Aqui, apresentamos um protocolo de fracionamento de membrana cerebral que representa um procedimento robusto para isolar proteínas pertencentes a diferentes compartimentos sinápticos.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Fracionamento de Membranas Cerebrais: Um
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Avaliar a composição ea função das proteínas sinápticas constitui um desafio importante na neurociência. No entanto, não é fácil avaliar a neurotransmissão que ocorre dentro das sinapses, pois é altamente regulada por interações dinâmicas proteína-proteína e eventos de fosforilação. Consequentemente, quando qualquer método é utilizado para estudar a transmissão sináptica, um objectivo principal é preservar estas modificações fisiológicas transitórias. Aqui, apresentamos um protocolo de fracionamento de membrana cerebral que representa um procedimento robusto para isolar proteínas pertencentes a diferentes compartimentos sinápticos. Em outras palavras, o protocolo descreve uma metodologia bioquímica para realizar o enriquecimento protéico a partir de compartimentos pré-sinápticos, pós-sinápticos e extrasinápticos. Primeiro, os sinaptossomas, ou terminais sinápticos, são obtidos a partir de neurônios que contêm todos os compartimentos sinápticos por meio de um gradiente descontínuo de sacarose. De notar, a qualidade desta preparação de membrana sináptica inicial é cRitical. Subsequentemente, o isolamento dos diferentes compartimentos subsinápticos é conseguido com solubilização leve utilizando detergentes suaves a condições de pH diferenciais. Isto permite a separação por gradiente e centrifugações isopicnicas. Por fim, o enriquecimento protéico nos diferentes compartimentos sub-sinápticos ( ie, frações de membrana pré, pós e extrasináptica) é validado por meio de análise de imunotransferência utilizando marcadores de proteína sináptica bem caracterizados (SNAP-25, PSD-95 e sinaptofisina, Respectivamente), permitindo assim uma avaliação directa da distribuição sináptica de qualquer proteína neuronal particular.
Introdução
A transmissão sináptica baseia-se na integridade física da sinapse, um conceito que estava previsto já em 1897 por Foster e Sherrington 1 . Assim, a compreensão da distribuição de componentes chave de neurotransmissão ( por exemplo, canais iónicos, receptores, etc. ) é essencial para elucidar a função sináptica, tanto em condições normais como patológicas. A microscopia eletrônica (EM) tem contribuído enormemente para a atual noção ultraestrutural das sinapses prototípicas do sistema nervoso central (SNC). Desta forma, EM tem finamente estabelecido as diferenças entre as densidades pré e pós-sinápticas, que são separadas por uma fenda de uma distância bastante uniforme (~ 25 nm) 2 . Curiosamente, o aparelho pós-sináptico exibe um espessamento relativamente contínuo, denso de elétrons abaixo de sua membrana plasmática, a chamada densidade pós-sináptica, ou PSD2. Inversamente, no aparelho pré-sináptico,E a rede de citomatriz descontínua é disposta logo abaixo da membrana plasmática, que é essencial para o alinhamento e acoplamento das vesículas sinápticas à zona activa da membrana plasmática 3 . Assim, EM constitui a aproximação experimental dourada para pesquisar a distribuição de proteínas dentro das sinapses do SNC estruturalmente preservadas. No entanto, as informações fornecidas por micrografia eletrônica é estática. De fato, as evidências acumuladas mostram que as sinapses in vivo são extremamente dinâmicas, experimentando, assim, mudanças estruturais dramáticas na transmissão sináptica sustentada. Além disso, a morfologia e composição das sinapses podem mudar ao longo de diferentes regiões do SNC e ao desenvolvimento, maturação, envelhecimento e desenvolvimento de condições neuropatológicas. Globalmente, um protocolo focado no isolamento de proteínas pertencentes a diferentes compartimentos sinápticos em condições fisiológicas representa uma ferramenta valiosa para um estudo mais abrangente do funcionamento sináptico.
