Artigo de método

Isolamento de Proteínas de Filamento Intermediário a partir de Tecidos Múltiplos de Rato para Estudar Modificações Pós-Translacionais associadas ao Envelhecimento

DOI:

10.3791/55655

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18 de maio de 2017

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1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

Neste artigo

Resumo

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Neste método, apresentamos procedimentos bioquímicos para isolamento rápido e eficiente de proteínas de filamento intermediário (IF) a partir de tecidos de múltiplos ratos. IFs isoladas podem ser usadas para estudar mudanças em modificações pós-translacionais por espectrometria de massa e outros ensaios bioquímicos.

Resumo

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Filamentos intermediários (IFs), juntamente com filamentos de actina e microtúbulos, formam o citoesqueleto - um elemento estrutural crítico de cada célula. Funcionamento normal IFs fornecer células com resistência mecânica e estresse, enquanto um citoesqueleto disfuncional IF compromete a saúde celular e tem sido associado a muitas doenças humanas. As modificações pós-translacionais (PTMs) regulam criticamente a dinâmica de IF em resposta a mudanças fisiológicas e sob condições de estresse. Portanto, a capacidade de monitorar as mudanças na assinatura PTM de IFs pode contribuir para uma melhor compreensão funcional e, em última instância condicionamento, do sistema IF como um stress responder durante a lesão celular. No entanto, o grande número de proteínas IF, que são codificadas por mais de 70 genes individuais e expressas de forma dependente de tecidos, é um grande desafio para classificar a importância relativa de diferentes PTMs. Para o efeito, os métodos que permitem a monitorização de PTMs em proteínas IFEm nível de organismo, e não para membros isolados da família, pode acelerar o progresso da pesquisa nesta área. Aqui, apresentamos métodos bioquímicos para o isolamento da fração total, detergente-solúvel e resistente ao detergente de proteínas IF de 9 diferentes tecidos de ratos (cérebro, coração, pulmão, fígado, intestino delgado, intestino grosso, pâncreas, rim e baço). Demonstrámos ainda um protocolo optimizado para o isolamento rápido de proteínas IF utilizando matriz de lise e homogeneização automatizada de diferentes tecidos de ratinho. O protocolo automatizado é útil para perfilar IFs em experimentos com alto volume de amostra (como em modelos de doença envolvendo múltiplos animais e grupos experimentais). As amostras resultantes podem ser utilizadas para várias análises a jusante, incluindo perfis PTM de espectrometria de massa. Utilizando estes métodos, fornecemos novos dados para mostrar que as proteínas IF em diferentes tecidos de rato (cérebro e fígado) sofrem mudanças paralelas com respeito à sua expressãoE PTMs durante o envelhecimento.

Introdução

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As IFs são uma família de proteínas que nos seres humanos são codificadas por 73 genes e categorizadas em seis tipos principais: os tipos I a IV são citoplasmáticos ( por exemplo, queratina epitelial e capilar (K), desmina de miócitos, neurofilamentos, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e outros); Tipo V são as laminas nucleares; E tipo VI são IFs na lente ocular 1 . Em termos de sua organização molecular, as proteínas IF têm três domínios comuns: um domínio "var" de bobina enrolada altamente conservado e domínios globulares "cabeça" e "cauda". Os tetrâmeros de proteína IF se unem para formar precursores de filamentos curtos, que são finalmente incorporados em filamentos maduros que formam estruturas citoesqueléticas dinâmicas e nucleoesqueléticas envolvidas na proteção mecânica 2 , sensação de estresse 3 , 4 , regulação da transcrição 5 e crescimento e outras funções celulares críticas"> 1 , 6 , 7 .

A importância funcional do sistema IF é evidenciada pela existência de muitas doenças humanas causadas por mutações missense em genes IF, incluindo neuropatias, miopatias, doenças de fragilidade cutânea, disfunções metabólicas e síndromes de envelhecimento prematuro 8 . Algumas mutações no gene IF não causam, mas predispõem seus portadores à progressão da doença, como as queratinas epiteliais simples na doença hepática 9 . Este último é devido às funções críticas de proteção ao estresse das IF no epitélio. As IFs em geral estão entre as proteínas celulares mais abundantes sob condições basais, mas são ainda fortemente induzidas durante vários tipos de estresse 10 . Por exemplo, estudos recentes que avaliam alterações de todo o proteoma no nematóide C. elegans demonstraram que as IFs múltiplas estão altamente reguladas e propensas a agregaçõesDurante o envelhecimento do organismo 11 , 12 . Uma vez que a manutenção de uma estrutura IF adequada é essencial para a resistência celular a várias formas de stress 10 , a agregação IF também pode contribuir para o declínio funcional durante o envelhecimento. Contudo, estudos de nível organizacional que examinam múltiplas proteínas de mamífero IF em diferentes tecidos submetidos a estresse estão faltando.

