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Avaliando o Fluxo Autofágico Medindo LC3, p62 e LAMP1 Co-localization Usando a Citometria de Fluxo de Imagem Multiespectral

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DOI:

10.3791/55637

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21 de julho de 2017

1Amnis Biology Department, MilliporeSigma

Neste artigo

Resumo

Aqui, a citometria de fluxo de imagem multiespectral com uma característica analítica que compara imagens de detalhes brilhantes de 3 marcadores de autofagia e quantifica sua co-localização, juntamente com a contagem de pontos LC3, foi usada para medir autofagia de forma objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta.

Resumo

A autofagia é uma via catabólica em que os componentes celulares normais ou disfuncionais que se acumulam durante o crescimento e a diferenciação são degradados através do lisossoma e são reciclados. Durante a autofagia, a proteína LC3 citoplasmática é lipidada e recrutada para as membranas autofagosomáticas. O autofagosoma, em seguida, se funde com o lisossoma para formar o autolisômio, onde ocorre a quebra da vesícula autofagosoma e seu conteúdo. A proteína p62 associada à ubiquitina, que se liga ao LC3, também é usada para monitorar o fluxo autofágico. As células submetidas a autofagia devem demonstrar a co-localização de p62, LC3 e marcadores lisossômicos. A microscopia de imunofluorescência tem sido utilizada para identificar visualmente LC3 puncta, p62 e / ou lisossomos por célula. No entanto, uma avaliação objetiva e estatisticamente rigorosa pode ser difícil de obter. Para superar esses problemas, a citometria de fluxo de imagem multiespectral foi utilizada juntamente com uma característica analítica que compara oImagens de cauda de três marcadores de autofagia (LC3, p62 e LAMP1 lisosomal) e quantifica sua co-localização, em combinação com a contagem de pontos LC3 para medir autofagia de forma objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta.

Introdução

Macroautophagy, a seguir denominada autofagia, é uma via catabólica em que componentes danificados ou disfuncionais, proteínas de longa vida e organelas são degradados através do lisossoma e são reciclados 1 . Autofagia é um processo dinâmico, de múltiplos passos, que envolve a formação de um autofagaço; A fusão do autofagosoma com o lisossoma, formando o autolisômio; E a degradação dos conteúdos do autolossossoma 2 . O marcador biológico crucial usado para identificar a autofagia em sistemas de mamíferos é a proteína leve 1A / 1B-cadeia leve 3 (LC3) associada aos microtúbulos, que compõe a membrana autofagosomática. Durante a autofagia, o LC3-1 citosólico é conjugado com fosfatidiletanolamina para formar LC3-II; O LC3-II é então incorporado na membrana autofagosomal 3 . Outro marcador amplamente utilizado para o fluxo autofágico é o receptor de autofagia sequestração 1 (SQSTM1, p62) que fisicamente liCarga autofágica nata para a membrana autofágica 4 , 5 .

Métodos tradicionalmente utilizados para medir a autofagia são manchas de Western e microscopia de fluorescência 7 . No entanto, nenhum desses métodos é considerado o "padrão-ouro" , 2 , 6 , pois há desafios associados a ambas as técnicas. Western blots apenas dá uma média porque eles usam uma amostra de homogeneizado, de modo que os observadores não podem ver o que está acontecendo em células individuais. Por outro lado, a microscopia de fluorescência dá uma informação de observador no nível de célula única, mas carece de capacidades de produção, dificultando a obtenção de avaliações objetivas e estatisticamente rigorosas. Nos últimos anos, a medição de LC3 e p62 por citometria de fluxo de imagem multiespectral (MIFC, veja a Tabela de Materiais ) vem ganhando popuLaridade devido ao seu poder quantitativo, capacidades de alto rendimento, potencial de multiplexação e capacidade de imagem de cada célula. Um dos métodos mais utilizados para medir autofagia usando MIFC, juntamente com o seu software de análise complementar (ver Tabela de Materiais ), é através da contagem local de LC3 puncta ou autofagosomas 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . No entanto, um aumento nos autofagosomas não significa necessariamente que haja um aumento na autofagia, pois também pode representar um bloqueio no processo 2 . O turnover LC3-II é um parâmetro útil para medir o fluxo autofágico através da análise de células na presença eAusência de um inibidor de degradação lisossômica, como a cloroquina. A cloroquina inibe a fusão do autofagosoma ao lisossoma, permitindo assim a quantificação da formação dos autofagosomas como medida do grau de autofagação ao suspender o fluxo autofágico antes da degradação lisossômica 18 . Além disso, p62 é degradado principalmente por autofagia, e se a degradação lisossômica do autofagosoma e seu conteúdo é bloqueada, espera-se uma acumulação de p62 17 , 19 .

Autophagy é um processo de vários passos, e a medida de LC3 ou p62 sozinho não fornece uma imagem completa do que está acontecendo nas células. Publicações recentes enfatizaram a necessidade de examinar a formação simultânea do autolossossoma 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC éApenas capaz de medir a formação do autolossossoma por imagem da co-localização do autofagosoma ao lisossoma 15 - 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 . Além disso, a co-localização de p62 e LC3 usando MIFC também foi explorada para medir o fluxo autofágico 5 . No software de análise referenciado, o "recurso" que mede a co-localização é chamado de "Bright Detail Similarity R3" (BDS) e foi especificamente projetado para comparar os detalhes da imagem pequena e brilhante de duas imagens. BDS é o coeficiente de correlação de Pearson transformado em log de pontos brilhantes localizados com um raio de 3 pixels ou menos; Em outras palavras, o BDS calcula o grau de oVerlapping pixels a partir de dois canais fluorescentes diferentes. Os pontos brilhantes estão correlacionados ( ou seja, a mesma localização espacial) ou não correlacionados ( ou seja, diferentes locais espaciais). Portanto, o coeficiente de correlação varia entre 0 (não correlacionado) e 1 (correlação perfeita). O coeficiente é log-transformado para aumentar o intervalo entre zero e infinito 26 , 27 . BDS sozinho pode não ser suficiente; Rajan et al. Descobriu que usar apenas BDS poderia levar a resultados falsos positivos ou falso-negativo 21 . BDS avalia a co-localização de dois marcadores de autofagia, mas não considera o número de autofagosomas. Para explicar o número de autofagosomas, Rajan et al. Incluiu a contagem local da LC3 puncta 21 . Rajan et al. Proposto usando um gráfico de dispersão bivariada da contagem de pontos LC3 versus BDS. Usando essa trama bivariada, duas populaçõesPrimeiro identificado: um com células com um alto nível de manchas de LC3 e uma com células com baixo nível de manchas de LC3. A população de pontos LC3 foi classificada em duas populações: células com baixa co-localização ( ou seja, acumulação de autofagosomas) e células com alta co-localização ( ou seja, acumulação de autolossossomos). Este gráfico bivariado permite distinguir entre células com muito poucos autofagosomas e células com acumulação de autofagosomas e / ou autolisossomas 21 .

