCarl Roth6351.2
Placa de 6 poçosOrange Scientific4430500
Placa de 24 poçosOrange Scientific4430300
capilares de vidro, internos e Oslash; 0,46 mmMarca GmbH + Co KG7087 09
SYTOX GreenThermo Fisher Scientific57020A preparação da solução de coloração é explicada na Tabela 2
Iodeto YOYO-1Thermo Fisher ScientificY3601A preparação da solução de coloração é explicada na Tabela 2
BOBO-3 IodetoThermo Fisher ScientificB3586A preparação da solução de coloração é explicada na Tabela 2
Alexa Fluor 488 FaloidinaThermo Fisher ScientificA12379A preparação da solução de coloração é explicada na Tabela 2
Alexa Fluor 546 FaloidinaThermo Fisher ScientificA22283A preparação da solução de coloração é explicada na Tabela 2
peneira, 800 µ m malhaVWR International200.025.222-051
peneira, 710 µ m malhaVWR International200.025.222-050para preparação do meio de crescimento (passo 1.1)
peneira, 300 µ m malhaVWR International200.025.222-040
peneira, 250 µ m malhaVWR International200.025.222-038para preparação de meio de postura de ovos (passo 1.2)
prato de vidro, Ø 100 mm &vezes; 20 mmSigma AldrichCLS70165102
pilha, 100 µ m tamanho da malhaBD Biosciences352360
pincel, cabeça e Oslash;VWR International149-2121
, 1,0 mLB. Braun Medical AG9166017V
Sigma AldrichM1152-1000EA
paraformaldeído (PFA)Sigma Aldrich158127Cuidado: o paraformaldeído é tóxico e corrosivo
N-heptano ≥ 99%Carl Roth8654.1Cuidado: o n-heptano é inflamável e tóxico
Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLCuidado: Trition X-100 é corrosivo
Seringa de 2 mm Frascos de cintilação

Referências

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