IFs são estruturas altamente dinâmicas que se adaptam para atender demandas celulares. As queratinas, por exemplo, sofrem uma ciclagem independente da biossíntese entre o pool protéico solúvel (não filamentoso) e insolúvel (filamentoso) 13 . Em condições fisiológicas normais, pode extrair-se aproximadamente 5% do pool K8 / K18 total em tampão sem detergente, em comparação com aproximadamente 20% que pode ser solubilizado no detergente não iónico Nonidet P-40, que é bioquimicamente comparável a Triton- X100 14 , 15 . Durante a mitose, há um aumento notável na solubilidade do K8 e K1814 do epitélio de tipo simples, que é menos aparente nas queratinas epidérmicas, mas mais aparente na vimentina e em outras proteínas IF do tipo III 15,16 . As propriedades de solubilidade das proteínas IF são fortemente reguladas pela fosforilação, uma modificação pós-translacional chave (PTM) para rearranjo de filamentos e solubilidade 17 , 18 , 19 , 20 . A maioria das IF sofre regulação extensiva por um número de PTMs em locais conservados, resultando em alterações funcionais 17 .

A finalidade deste método é introduzir os investigadores que são novos ao campo do IF à extração bioquímica e aos métodos analíticos para o estudo de proteínas de FI através dos tecidos múltiplos do rato. EspecíficoAliado, focamos no isolamento de proteínas IF usando um método de extração de alto sal e avaliação de mudanças em PTMs por espectrometria de massa e por anticorpos dirigidos contra PTM. Estes métodos baseiam-se nos procedimentos previamente publicados 21, mas incluem modificações para extrair diferentes tipos de proteína IF para descobrir o mecanismo comum de regulação em toda a família IF. Por exemplo, a acetilação de K8 num resíduo de lisina específico regula a organização do filamento, enquanto que a hiperacetilação promove a insolubilidade do K8 e a formação de agregados 22 . Recentes estudos globais de perfil proteómico revelaram adicionalmente que a maioria das proteínas IF específicas de tecido são também alvos para acetilação e que a maioria dos locais de acetilação de IF estão confinados ao domínio de haste altamente conservado. Isso destaca a necessidade de métodos adequados para o perfil global do sistema IF. Nós também introduzimos um método rápido de isolar IF proteínas de múltiplos tecidos usando homogeneização automatizada em optiMatriz de lise. As preparações resultantes são adequadas para análise PTM a jusante por espectrometria de massa e outros métodos.

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Protocolo

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O protocolo é aprovado e realizado de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Norte.

1. Preparações

  1. Preparar tampão Triton-X (Triton X-100 a 1%, ácido etilenodiaminotetraacético 5 mM (EDTA), aumentar o volume em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4). Para preparar 500 mL: agitar 5 mL cada de Triton X-100 e EDTA 500 mM em 490 mL de PBS, pH 7,4. Armazenar a solução tampão Triton-X a 4 ° C.
  2. Preparar tampão de alta sal (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, NaCl 140 mM, KCl 1,5 M, EDTA 5 mM, Triton X-100 a 0,5%, aumentar o volume em H 2 O duplamente destilado). Para fazer 500 mL: agitar 10 mL de Tris-HCl 0,5 M (pH 7,6), 14 mL de NaCl 5 M, 55,9 g de KCl, 5 mL de EDTA 0,5 M e 2,5 mL de Triton X-100, ajustar o volume a 500 ML usando água destilada dupla). Solução alta do amortecedor de sal em 4 ° C.
  3. Justo antes do uso, suplementar uma quantidade apropriada de Triton-X e de Tampão de Alta Sal ( Por exemplo 1 mL para cada amostra de tecido de 25 mg) com um cocktail de protease ou inibidor de protease / fosfatase e descartar qualquer tampão não utilizado contendo os inibidores.
  4. Preparar EDTA 5 mM em 1x PBS, pH 7,4. Para fazer 500 mL: agitar 5 mL de EDTA 0,5 M em 495 mL de 1x PBS, pH 7,4.
  5. Isolar os diferentes órgãos do rato (cérebro, coração, pulmão, fígado, pâncreas, cólon, intestino, rim, baço) utilizando protocolos aprovados que cumpram as diretrizes veterinárias e os padrões institucionais 23 . O procedimento de coleta de tecidos não deve levar mais de 5 min para preservar o RNA ea integridade proteica dos tecidos ricos em proteases ( por exemplo, o pâncreas deve ser processado primeiro).
  6. Cortar uma pequena quantidade de tecido (~ 5-20 mg) e colocar em solução de armazenamento de ARN, para posterior extração de RNA, síntese de cDNA e análise quantitativa em tempo real PCR para a expressão do gene IF. Coloque os tubos de solução de armazenamento de RNA com tecido a 4 ° C durante a noite e siga o protocolo do fabricante para maisEtapas de toragem e isolamento.
  7. Corte o resto do tecido em fragmentos menores ( por exemplo, 0,5 cm) e coloque em criovial. Snap-freeze e armazenar os frascos a -80 ° C ou nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.