Até agora, a co-localização simultânea de LC3, p62 e LAMP1 (marcador lisossômico) não era possível usando um único "Tipo de recurso" no software de análise complementar MIFC (veja a Tabela de Materiais ). No entanto, um novo recurso, recentemente introduzido na versão 6.1, é chamado Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 compara as imagens de detalhes brilhantes de cada uma das três imagens (neste caso, LC3, p62 e LAMP1) e quantifica a co-localização das três sondas ( ie, LC3, p62 e LAMP1). O recurso BDC3 calcula o coeficiente de correlação de Pearson modificado para se estender a três imagens. Como os pontos brilhantes nas três imagens estão correlacionados ou não correlacionados, o coeficiente de correlação varia entre 0 (não correlacionado) e 1 (correlação perfeita). O coeficiente é log-transformado para aumentar o intervalo dinâmico entre 0 e infinito. Ao mudar o recurso BDS com o recurso BDC3, o método de análise apresentado por Rajan et al. Agora pode incorporar os três marcadores mais utilizados para medir autofagia em um sistema ao mesmo tempo. A capacidade de co-localizar esses três marcadores de autofagia em um único ensaio pode levar a novos insights sobre a indução e regulação da autofagia. O protocolo a seguir descreve os passos para induzir autofagia em células Jurkat; Rotular as células com anticorpos LC3, p62 e LAMP1; Adquirir dados em um multispCitometro de fluxo de imagem ectral; E analise os dados para avaliar o fluxo autofágico.

Protocolo

1. Preparação de meio ambiente de cultura e inibidor de degradação lisossômica

  1. 1.1. Faça ~ 500 mL de meio de cultura 1x RPMI. Adicionar 5 mL de aminoácidos não essenciais do MEM (100x), 5 mL de piruvato de sódio (100 mM), 5 mL de penicilina-estreptomicina-glutamina (100x) e 25 mL de soro fetal bovino (FBS) a 500 mL Garrafa de RPMI - 1640 1x meio. O meio deve ser preparado em um gabinete de biossegurança. Armazene o meio de cultura RPMI a 2-8 ° C. Aquecer o meio de cultura RPMI até 37 ° C antes de adicioná-lo às células Jurkat.
  2. Faça 100 mM de cloroquina, o inibidor de degradação lisossômica. Pesar 0,05 g de sal de difosfato de cloroquina e adicioná-lo a 1 mL de água de classe de cultura de células em um tubo de centrífuga de 15 mL. Vortex até a cloroquina ter dissolvido.

2. Culturas de células

  1. Cultura 80 mL de células Jurkat clone E6-1 em meio de cultura RPMI a 37 ° C e 5% de CO 2 .
    NOTA: Ao cultivar célulasOu trabalhando com as células Jurkat antes da fixação, todo o trabalho deve ser feito no gabinete de biossegurança.
  2. Antes de induzir a autofagia, conte as células Jurkat usando um hemocitómetro ou outro dispositivo de contagem de células para determinar as células / mL.

3. Induzindo Autophagy in Cells

  1. Pegue as células Jurkat em fase de crescimento exponencial e divida-as em quatro amostras de 20 mL cada uma em tubos de centrífuga de 50 mL. Rotule os tubos como "Controle", "Controle + Cloroquina", "Abençoado" e "Abatido + Cloroquina".
    NOTA: As células Jurkat devem ter uma concentração de 2,5-5 x 10 5 células / mL.
  2. Lave as células adicionando 30 mL de solução de sal equilibrada de Hank sem Ca 2+ ou Mg 2+ (HBSS) para cada amostra. Centrifugar a 250 xg por 10 min. Despeje o sobrenadante para um vaso de lixo.
  3. Ressuspender as amostras de controle em 20 mL de meio de cultura RPMI por pipetagem para cima e para baixo usando 25 mL sPipeta descartavel de terapeu to seguida pela realização de vortex de luz. Da mesma forma, ressuspenda as amostras famintas em 20 mL de solução de sal equilibrada de Earle sem Ca 2+ ou Mg 2+ (EBSS).
  4. Usando uma pipeta descartável estéril de 25 mL, transfira o controle e as amostras famintas para os frascos T75 que foram rotulados como "Controle", "Controle + Cloroquina", "Abençoado" e "Abatido + Cloroquina".
  5. Adicione 20 μL de cloroquina 100 mM aos 20 mL de meio de cultura celular nos frascos "Control + Chloroquine" e "Starved + Chloroquine". Misture a cloroquina girando suavemente o frasco. Coloque todos os frascos em uma incubadora de 37 ° C e 5% CO 2 durante 2 h.

