Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária Xenopus tropicalis

Summary

Este protocolo demonstra um método baseado em fluorescência para visualizar a vasculatura e quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis . Os vasos sanguíneos podem ser visualizados minutos após a injecção de um corante fluorescente no coração batendo de um embrião após manipulações genéticas e / ou farmacológicas para estudar o desenvolvimento cardiovascular in vivo .

Abstract

Os vasos sanguíneos fornecem oxigênio e nutrientes em todo o corpo, ea formação da rede vascular está sob controle de desenvolvimento apertado. A eficiente visualização in vivo dos vasos sanguíneos e a quantificação fiável da sua complexidade são fundamentais para a compreensão da biologia e da doença da rede vascular. Aqui, nós fornecemos um método detalhado para visualizar vasos sanguíneos com um corante fluorescente comercialmente disponível, complexo DiI de lipoproteína de baixa densidade acetilada no plasma humano (DiI-AcLDL) e para quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis . Os vasos sanguíneos podem ser marcados por uma simples injeção de DiI-AcLDL no coração batendo de um embrião, e os vasos sanguíneos em todo o embrião podem ser visualizados em embriões vivos ou fixos. Combinado com a perturba�o gen�ica pela microinjec�o direccionada de �idos nucleicos e / ou a aplica�o em banho de reagentes farmacol�icos, as fun�es de um gene ou de uma via de sinaliza�o no desenvolvimento vascular podem ser inveStigated dentro de uma semana sem recorrer a sofisticados animais geneticamente modificados. Devido ao sistema venoso bem definido de Xenopus e sua angiogênese estereotipada, o surgimento de vasos pré-existentes, complexidade vascular pode ser quantificado eficientemente após experimentos de perturbação. Este protocolo relativamente simples deve servir como uma ferramenta facilmente acessível em diversos campos da investigação cardiovascular.

Introduction

A vasculogênese, a formação de novos vasos sanguíneos a partir de células endoteliais recém-nascidas ea angiogênese, a formação de novos vasos de vasos pré-existentes, são dois processos distintos que moldam a vasculatura embrionária ¹ . Qualquer desregulação nestes processos resulta em várias doenças cardíacas e anormalidades estruturais dos vasos. Além disso, o crescimento tumoral está associado com o crescimento descontrolado do vaso. Como tal, os mecanismos moleculares subjacentes à vasculogênese e à angiogênese são objeto de intensa investigação ² .

Xenopus e zebrafish são mode....

Protocol

Todos os experimentos obedeceram a protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Yonsei.

1. Preparação de Xenopus tropicalis Embryos

NOTA: Os embriões de Xenopus tropicalis foram produzidos como descrito anteriormente ¹⁰ , com ligeira modificação. Os embriões de Xenopus tropicalis foram encenados de acordo com as tabelas de Nieuwkoop e Faber ¹¹ .

1. Indução da ovulação
   1. Para pré-primário, injetar gonadotropina coriônica humana (hCG) n....

Results

Cronologia dos experimentos (Figuras 1 e 2)

Logo após a fecundação, a microinjecção direccionada pode ser realizada para modular a expressão do gene. Por exemplo, um MO anti-sentido que se liga especificamente ao codão de iniciação do ARNm de Tie2 endógeno pode ser injectado, inibindo a tradução do mRNA alvo de Tie2 por impedimento estérico. Um MO pode ser conjugado com fluoresceína para o rastreio visual fácil de embriões com su.......

Discussion

O protocolo apresentado aqui foi desenvolvido pela primeira vez por Ali H. Brivanlou e colegas para investigar eventos de desenvolvimento durante a formação vascular em Xenopus laevis ⁴ , mas, como mostrado neste manuscrito, pode ser aplicado a outros pequenos animais. Injecção de corante no coração é simples de realizar, e toda a rede vascular pode ser visualizada sob um microscópio de dissecção de fluorescência, bem como um microscópio confocal. Se o corante é injetado no coração duran.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de Petri de 35 mm	SPL	10035	Estrutura de molde Sylgard
Placa de Petri de 60 mm Bandeja	elevação de embriões	SPL	10060
Vidro de borossilicato	Instrumento Sutter	B100-50-10	Agulha para injeção
BSA	Sigma	A3059-10G	Reagente de revestimento
CaCl2	D.S.P.GR Reagente		0,1x MBS componente
Lamínula	Superior	HSU-0111520	Para imagem de imagem confocal
DiI-AcLDL	Thermo Fisher Scientific	L3484	Solução de coloração de vasos
FBS	Hyclone	SH.30919.02	Para armazenamento de testículos
Iluminador de fibra óptica	World Precision Instruments	Z-LITE-Z	Light
Ficoll	Sigma	F4375	Tampão de injeção
Extrator de Micropipeta Flamejante/Marrom	Instrumento Sutter	P-97	Extrator de agulha de injeção
Fórax	Fine Science Tool	11255-20	Para incubação de embriões e corte de ponta de agulha
Prato de fundo de vidro	SPL	100350	Para imagem confocal
hCG	MNS Coréia		Para priming de sapos
HEPES	Sigma	H3375	Agente tamponante
Incubator	Lab. Companion	ILP-02	Para a criação de embriões
KCl	DAEJUNG	6566-4400	MBS
componente L15 meio	Gibco	11415-114	Para armazenamento de testículo
L-cisteína	Sigma	168149-100G	Reagente de desgelagem
MgSO4	Sigma	M7506	MBS componente
Microtubo	Axygen	MCT-175-C-S	Para o armazenamento dos testículos
MS222	Sigma	E10521	Pó anestésico
NaCl	DAEJUNG	7647-14-5	MBS componente
NaOH	Sigma	S-0899	pH que ajusta o reagente
Paraformaldeído	Sigma	P6148	Fixadores
PBS	BIOSESANG	P2007	Buffer para imagem de imagem
de papel de pH	Sigma	P4536-100EA	Para confirmar o INJETOR de pH
Pico-LITER	Instrumentos Waner	PLI-100A	Para injeção
	Pinservice	26002-10	Para incisão
Pinholder	Scitech Coréia	26016-12	Para incisão
Microscópio binocular de zoom estéreo de precisão	Mundo Instrumentos de Precisão	PZMIII	Para Triagem Visual
Micromanipulador de Controle Manual Padrão	Instrumentos	W4 64-0056	Para microinjeção
SYLGARD 184 Kit	Dow Corning		transferência de injeção DiI
	Coréia Ace Scientific Co.	Ym. B78-400	Para coleta de óvulos e embriões