2. IF Análise de Expressão Gênica

  1. Extrair ARN de tecidos preservados no reagente de solução de armazenamento de ARN. Utilizar qualquer método de extracção de ARN adequado / preferido de acordo com o protocolo do fabricante.
  2. Quantificar a concentração de RNA e usar 2 μ g de RNA para gerar cDNA usando um adequado transcrição reversa kit de acordo com o fabricante do protocolo.
  3. Utilizando os cDNA gerados e os iniciadores específicos do gene IF do rato criaram reacções qPCR, incluindo três repetições técnicas de cada amostra bem como controlo em branco de acordo com o protocolo do fabricante.
  4. Quantificar IF expressão gênica como dobra alterar comparando diferentes condições ( por exemplo, jovens versus tecidos antigos).

3. PDe lisados ​​teciduais totais para Immunoblot

  1. Homogeneizar 25 mg de tecido em 1 mL de tampão de amostra SDS não redutor 2x. Omitir o corante azul de bromofenol do tampão de amostra se um ensaio de proteína colorimétrica é para ser realizado para quantificar a concentração de proteína.
  2. Adicionar 5% (v / v) de 2-mercaptoetanol (2-ME) para fazer amostras reduzidas. A 200 μL das amostras não redutoras, adicionar 10 μL de 2-ME.
  3. Determinar a concentração de proteína utilizando um ensaio de proteína compatível com detergente e agente redutor. Se o corante já estiver incluído no tampão de amostra, a quantidade de proteína pode ser estimada após a execução de um gel através de várias técnicas, incluindo a mancha baseada em Coomassie 24 .
  4. Vortexar todas as amostras e aquecer a 95 ° C durante 5 min.
  5. Realizar western blotting tanto em condições de redução como de não-redução. A membrana de exposição brevemente (<1 min) revela espécies monoméricas, e mais tempo (> 1 min) para revelar complexos de massa molecular elevada contendoNg IF proteínas. Se monitorar a agregação, examine todo o gel / membrana (incluindo o fundo dos poços de gel).
  6. Executar um gel paralelo e mancha com uma mancha de proteína como um controle de carga 24 . Em modelos de doença ou em experimentos de lesões, a mancha de proteína total deve ser usada como um controle de carga, ao contrário de imunotransferências para proteínas de "limpeza" ( por exemplo , actina, GAPDH) porque estas mudam sob condições de estresse diferentes.