4. Preparação de buffers para a fixação e rotulagem de LC3, LAMP1 e p62

  1. Prepare 10 mL de solução de fixação de formalina a 4% em PBS. Adicione 4 mL de 10% de material de formalina a 1 mL de 10x Dulbecco's Phosphate-BufferedSolução salina sem Ca 2+ ou Mg 2+ (PBS) e 5 mL de água ultrapura em um tubo de centrífuga de 15 mL.
    NOTA: CUIDADO. Formalina / formaldeído é tóxico se inalado ou engolido; É irritante para os olhos, sistema respiratório e pele; E pode causar sensibilização por inalação ou contato com a pele. Existe um risco de dano grave aos olhos. É um potencial cancerígeno.
  2. Prepare 10 mL de solução de ressuspensão final de formalina a 1% em PBS. Adicione 1 mL de 10% de formalina a 9 mL de 1x PBS num tubo de centrífuga de 15 mL.
  3. Preparar 500 mL de tampão de lavagem adicionando 10 mL de FBS a um frasco de 500 mL de 1x PBS.
  4. Preparar 50 mL de tampão de permeabilização em um tubo de centrífuga de 50 mL adicionando 0,5 mL de Triton X-100 a 10% ao tampão de lavagem 49,5 mL preparado no passo 4.3.
  5. Preparar uma solução de trabalho de tampão de permeabilidade / anticorpo anti-SQSTM1 / p62-Alexa 488 (AF488), adicionando 5 μL de anti-SQSTM1 / p62-AF488 a 495 μL do buffer de permeabilização feito em s4.4 4.4. Certifique-se de que a concentração final de anticorpos seja de 5 μg / mL.
    NOTA: Faça solução de trabalho de buffer de permeabilização de anticorpos antes de adicioná-la à amostra. Proteja a solução da luz.
  6. Prepare a solução de trabalho do tampão de permeabilização do mouse anti-LC3 / aderindo 5 μL de anti-LC3 do mouse a 495 μL do tampão de permeabilização feito no passo 4.4. Certifique-se de que a concentração final de anticorpos seja de 20 μg / mL.
    NOTA: Faça soluções de trabalho de tampão de permeabilização de anticorpos antes de adicioná-lo à amostra. Proteja a solução da luz.
  7. Prepare a solução de trabalho do tampão anti-mouse-Alexa 647 (AF647) / tampão de permeabilização adicionando 5 μL de IgG anti-rato com burro AF647 marcado a 495 μL do tampão de permeabilização feito no passo 4.4. Certifique-se de que a concentração final de anticorpos seja de 20 μg / mL.
    NOTA: Faça a solução de trabalho de tampão de permeabilização de anticorpos imediatamente antes de adicioná-la à amostra. Proteger tEle é a solução da luz.
  8. Preparar uma solução de trabalho de tampão de permeabilização de anticorpo anti-CD107a (LAMP1) -PE humano adicionando 25 μL de anti-CD107a (LAMP1) -PE a 475 μL do tampão de permeabilização preparado no passo 4.4. Certifique-se de que a concentração final de anticorpos seja de 21 μg / mL.
    NOTA: Faça a solução de trabalho de tampão de permeabilização de anticorpos imediatamente antes de adicioná-la à amostra. Proteja a solução da luz.
  9. Prepare a mancha nuclear DAPI 10x adicionando 4 μL de DAPI 5 mg / mL e 100 μL de 10% triton X-100 a 896 μL de 1x PBS.

5. Rotulagem das células Jurkat com LC3, LAMP1 e p62

  1. Remova 2 x 10 6 células por amostra (conte as células como no passo 2.2). Coloque cada amostra em um tubo de centrífuga de 15 ml que tenha sido rotulado com o nome da amostra apropriado ( isto é, Controle, Controle + Cloroquina, Fome ou Fome + Cloroquina).
    1. Adicione o buffer de lavagem para que euVolume total de 15 mL em cada tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar as amostras a 250 xg por 10 min. Aspirar o sobrenadante.
  2. Adicione 100 μL de solução de fixação de formalina a 4% a cada uma das pastilhas celulares. Resuspenda por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta P200. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Durante o passo de fixação, transfira as amostras para tubos de microcentrífuga de polipropileno siliconados rotulados.
    NOTA: Não repare demais as células; Isso pode resultar em resultados de rotulagem ruins.
  3. Após o passo de fixação de 10 min, adicione 1 mL de tampão de lavagem a cada amostra. Pipetar para cima e para baixo com uma pipeta P1000 para misturar a amostra. Centrifugar a 250 xg por 5 min. Aspirar o sobrenadante.
  4. Adicione 100 μL de anticorpo anti-SQSTM1 / p62 - AF488 / solução de trabalho de buffer de permeabilização para cada amostra. Resuspenda por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta P200. Incube durante 30 min no escuro a temperatura ambiente.
  5. Lave as células adicionando 1 mL deBuffer de permeabilização para cada amostra. Pipetar para cima e para baixo com uma pipeta P1000 para misturar a amostra. Centrifugar a 250 xg por 5 min. Aspirar o sobrenadante.
  6. Repita as etapas 5.4-5.5 para cada uma das soluções de trabalho de anticorpos.
    NOTA: As soluções de trabalho de anticorpos são a solução de trabalho de tampão de permeabilização de mouse anti-LC3, solução de trabalho de tampão de permeabilização de burro anti-mouse - AF647 / permeabilização e solução de trabalho de tampão de permeabilização de anticorpo de CD107a (LAMP1) - PE. Cada anticorpo deve ser feito separadamente e na ordem listada. A ordem foi escolhida para minimizar a reatividade cruzada indesejada entre anticorpos.
  7. Adicione 100 μL de solução de formalina a 1%. Resuspenda por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta P200. Adicione 10 μL da mancha nuclear DAPI 10x a cada amostra. Vorteie levemente cada amostra para misturar. Incube durante 10 minutos no escuro a temperatura ambiente antes de executar qualquer uma das amostras no instrumento.
    NOTA: Neste ponto, a amostra pode ou bE é executado no MIFC ou armazenado protegido da luz a 2-8 ° C por até uma semana.

6. Rotulagem dos controles de uma única cor

  1. Para cada controle de cor única ( ou seja, AF488, PE, AF647 e DAPI), tome 1 x 10 6 células Jurkat, que podem ser de qualquer uma das populações da amostra. Coloque 1 x 10 6 células em tubos de centrífuga de 15 mL rotulados como AF488, PE, AF647 ou DAPI.
  2. Adicione um buffer de lavagem de modo que haja um volume total de 15 mL em cada tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar as amostras a 250 xg por 10 min. Aspirar o sobrenadante.
  3. Adicione 100 μL de tampão de lavagem aos tubos AF488, PE e AF647.
    NOTA: Para o tubo DAPI, vá para o passo 6.8.
    1. Resuspenda por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta P200. Transferir para tubos de 1,5 mL.
  4. Adicione 5 μL de anti-CD45-AF488, anti-CD45-PE ou anti-CD45-AF647 nos tubos AF488, PE ou AF647, respectivamente. Misture vortexing lIghtly.
  5. Incube os tubos AF488, PE e AF647 durante 30 min no escuro à temperatura ambiente.
    NOTA: Outros marcadores podem ser usados, como LC3, p62 e anticorpos LAMP-1 em vez de anticorpos anti-CD45. No entanto, o CD45 é um marcador confiável para controles de uma única cor.
  6. Lave as células AF488, PE e AF647 adicionando 1 mL de tampão de lavagem a cada amostra.
    1. Pipetar para cima e para baixo com uma pipeta P1000 para misturar a amostra. Centrifugar a 250 xg por 5 min. Aspirar o sobrenadante.
  7. Adicione 100 μL de solução de formalina a 1%. Resuspenda por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta P200.
    NOTA: Neste ponto, a amostra pode ser executada no MIFC ou armazenada protegida da luz a 2-8 ° C por até uma semana.
  8. Adicione 100 μL de solução de fixação de formalina a 1% ao tubo DAPI.
    1. Resuspenda por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta P200. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
    2. Adicione 101; L de 10x DAPI mancha nuclear para a amostra DAPI. Vortex levemente para misturar. Incube durante 10 min no escuro a temperatura ambiente antes de correr no instrumento.
      NOTA: Neste ponto, a amostra pode ser executada no MIFC ou armazenada protegida da luz a 2-8 ° C por até uma semana.

