Aprovação do DNA Dye-desencadeada fenótipo de população lateral para detectar e purificar células-tronco de câncer de amostras biológicas

Resumo

Métodos que permitem a caracterização e isolamento de populações de células estaminais a partir de amostras biológicas são fundamentais para o avanço de células-tronco-alvo tratamentos em câncer e além. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de células estaminais do câncer usando o fenótipo de população lateral desencadeada por corante.

Resumo

O câncer é uma doença causada por células-tronco e a erradicação dessas células tornou-se um importante objetivo terapêutico. A decifração de vulnerabilidades de Células-Tronco de Câncer (CSCs) e a identificação de alvos moleculares adequados baseiam-se em métodos que permitem a sua discriminação específica em amostras heterogéneas, tais como linhas celulares e tecido tumoral ex vivo . Citometria de fluxo / FACS é uma tecnologia poderosa para multi-parametricamente dissecar amostras biológicas no nível de célula única e é até à data o método de escolha para recuperar células vivas para análises a jusante. Os marcadores de superfície tais como CD44 e CD133, bem como a detecção de actividade enzimática de aldeído desidrogenase, têm sido frequentemente utilizados para definir e separar CSCs de amostras de tumor por FACS. Uma abordagem complementar, aqui descrita em detalhe metodológico, utiliza a extrusão de corante funcional por transportadores de fármacos ABC, que identifica uma população distinta de células fluorescentes-dim vulgarmente designadas por população lateral (SP). SP, As células de cancro exibem características de células estaminais canónicas e podem ser anuladas e confirmadas funcionalmente utilizando agentes que inibem o transportador de fármaco de extrusão de corantes (mais frequentemente ABCB1 / P-glicoproteína / MDR1 / CD243 e ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Além disso, o ensaio SP é compatível com outras avaliações de citometria de fluxo, tais como coloração de antigénios de superfície, detecção de aldeído desidrogenase e discriminação de células mortas ( por exemplo , com 7-AAD ou iodeto de propídio (PI)). Assim, descrevemos um método valioso e amplamente aplicável para identificação, isolamento e sub-caracterização de CSC mecanisticamente baseado em um parâmetro funcional, e não fenotípico. Embora inicialmente realizado com Hoechst 33342 como corante desencadeante, aqui focalizamos o mais recente Violeta corante baseada em fenótipo SP que é resolvível em qualquer citómetro de fluxo equipado com uma fonte de laser violeta.

Introdução

A eficácia das terapias primárias contra o cancro melhorou substancialmente durante a última década devido aos avanços convincentes na compreensão genética e molecular da doença e ao advento de fármacos direccionados tais como anticorpos terapêuticos e inibidores de moléculas pequenas. Em contraste, a doença metastática e recorrente ainda é tipicamente incurável, ea morbidade e mortalidade permanecem altas nestes cenários clínicos. As CSCs representam uma subpopulação distinta dentro dos tumores e são dotadas de propriedades de células estaminais canónicas tais como clonogenicidade / tumorigenicidade, resistência a múltiplos fármacos e divisão celular assimétrica

Protocolo

Este protocolo está em total conformidade com as diretrizes padrão do Conselho Institucional de Revisão Ética. Se o tecido humano ou animal for investigado usando o protocolo descrito aqui, os pesquisadores são obrigados a ter aprovação do conselho de revisão relevante de sua instituição ou país.

Cuidado: As precauções padrão para o manuseio seguro de amostras biológicas aplicam-se a este protocolo. Isso inclui usar luvas e um jaleco, e realizar o trabalho sob um gabinete de biossegurança sempre que possível.

1. Preparação de Células

1. Linhas de células cancerosas
   1. Cultura de ....

Resultados

Ï¿½proporcionada uma an�ise SP espec�ica de c�ulas A2780, uma linha de c�ulas de cancro do ov�io humano anteriormente mostrada para abrigar um SP que representa menos de 1% de c�ulas ⁹ . As células foram cultivadas a 37 ° C em RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% ( v / v ), L-glutamina 2 mM e 1x penicilina / estreptomicina e colhidas a 85% de confluência utilizando tratamento com tripsina-EDTA a 0,05%. As c�ulas foram lavadas em PBS e filtra.......

Discussão

O progresso no manejo clínico do câncer também depende do desenvolvimento de modalidades de tratamento que visam as CSCs. Métodos que permitem o isolamento fiável de CSCs a partir de amostras biológicas irão acelerar a identificação de alvos adequados e são, portanto, de importância crítica neste esforço. SP é uma técnica estabelecida e valiosa para identificar populações de CSC que expressam transportadores de droga ABC e a implementação de DCV ampliou sua aplicabilidade a instrumentos de citometria de fluxo padrão. Me.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Vybrant DyeCycle Violet	Thermo Fisher Scientific	V35003	Pronto para usar
Cloridrato de Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629	Dissolver em etanol
Fumitremorgin C	Sigma-Aldrich	F9054	Dissolver em DMSO
7-AAD (ou iodeto de propídio - PI)	BioLegend	420403	Pronto para usar
Reagentes padrão de cultura de células (por exemplo, meio, FBS, L-glutamina, antibióticos, PBS, tripsina-EDTA, etc.)	Diferentes fornecedores
Amostras/células de interesse (por exemplo, linhagem celular de câncer humano ou murino, tecido tumoral humano ou murino)	Diferentes fornecedores
Instrumento de citometria de fluxo (FACS; analisador ou classificador de células)	Diferentes fornecedores		Fonte de laser violeta necessária
Tubos FACS (fundo redondo)	Diferentes fornecedores		Tubos com tampa recomendados
70 µ m filtros de corte	Diferentes fornecedores		Opcional, mas recomendado
Mistura de enzimas de digestão (por exemplo, colagenase/dispase/Dnase)	Diferentes fornecedores		Relevantes apenas para a dissociação tecidual
Anticorpos conjugados com flurocromo contra marcadores de superfície de interesse	Diferentes fornecedores		Kit
ALDEFLUOR	Tecnologias STEMCELL	01700	Opcional

opcional