4. Preparação de extractos solúveis em detergente e sal de FIs específicos de tecido

  1. Adicionar 1 mL de tampão Triton X-100 gelado para um homogeneizador de tubo de vidro e colocá-lo em gelo.
  2. Remova um pequeno pedaço de tecido (~ 25 mg) do armazenamento de azoto líquido e coloque-o directamente no homogeneizador de vidro. Utilize um pilão de politetrafluoroetileno para homogeneizar (50 pancadas) e evite fazer bolhas. Manter o homogeneizador eo lisado frios em todos os momentos.
  3. Transferir o lisado para um micr de 1,5 mLNum tubo de ocentrifuga em gelo e centrifugar a 20 000 xg durante 10 min numa centrífuga pré-arrefecida (4 ° C).
  4. Recolher a fracção sobrenadante num tubo separado. Esta é a fracção solúvel em Triton X, que pode ser utilizada para imunoprecipitação (ip) e análise do conjunto solúvel em detergente de proteínas IF. Note que os passos 4.1-4.4 podem ser repetidos para se obter um extracto IF mais limpo do tecido cerebral.
  5. Adicionar 1 mL de High Salt Buffer ao sedimento de tecido, transferir para um homogeneizador limpo e dounce 100 traços. Transferir o homogeneizado para o tubo de microcentrífuga e colocar o tubo num agitador rotativo na câmara fria durante 1 h.
  6. Centrifugar os homogeneizados a 20 000 xg durante 20 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante.
  7. Adicionar 1 mL de tampão PBS / EDTA arrefecido em gelo ao sedimento e homogeneizar o grânulo (20 movimentos) num homogeneizador limpo como um passo de limpeza final *. Transferir para um novo tubo e centrifugar a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C para obter a proteína IF-Rico em sal (HSE).
    * Opcionalmente, vortex em vez de homogeneização nesta etapa.
  8. Descartar o sobrenadante e dissolver os sedimentos em 300 μL de tampão de amostra SDS não redutor que foi pré-aquecido. Separar o sedimento inicialmente por pipetagem e agitação em vórtex, e depois aquecer as amostras durante 5 min a 95 ° C.
  9. Vortex e pipeta conforme necessário para assegurar que a pastilha seja dissolvida. Pode levar vários minutos para dissolver completamente os grânulos.
  10. Armazenar todas as amostras a -20 ° C até à análise.

5. Lise automatizada de tecidos para extração de proteínas IF em experimentos de alto volume

  1. Para a extracção de ARN, colocar um tampão de lise (600 μL de tampão por 25 mg de tecido) num tubo contendo matriz de lisação D (utiliza pequenas esferas cerâmicas) e pulsar duas vezes durante 25 segundos no lisador de tecido. Separar o lisado da matriz por centrifugação a 20 000 xg e prosseguir para a fase seguinte isoladamente.
  2. Para a extração de proteínas, coloque o TritEm X-100 (ou tampão de amostra de SDS, se preparar o lisado total) num tubo de lise com matriz de lise SS (utilizar um único rebordo de aço inoxidável). Após o teste de várias matrizes, este foi selecionado porque produz extratos de proteína IF que estão em qualidade similar ao método tradicional douncing. Observe que o método automatizado não é ótimo para pâncreas e baço, eo protocolo de homogeneização padrão deve ser usado para esses tecidos.
  3. Para prosseguir com a preparação de Extracto de Sal Alta, retire o cordão de aço inoxidável do tubo utilizando um íman e centrifugue os tubos a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  4. Continue com a etapa 4.4 (acima) do protocolo manual.
  5. Armazenar todas as amostras a -20 ° C até à análise.

6. Imuno-enriquecimento de proteínas IF pós-translacionalmente modificadas

  1. Preparar tampão PBST (Tween-20 a 0,02% em PBS). Para fazer 50 mL, adicione 10 μL de Tween-20 a 50 mL de PBS, pH 7,4.
  2. Preparar PTM anticorpo(1-10 μg de anticorpo em 200 μL de PBST). Em geral, 3 μg de anticorpo / reacção é uma boa condição de partida que pode ser ainda mais optimizada se necessário.
  3. Para cada reação, alíquota de 50 μL de esferas magnéticas em um tubo de microcentrifuga, coloque no ímã e aspirar a solução de armazenamento de talão.
  4. Conjugar as esferas ao anticorpo de imunoprecipitação por re-suspensão na solução de anticorpo e incubar no rotador (fim-sobre-fim, para assegurar a mistura de pequenos volumes) à temperatura ambiente durante 20 min.
  5. Coloque os tubos no imã e aspirar a solução de anticorpos.
  6. Enxaguar as esferas conjugadas com anticorpo uma vez em 200 μL de PBST e remover o tampão de lavagem.
  7. Adicionar 0,6-1 mL do lisado de tecido às esferas, misturar por pipetagem suave e incubar durante 3 h no rotador numa câmara fria.
  8. Coloque os tubos no ímã, remova o lisado e lave as esferas cinco vezes com 200 μL de PBST. Após o último passo de lavagem, recolher as pérolas em 100 _6; L de PBS (sem Tween-20) e transferir para um novo tubo limpo. Coloque o tubo no ímã.
  9. Aspirar o PBS e adicionar 100 μL de tampão de amostra não redutor. Remover 50 μL e adicionar 2-ME (5%) para fazer amostras redutoras. Aquecer as amostras a 95 ° C durante 5 min.
  10. Separar a fração ip das contas no ímã e recolhê-lo em um novo tubo.
  11. Armazenar as amostras a -20 ° C até análise.