7. Iniciando e Calibrando o MIFC

  1. Certifique-se de que os recipientes da geléia, do reagente de calibração do sistema (ver tabela de materiais ), dobrador, limpador e esterilizador estão cheios e o tanque de resíduos está vazio. Caso contrário, encha os recipientes e esvazie o tanque de lixo.
  2. Ligue o sistema e clique duas vezes no ícone do software (veja o Quadro de Material s) para iniciar o aplicativo; Isso iniciará o software MIFC.
  3. Clique no botão Iniciar e verifique se Iniciar todas as calibrações e testes estão selecionados. Isso irá liberar o sistema, bainha de carga, reagente de calibração do sistema,E calibre o sistema.

8. Executando as Amostras e controles de uma única cor no MIFC

  1. Carregue o modelo padrão indo na guia Arquivo e selecione Carregar modelo padrão .
    NOTA: O modelo padrão contém os lotes de ponto de pixel máximo crus.
  2. Ligue os lasers 488 nm, 405 nm, 642 nm e SSC clicando nos respectivos botões. Defina a potência do laser inserindo a potência desejada ao lado de cada botão laser. Veja a Figura 1 .
    NOTA: Para esta experiência, os poderes do laser são 200 mW, 20 mW, 150 mW e 5 mW (Ch06) para os 488 nm, 405 nm, 642 nm e SSC, respectivamente. A ampliação de modelo padrão MIFC definida para 40X, a sensibilidade padrão é oi e todos os canais estão habilitados.
  3. Confirme se o controle deslizante de ampliação está configurado para 40X, o modo de alta sensibilidade é selecionado e todos os canais estão mostrados na galeria de imagens; figura 1 mostra as configurações de instrumentos usadas nesta experiência.
  4. Carregue a amostra "Starved + Chloroquine" clicando no botão Carregar e carregando o tubo de 1,5 mL no instrumento.
    NOTA: Esta amostra experimental deve ter o sinal mais alto de todas as amostras para AF488, PE e AF647 (o sinal DAPI deve ter aproximadamente a mesma força de sinal para todas as amostras experimentais, incluindo a amostra "Starved + Chloroquine").
  5. Use a amostra "Starved + Chloroquine" para confirmar que os poderes laser apropriados para os lasers 488 nm, 405 nm, 642 nm e SSC estão configurados. Use os gráficos de pontos de pixels máximos crus do modelo padrão para ajustar os poderes do laser para que os sinais sejam fortes, mas não alcancem um valor de pixel máximo bruto de 4.096, o que satura a câmera CCD no instrumento. Use esta configuração de laser para todas as amostras experimentais.
  6. Clique no ícone Criar Dot Plots para criar um novo gráfico de pontos. Selecione "Area_M01 "no eixo X e" Aspect Ratio_M01 "no eixo Y para a população" todos ". Clique no ícone Criar Região do Polígono . Desenhe uma região ao redor das células. Nomeie esta região" Celda ".
    NOTA: Os usuários podem adicionar parcelas e regiões adicionais para reduzir as células que estão sendo coletadas. Um argumento adicional comum para adicionar seria Gradient RMS para identificar células que estão em foco.
  7. Defina os parâmetros de aquisição. Especifique o nome do arquivo e a pasta de destino, altere o número de eventos para "5.000" e selecione a população de coleção "Celular". Clique no botão Adquirir para adquirir o arquivo. Depois de coletar o arquivo, retornar a amostra clicando no botão Retornar . Remova o tubo de amostra do instrumento.
  8. Para as próximas três amostras ("Starved", "Controle" e "Controle + Cloroquimia"), carregue a amostra, insira o nome da amostra, adquira a amostra e retorne a amostra usando as mesmas configurações quePara a amostra "Starved + Chloroquine", acima.
  9. Depois que as amostras foram adquiridas, execute as amostras de controle de uma única cor e obtenha dados para que uma matriz de compensação possa ser feita. Desligue o laser SSC clicando no botão SSC . Desligue os canais do campo claro clicando no botão Brightfield e selecionando OFF .
    NOTA: Se os canais foram removidos da galeria de imagens para aquisição de amostra experimental, reative todos os canais. Alternativamente, os controles de uma única cor podem ser adquiridos clicando na guia Compensação e selecionando Criar Matriz ; Isso abre o assistente de compensação, que passará pela etapa de colecionar arquivos e fazendo uma matriz de compensação.
  10. Carregue o controle de cor única DAPI clicando no botão Carregar e carregando o tubo de 1,5 mL no instrumento. Digite o nome da amostra (somente DAPI), defina a população da coleção como "Tudo" e altere o número do eventoS para "500".
    1. Clique no botão Adquira para adquirir o arquivo de controle de uma única cor.
    2. Quando a coleção do arquivo estiver completa, devolva a amostra clicando no botão Retornar . Remova o tubo de amostra do instrumento.
    3. Após a amostra DAPI, carregue 10% de alvejante, tal como uma amostra, clicando no botão Carregar e carregando 100 μL de 10% de alvejantes em um tubo de 1,5 mL. Deixe a amostra correr para ~ 15 s. Isso removerá qualquer DAPI residual do tubo.
    4. Execute 100 μL de 1x PBS, conforme feito em 8.10.3, para remover o lixívia residual de 10%. O instrumento agora está pronto para executar os controles AF488, PE e AF647 de uma única cor.
    5. Repita as etapas 8.10-8.10.2 para cada um dos controles de uma única cor ( ou seja, AF488, PE e AF647).
      NOTA: Não há necessidade de executar 10% de alvejante ou PBS entre essas amostras, somente após o controle DAPI de uma única cor.

9. Análise de dados no MIFC AnSoftware de análise

  1. Inicie o software de análise MIFC (consulte a Tabela de Materiais ).
  2. Clique em Iniciar análise para iniciar o Assistente de arquivo aberto . Selecione o arquivo de dados para abrir navegando no arquivo de imagem em bruto "Starved + Chloroquine" (.rif). Selecione o arquivo e clique no botão Abrir . Clique em Avançar .
    1. Aplicar compensação. Selecione uma matriz de compensação criada anteriormente e clique em Avançar . Alternativamente, faça uma nova matriz de compensação clicando no botão Nova Matriz .
      NOTA: Etapas 9.2.1.1-9.2.1.2 são as etapas para criar uma nova matriz.
      1. Adicione os arquivos de controle de cor única (somente DAPI , somente AF488, somente PE e AF647) na lista Arquivos de Controle , clicando em Adicionar Arquivos , selecionando os arquivos e clicando no botão Abrir . Clique em Avançar .
      2. A janela Criar Matriz de Compensação aparecerá para esta experiência. EnsurE que Ch02, Ch03, Ch07 e Ch11 estão selecionados e clique em Avançar . A matriz de compensação será criada. Clique em Concluir para salvar a matriz de compensação. Adicione o arquivo de compensação ao Assistente de arquivo aberto e clique em Avançar .
    2. Aplique o modelo de análise. Nesta fase, não há modelo de análise a aplicar, então clique em Avançar .
      NOTA: Para os outros arquivos experimentais, este arquivo "Starved + Chloroquine.daf" pode ser usado como um modelo.
    3. Nomeie o arquivo (os nomes dos arquivos que correspondem aos nomes "rif" são gerados automaticamente) e clique em Avançar . Defina as propriedades de exibição de imagem selecionando os canais "02," "03", "07" e "11"; Os canais 01, 06 e 09 são pré-selecionados. Clique em Avançar .
  3. No final do Assistente de Arquivo Aberto , selecione o Assistente de Apoptosis . Clique no ícone do Assistente de Apoptosis e depois emO botão Selecionar assistente para abrir o Assistente de apoptosis .
    1. Selecione o canal de imagem nuclear (Ch07) e clique em Avançar . Coloque as células no melhor foco. Clique no ícone Criar linha de região e desenhe uma região no Gradient RMS_M01_Ch01 de 60-90. Nomeie esta região "Foco", clique em OK e clique em Avançar .
    2. Coloque as células individuais. Clique no ícone Criar região do polígono . Desenhe uma região em torno das células individuais, nomeie a região "Único", clique em OK e clique em Avançar . Clique em Não para "Você quer analisar subpopulações?"
    3. Porta as células nucleadas. Clique no ícone Criar linha de região e desenhe uma região que inclua todas as células nucleadas. Nomeie a região "Nucleated". Clique em OK e em Avançar .
    4. Coloque as células apoptóticas. Clique no ícone Criar região do polígono . Desenhe uma região ao redor das células apoptóticas; Estas são célulasCom baixa área nuclear_T50% e alto contraste em campo brilhante. Clique em Concluir . Adicione uma segunda região clicando no ícone Criar região do polígono e desenhando uma região em torno das células não apoptóticas; Ligue para esta região "Células".
  4. Selecione as células que são positivas para LAMP1, p62 e LC3. Clique no ícone Building Blocks , selecione Fluorescence Positives - One Color e selecione a população "Cells" e Intensity_MC_Ch03 . Rotule o X-Axis "Intensity LAMP1". Desenhe uma região que inclua células com intensidades superiores a 10 000, clicando no ícone Criar linha de região e desenhando a região. Rotule esta região "LAMP1 +". Siga os mesmos passos que em 9.4 para selecionar células positivas para p62 e LC3.
    1. Para p62 + selecione a população "LAMP1 +" e Intensity_MC_Ch02 . Rotule o X-Axis "Intensity p62" e a região de células p62 + "LAMP1 + / p62 +".; Para o LC3 +, selecione a população "LAMP1 + / p62 +" e Intensity_MC_Ch11. Rotule o X-Axis "Intensity LC3" e a região das células LC3 + "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". Use esta população "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" para o resto da análise.
  5. Crie um recurso de contagem instantânea para contar os pontos LC3.
    NOTA: Isso deve ser criado usando a amostra "Starved + Chloroquine".
    1. Clique na aba Análise e selecione Máscara . Clique no botão Novo e depois no botão Função . Em Função , selecione Peak ; Máscara , selecione M11 ; E Channel , selecione Ch11 . Defina a relação de fundo do ponto para celular para 4 . Clique em OK para fechar a janela Define Mask Function e OK para adicioná-lo à lista Mask . Clique em Fechar para sair do Mask Manager .
    2. Clique na guia Análise e selecione Características. Clique no botão Novo . Em Tipo de recurso , selecione Contagem de pontos e sob Máscara , selecione Peak (M11, Ch11, Bright, 4). Digite "Spot Count LC3" para o Nome e clique em OK e Fechar para sair do Gerenciador de Recursos .
      NOTA: O assistente Spot também pode ser usado para criar um recurso de contagem de pontos. O recurso de contagem de pontos utilizado neste experimento pode não ser apropriado para outras experiências e / ou linha celular. O usuário deve testar várias máscaras / características de contagem de pontos ao decidir sobre uma máscara / recurso para um conjunto de dados específico. Pugsley 2017 possui detalhes adicionais sobre contagem de pontos utilizando o software de análise MIFC 26 .
    3. Clique no ícone Novo Histograma . Selecione a população "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". Selecione o recurso Spot Count LC3 e clique em OK .
  6. Crie o recurso BDC3.
    1. CLambe a guia Análise e selecione Recursos . Clique no botão Novo . Em Tipo de recurso , selecione Colocalização de detalhes brilhantes 3 ; Máscara , selecione MC ; Imagem 1 , selecione Ch02 (p62); Imagem 2 , selecione Ch03 (LAMP1); E eu mago 3 , selecione Ch11 (LC3). Digite "BDC3 p62 / LAMP1 / LC3" para o Nome e clique em OK e Feche para sair do Gerenciador de recursos .
    2. Clique no ícone Novo Histograma . Selecione a população "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". Selecione o recurso BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 e clique em OK .
  7. Clique no ícone New Scatterplot . Selecione a população "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". Selecione BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 para o eixo X. Selecione a função LC2 de contagem de pontos para o eixo Y. Clique em OK .
  8. Salvar thE arquivo "Starved + Chloroquine". Clique em Arquivo e selecione Salvar arquivo de análise de dados (.daf) . Clique em Salvar e Sim para substituir a versão anterior do arquivo; Este arquivo agora pode ser usado como um modelo.
  9. Abra o arquivo "Controle". Clique em Arquivo e depois em Abrir . Selecione o arquivo "Control.rif" e clique em Abrir . Selecione a matriz de compensação da etapa 9.2.1 e o arquivo "Starved + Chloroquine.daf" como o modelo. Clique em OK .
  10. Crie regiões para acumulação de autofagosoma e acumulação de autolisomosoma usando a amostra "Controle" para definir as regiões.
    1. Clique no ícone Create Rectangle Region . Desenhe uma região a partir de coordenadas X de -0,1 a 3 e coordenadas Y de 1,5 a -0,3. Nomeie esta região "Low Spots". Clique no Criar ícone Rectangle Region . Desenhe uma região das coordenadas X de -0.1 para 1 e Y-coordenaçãoÉ de 17,5 a 1,5. Nomeie esta região "High Spot / Low BDC3".
    2. Clique no ícone Create Rectangle Region. Desenhe uma região a partir de coordenadas X de 1 a 3 e coordenadas Y de 17,5 a 1,5. Nomeie esta região "High Spots / High BDC3".
  11. Salve o arquivo "Controle". Clique em Arquivo e selecione Salvar arquivo de análise de dados (.daf ) . Clique em Salvar e Sim para substituir a versão anterior do arquivo; Este arquivo agora pode ser usado como um modelo.
  12. Abra o arquivo "Controle + Cloroquina" clicando em Arquivo e depois em Abrir . Selecione o arquivo "Control + Chloroquine.rif" e clique em Abrir . Selecione a matriz de compensação da etapa 9.2.1 e o arquivo "Control.daf" como o modelo. Clique em OK . Repita isso para os arquivos "Starved" e "Starved + Chloroquine".
    NOTA: A função de lote no software de análise também pode ser usada para aplicar a compensaMatriz de matriz e / ou modelo para os outros arquivos. A estratégia de gating final é mostrada na Figura 2 .