7. Preparação de Amostras de Proteínas IF para Análise de Espectrometria de Massa

  1. Programar uma consulta com um especialista em proteômica antes de iniciar um estudo, pois há tempo e custo significativos envolvidos com a análise de espectrometria de massa.
  2. Tome precauções especiais para evitar a contaminação. Manuseie todos os géis com luvas limpas e incube em recipientes limpos, lavados apenas com DDH 2 O (evite sabão).
  3. Executar 20-50 μL da amostra HSE (das Secções 4 e 5) num gel SDS-PAGE de acordo com as condições padrão.
  4. Mancha com uma mancha de proteína durante 1 h. Lavar várias vezes e desidratação em ddH 2 O durante a noite. As bandas de proteína IF devem ser facilmente visíveis após a descoloração.
  5. Coloque o gel entre protetores de folha de plástico, digitalizar e marcar as bandas que serão excisadas e enviadas para análise.
  6. Excise as bandas de proteína IF usando uma nova navalha limpa.
  7. Coloque as bandas de gel em tubos de microcentrífuga limpa e transfira para uma instalação de espectrometria de massa.

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Resultados

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Um novo método rápido para a alta extração salina de proteínas IF de múltiplos tecidos de ratos usando matriz de lise.

O método tradicional 25 , 26 de isolar a maior parte da fracção de proteína de filamento intermediário a partir do tecido epitelial foi aqui modificado para incluir 9 órgãos diferentes e um proced...

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Discussão

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Métodos que permitem a caracterização bioquímica de proteínas IF podem ser úteis para compreender numerosos fenômenos fisiopatológicos em sistemas de mamíferos, uma vez que as proteínas IF são marcadores e moduladores do estresse celular e tecidual 29 . O princípio subjacente ao método actual baseia-se nos procedimentos iniciais desenvolvidos nas décadas de 1970 e 1980 para isolar, separar e reconstituir as proteínas IF das células e tecidos, empregando geralmente soluções salinas de baixo e alto...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo NIH concede NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] e P30 DK034987 [UNC-Chapel Hill]. Os autores agradecem a Deekshita Ramanarayanan pela assistência com qPCR e Western blot experiências.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Dynabeads Protein GThermoFisher Scientific10009grânulos de imunoprecipitação
PBSThermoFisher Scientific10010049para tampões
Purelink RNA mini kitThermoFisher Scientific12183018extração de RNA do tecido
Purelink DNAse setThermoFisher Scientific12185010Ana coluna de digestão
Dynamag-2ThermoFisher Scientific12321Dímã para uso com dynabeads
GelCode Blue Stain ReagentThermoFisher Scientific24592mancha de gel compatível com espectrometria de massa
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher Scientific32106para uso em western blot
Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidadeThermoFisher Scientific4368813para uso em análise de expressão gênica
Sistema de PCR Proflex 3 x 32 poçosThermoFisher ScientificSistema dePCR
Membrana de transferência PVDF ThermoFisher Scientific88520para western blot
Power Up SYBR master mixThermoFisher ScientificA25778para análise de qPCR
RNAlaterThermoFisher ScientificAM7020solução para armazenamento de tecido antes do isolamento do RNA
Novex 4-20% Tris Glycine GelThermoFisher ScientificXP04205BOXGel de proteína pré-moldado
Anti-Queratina 8 anticorpo (TS1)ThermoFisher ScientificMA514428para detecção de western blot de K8
Anti-VimentinaThermoFisher ScientificMA511883para detecção de western blot de vimentina
Tris Glycine Transfer Buffer (25x)ThermoFisher ScientificLC3675para transferência úmida de géis de proteína
2x SDS Sample BufferThermoFisher ScientificLC2676para preparação amostras de gel de proteína
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)ThermoFisher ScientificLC26755para géis de proteína em execução
Grânulos de lise - Matrix DMP Biomedicals116913100Grânulos de lise e tubos de matriz para ruptura de tecidos e extração de RNA
Grânulos de lise - Matrix SSMP Biomedicals116921100Grânulos de lise e tubos de matriz para ruptura de tecidos e extração de proteínas
Espectrofotômetro NanoDrop LiteThermoFisher ScientificND-LITEmedição de proteínas e ácidos nucleicos
Homogeneizador Precellys 24Bertin InstrumentsEQ03119Homogeneizador de tecidos automatizado
de DNA4484073

Referências

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