Resultados

Este método de análise utiliza múltiplos recursos para avaliar o fluxo autofágico. A fim de compreender completamente a parcela final bivariada, as características de análise individuais devem primeiro ser investigadas. A contagem de autofagosomas é uma maneira lógica de medir autofagia; No entanto, o tamanho / forma / brilho de LC3 puncta pode variar drasticamente entre as células. A variação pode dificultar a contagem de autofagosomas manualmente ou o uso de um recurso de contagem de pontos no software de análise. Portanto, nenhuma característica de contagem de pontos será perfeita devido a essa grande variabilidade nos autofagosomas. No entanto, um bom recurso de contagem de pontos funcionará na maioria das células 26 . A Figura 3 mostra exemplos de mascaramento em pontos de LC3 puncta em células Jurkat usando diferentes máscaras de pontos. O recurso de contagem de pontos selecionado para este conjunto de dados é Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, o que significa que o recurso de contagem de pontos contou os pontos que o peMáscara ak identificada dentro da máscara do canal 11 padrão (M11) no canal 11 (Ch11-LC3-AF647) com uma relação de fundo de ponto a célula de 4 (Bright, 4). A Figura 4 mostra histogramas de contagem de pontos e imagens representativas para a contagem média de pontos para as células Jurkat de Controle, Controle + Cloroquina, Abandonado e Amido ou Chloroquina, marcadas com anti-LC3-AF647. As contagens de pontos médios controlados e famintos não são significativamente diferentes; Com a adição de cloroquina, há uma grande diferença na média do Controle + Cloroquina em comparação com o Starved + Chloroquine.

O próximo recurso a investigar é BDC3. BDC3 é uma medida da co-localização de três marcadores / sondas, neste caso, LC3, p62 e LAMP1. A Figura 5A - 5D mostra os histogramas BDC3 para as células Controk, Control + Chloroquine, Starved e Starved + Chloroquine Jurkat marcadas com anti-p62-AF488, Anti-LAMP1-PE e anti-LC3-AF647. Há uma mudança entre a média de Controle para a média de Starved, bem como o significado de Control + Chloroquine para a média de Starved + Chloroquine. No entanto, olhando para as imagens das células dos escores BDC3 médios na Figura 5E - 5H , há uma diferença maior entre as amostras do que os histogramas podem levar a acreditar. Isso ocorre porque o BDC3 não considera o número de organelas autofágicas que co-localizam, resultando em um grande grau de variabilidade no número de autofagosomas para o mesmo escore BDC3. Na maioria dos casos, existe uma sobreposição entre as três sondas porque, mesmo nos níveis basais, p62, LAMP1 e LC3 devem, até certo ponto, co-localizar ou residir em regiões similares nas células. Como contraste, um exemplo de três sondas que não devem co-localizar são anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 e tintura nuclear DAPI para a amostra Starved + Chloroquine, mostrada na Figura 6.

Quando o recurso de contagem de pontos e o recurso BDC3 são combinados, a presença de diferentes subpopulações que melhoram a capacidade de distinguir entre as várias amostras / condições são evidentes. A Figura 7 mostra o gráfico bivariado de contagem de pontos de LC3 versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 para as quatro amostras: Controle, Controle + Cloroquina, Abdomina e Morto de Fome + Cloroquina. A amostra de controle foi usada para definir a estratégia de bloqueio para três populações: Pontos baixos, Pontos altos / BDC3 baixo e Pontos altos / Alto BDC3. As amostras de Controle demonstraram que mais de 98% das células tinham 1 ou menos manchas. O limite entre High Spots / Low BDC3 e High Spots / High BDC3 foi ajustado para um escore BDC3 de 1, porque mais de 91% da amostra Control teve um escore BDC3 inferior a 1. Um resumo dos resultados para as parcelas bivariadas É mostrado na Tabela 1 .

Idade = "1"> figure-results-1
Figura 1: Configuração do instrumento MIFC. Uma captura de tela das configurações do instrumento MIFC usadas para esta experiência, delineada na etapa 8 do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Estratégia de Gating de Software de Análise. Uma captura de tela do esquema de controle de software de análise, delineada no passo 9 do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fig3.jpg "/>
Figura 3: Mascaramento de pontos LC3. Imagens e máscaras de células Jurkat usadas para criar o recurso de contagem de pontos. Mostra-se BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647 , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) e Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1). A máscara que funcionou melhor para todas as células mostradas foi Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 4: Histogramas de contagem de pontos LC3. Usando o recurso de contagem local Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 e os histogramas de contagem de pontos LC3-AF647 para Controle ( A , azul claro), Controle + CloroquinoE ( B , azul), faminto ( C , rosa) e Starved + Cloroquina ( D , vermelho). O ponto médio conta para Controle, Controle + Cloroquina, Fome e Fome + Cloroquina são 0,07, 1,13, 0,10 e 2,77, respectivamente. BF, LC3-AF647 (vermelho), tintura nuclear DAPI (azul) e um composto das imagens LC3-AF647 e DAPI de células representativas para a contagem média de pontos são mostrados para Controle ( E , 0 pontos), Controle + Cloroquina ( F , 1 ponto), faminto ( G , 0 pontos) e Starved + Chloroquine ( H , 3 pontos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 5: Histogramas BDC3 de p62 / LAMP1 / LC3. Histogramas BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 paraControle ( A , azul claro), Controle + Cloroquina ( B , azul), Abatido ( C , rosa), e Fome + Cloroquina ( D , vermelho). O escore BDC3 médio para Controle, Controle + Cloroquina, Fome e Fome + Cloroquina é 0,57, 0,82, 0,74 e 0,98, respectivamente. BF; P62-AF488 (verde); LAMP1-PE (amarelo); LC3-AF647 (vermelho); E um composto das imagens p62-AF488, LAMP1-PE e LC3-AF647 de células representativas para o BDC3 médio são mostrados para Controle ( E ), Controle + Cloroquina ( F ), Starved ( G ) e Starved + Cloroquina ( H ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 6: Histogramas BDC3 de p62 / LC3 / DAPI para Amostragem + Chloroquina Amostra. ( A ) O histograma BDC3 p62 / LC3 / DAPI para a amostra Starved + Chloroquine é mostrado. O resultado médio do BDC3 é de 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (verde); LC3-AF647 (vermelho); DAPI (azul); E um composto das imagens p62-AF488, LC3-AF647 e DAPI de células representativas para o BDC3 médio é mostrado para a amostra Starved + Chloroquine. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 7: Gráficos Bivariados de LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Parcelas bivariadas da contagem de pontos LC3 versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 para células ControK, Control + Chloroquine, Starved e Starved + Chloroquine Jurkat. ( B ) BF; P62-AF488 (verde); LAMP1-PE (amarelo); LC3-AF647 (vermelho); E um composto das imagens p62-AF488, LAMP1-PE e LC3-AF647 de três regiões (por exemplo , Pontos baixos, Pontos altos / BDC3 baixo e Pontos altos / Alto BDC3) são mostrados para a amostra Starved + Chloroquine. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Contagem de células Colocalização brilhante de detalhes 3 significa Contagem de pontos LC3 Mean % Low Spot % High Spot / Low BDC3 % High Spot / High BDC3
Ao controle 439 0,57 0,07 98.2 1.8 0,0
Controle + Cloroquina 1432 0,82 1.13 68,9 19,5 11.7
Morrendo de fome 1204 0,74 0,10 98.4 0,6 1.0
Abatido + Cloroquina 1811 0,98 2.77 32.1 36,9 31.0

Tabela 1: Resumo do Jurkat LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariada Trama

Discussão

Ao realizar essa análise, há algumas coisas a considerar. É importante ter amostras de controle apropriadas. Para esta experiência, foram utilizados dois controles diferentes: Controle e Controle + Cloroquina. A amostra de controle foi usada para definir o limite para as regiões. Representa o nível basal de autofagia sem interromper a degradação lisossômica e é o controle da amostra Amimada. No entanto, a amostra de Controle não é um controle apropriado para comparar com os resultados da Amostra de Fome e Chloroquina porque a cloroquina em si influencia a amostra de controle. Portanto, era necessário ter uma amostra de Controle + Cloroquina.

Antes de realizar qualquer análise para autofagia, é importante analisar / colocar em células únicas que estão em foco ( ou seja, RMS de gradiente superior a 60), pois os resultados podem ser afetados se houver mais de uma célula ou as imagens forem fora de foco. É crucial que a autofagosomEs e os lisosomas estão em foco para contagem adequada de pontos e análise BDC3. As células apoptóticas devem ser removidas antes da análise de autofagia, uma vez que podem diminuir os resultados e não devem ser incluídas. Deve haver manchas apropriadas para os três marcadores ( ie, LC3, p62 e LAMP1). Por exemplo, os três marcadores são intracelulares e devem ter um sinal pontual; Se o sinal não for pontual, ou se estiver na superfície da célula, a coloração não seria apropriada e a experiência / coloração deve ser refeita. Além disso, para BDC3 ser preciso, é essencial para o portão em células que são brilhantes para os três marcadores fluorescentes de interesse. É necessário ativar eventos positivos para evitar a medição de BDC3 em elementos não vinculativos, artefatos de imagem e / ou ruído. Isso é crucial, pois o BDC3 pode potencialmente amplificar os artefatos que não são sinais verdadeiros. Uma vez que BDC3 só pode ser realizado em eventos positivos brilhantes, muitas células podem não ser incluídas na análise final; Isto é especRealmente é verdade para células de controle que não possuem acumulação de LC3, p62 e / ou LAMP1. Assim, uma limitação deste ensaio é que BDC3 apenas examina as células que são positivas para os três marcadores, o que pode não ser apropriado para todas as experiências de autofagia.

Como o BDS, que foi relatado anteriormente 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , o BDC3 sozinho não leva em consideração o número de organelas autofágicas que co-localizam, resultando em grande medida De variabilidade no número de autofagosomas. Portanto, a abordagem bivariada apresentada por Rajan et al. estava empregado. Olhando para as parcelas bivariadas, pode-se perguntar seAs células devem ser positivas para LC3, p62 e LAMP1; Por que existem tantas células que têm 0 pontos? Isso ocorre porque o sinal LC3 pode ser suficientemente brilhante para co-localização, mas pode não atingir o limite definido pela máscara de pico (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) necessário para que seja considerado um local.

O protocolo apresentado aqui usou o MIFC para contar LC3 puncta e a co-localização de três marcadores de autofagia para medir o fluxo autofágico. Em condições basais (amostra de controle), o número de autofagosomas foi baixo e poucas células foram encontradas com "Pontos altos". Com a adição de cloroquina, que inibe a fusão de autofagosoma / lisossoma, houve um aumento no número de manchas de LC3. Uma vez que o lisossoma é incapaz de quebrar o autofagosoma e o p62, que reside no autofagosoma, isso leva a um aumento na co-localização do acúmulo de autolossomosoma LC3, p62 e LAMP1. Este efeito foi amplificado sob Starvat nutrienteIon, que induz a autofagia. No entanto, sem a adição de cloroquina, não houve um aumento significativo no número de autofagosomas, provavelmente devido ao aumento da taxa de rotação autofágica. Quando as células ficaram famintas na presença de cloroquina, houve aumento na co-localização e no número de autofagosomas, o que suporta a conclusão de que a fome aumenta o fluxo autofágico. EBSS é conhecido por ser um poderoso indutor de autofagia. Portanto, espera-se que o aumento seja grande. Se outro método, como indução de fármaco, for utilizado para induzir autofagia, a diferença entre o controle e as amostras tratadas pode ser mais sutil.

Este protocolo particular foi projetado para medir a autofagia em linhas celulares humanas, mas o ensaio poderia ser adaptado a outras espécies ao mudar para anticorpos para essa espécie particular. Além disso, o método de análise pode ser usado para qualquer aplicação intracelular que exija a co-localizaçãoDe três sondas / marcadores.

Divulgações

Eu sou empregado por MilliporeSigma, o criador da marca Amnis ImageStream, que foi usado neste estudo.

Agradecimentos

Gostaria de agradecer meus colegas de trabalho da MilliporeSigma, Philip J. Morrissey e Sherree L. Friend, pelo apoio e orientação ao longo dos anos. Gostaria também de agradecer a Vidya Venkatachalam e Bryan R. Davidson por sua ajuda com o recurso BDC3 no software IDEAS , Ryan P. Jessup por ajudar a editar este manuscrito, Raymond Kong para ajudar no dia do tiro, e um agradecimento especial Para a artista de maquiagem Cynthia Xamonthiene.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de centrífuga de 15 mLFalcon352096
Tubo de centrífuga de 50 mLFalcon352070
AF647 rotulado como Anti-Rato de burro - IgG InvitrogenA-31571Anticorpo secundário anti-rato IgG (H + L) de burro, Alexa Fluor 647. Confirmação 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571
anti-CD107a-PE humano (LAMP1)BioLegend328607Clone H4A3. Concentração 400 µ g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
anti-CD45- AF488BioLegend304017Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html
anti-humano CD45- PE BioLegend304008Clone HI30.  http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html
anti-humano CD45-AF647 BioLegend304018Clone HI30.  http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html
Anti-LC3 (Humano) clone mAb 4E12MBL International CorporationM152-3Clone 4E+12.  Concentração 2 mg/mL.  https://www.mblintl.com/products/m152-3
Anti-SQSTM1 / p62 anticorpo [EPR4844] - Marcador de Autofagossomo (Alexa Fluor 488)abcamab185015Clone EPR4844.  Concentração 0,5 mg/mL.  http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html
Sal de Difosfato de CloroquinaSigma-AldrichC6628-25G
Cleanser - Coulter Clenz Beckman Coulter8546931Encha o recipiente com 200 mL de Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
DAPI Stain 5 mg/mLMilliporeSigma508741http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741
Debubbler - 70% IsopropanolMilliporeSigma1.3704Encha o recipiente com 200 mL de Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Solução salina tamponada com fosfato Dulbecco 10xMilliporeSigmaBSS-2010-B  Ca++Mg++ Grátis 
Solução salina tamponada com fosfato Dulbecco 1xMilliporeSigmaBSS-1006-BPBS Ca++Mg++ Grátis 
Solução de Sal Balanceada Earle's 1xGibco14155
Soro Fetal BovinoHyCloneSH30071.03
Formaldeído, 10%, sem metanol, Ultra PurePolysciences, Inc.04018Isto é o que é usado para a formalina a 4% e 1%. CUIDADO: Formalina/Formaldeído tóxico por inalação e se ingerido.  Irritante para os olhos, sistemas respiratórios e pele.  Pode causar sensibilização por inalação ou contato com a pele. Risco de danos graves aos olhos.  Risco potencial de câncer.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hanks' Solução de Sal Balanceada 1xGibco14175
Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)ATCCTIB-152https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx
Aminoácidos Não Essenciais MEM 100xHyCloneSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IIMilliporeSigma100220Foi utilizada uma ImageStreamX Mark II de 2 câmaras equipada com os lasers de 405nm, 488nm e 642nm. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
software de análise MIFC - IDEAS 6.2MilliporeSigma100220O software complementar ao MIFC (ImageStreamX MKII).  Software IDEAS versão 6.2
MIFC - INSPIREMilliporeSigma100220Este é o software que executa o MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE versão 200.1.388.0
PE anti-humano CD107a (LAMP-1) Anticorpo clone H4A3BioLegend328608http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
Solução de penicllin/estreptomicina/glutamina 100xHyCloneSV30082.1
Enxágue - Água ultrapura ou água deionizadaNA NAVocê pode usar qualquer água ultrapura ou água deionizada.  Encha o recipiente com 900 mL de enxágue.
RPMI-1640 Médio 1xHyCloneSH30027.01
Bainha - PBSMilliporeSigmaBSS-1006-BEste é o mesmo que o Phosphate Buffered Saline 1X da Dulbecco  Ca++MG++ grátis.  Encha o recipiente com 900 mL de bainha.
Tubos de microcentrífuga de polipropileno siliconizadoFisherbrand02-681-320Tubos de microcentrífuga de baixa retenção siliconizados Fisherbran 1,5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936
Solução de piruvato de sódio (100 mM)Esterilizador HyCloneSH30239.01
- 0,4 - 0,7% HipocloritoVWRJT9416-1Este é asseguradamente 10% de alvejante Clorox que pode ser feito deluting o alvejante Clorox com água.  Encha o recipiente com 200 mL de Sterilzer.
Reagente de Calibração do Sistema - SpeedBeadMilliporeSigma400041Cada tubo comporta ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
Cantil T75Falcon353136
TRITON X-100, Detergente de GRAU PROTEICO, Solução a 10%, Filtrado EstérilMilliporeSigma648463-50MLhttp://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463
Água, Grau de Cultura de Células HyCloneSH30529.03

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