et al . (2001) 4 , é baseado em um deslocamento do pH que enfraquece as interações adesivas ocorrendo dentro do aparelho pré e pós-sináptico. Em primeiro lugar, utilizando detergentes suaves a pH 6,0, é possível discernir a junção de aderentes que mantém o aparelho pré e pós-sináptico e que é mantida a partir do domínio da membrana extra-sináptica, que é solubilizada e, assim, pode ser extraída dos contatos sinápticos. Subsequentemente, aumentar o pH de 6,0 para 8,0 na presença de detergentes suaves enfraquece a resistência da junção de aderentes que mantém a zona activa pré-sináptica fortemente ligada à densidade pós-sináptica. Assim, o compartimento pré-sináptico éLubilizado e pode ser separado da densidade pós-sináptica, que é preservada principalmente porque a concentração de detergente usado não promove sua solubilização 4 . Curiosamente, a eficiência de fraccionamento, eventualmente superior a 90%, pode ser confirmada por diferentes marcadores sub-sinápticos: i ) proteína sinaptosomal associada 25 (SNAP-25), da zona pré-sináptica activa; Ii ) sinaptofisina, a partir da fracção extra-sináptica ( isto é, fora da zona activa e incluindo microssomas); E iii ) proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD-95), a partir da densidade pós-sináptica. Notavelmente, este método de fraccionamento de membrana cerebral tem sido utilizado com sucesso. Consequentemente, tem sido possível determinar com precisão a localização subsináptica de diferentes receptores, tais como receptores 5 de ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico (AMPA), receptor A1 de adenosina (AiR) 6 ,Receptor A 2A (A 2A R) 7 de adenosina, receptores P2 de trifosfato de adenosina (ATP) 8 , subunidades nicotínicas do receptor de acetilcolina 9 e receptor GPR37 associado à doença de Parkinson 10 . No entanto, uma série de limitações podem impedir a avaliação adequada da distribuição sináptica de uma determinada proteína neuronal. Desta forma, neste procedimento, não apenas descrevemos totalmente o protocolo, como também destacamos alguns pontos críticos a serem considerados, como a grande quantidade de tecido necessário, o baixo rendimento protéico eo requisito obrigatório para validar a eficiência de Cada separação antes de realizar a experiência definida.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos experimentais com animais foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais (CEEA) da Universidade de Barcelona, de acordo com as diretrizes descritas no Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório 11 e seguindo a Lei 86/609 / CCE, FELASA e ARRIVE. Assim, os ratinhos são alojados em gaiolas padrão, com acesso ad libitum a alimentos e água, e são mantidos sob condições padrão controladas (ciclo de luz / luz de 12 h a partir das 7:30 horas, temperatura de 22 ° C e 66% de humidade).
1. Obtenção de Sinaptossomas Cerebrais de Rato Utilizando um Gradiente de Sacarose Ininterrupto
Nota: Este método foi relatado anteriormente 10 .
- Preparar um novo tampão de isolamento (IB), pH 7,4; Sacarose 2 M; Sacarose 1 M / CaCl2 0,1 mM; E CaCl2 0,1 mM (ver Tabela 1 ). Chill as soluções em gelo.
- SaCrifice cinco camundongos por deslocamento cervical. Decapitar e remover rapidamente o cérebro de cada animal. Dissecar a região cerebral de interesse (ou seja, o hipocampo, 0,25-0,35 g de tecido fresco) e colocá-lo em um tubo de vidro Potter-Elvehjem 5 mL em gelo com 1 mL de IB.
- Homogeneizar o tecido utilizando um agitador de homogeneização (10 ciclos a 700-900 rotações por minuto), preferencialmente num banho de gelo para impedir o aquecimento da amostra.
- Colocar o tecido homogeneizado (1 mL) num tubo de 15 mL contendo 6 mL de sacarose 2 M e 2,5 mL de CaCl2 0,1 mM a 4 ° C. Misturar lentamente, invertendo o tubo.
Nota: A adição de cálcio é essencial para manter as interacções adesivas entre as organelas e assim preservar a estrutura das diferentes "densidades". - Colocar a solução num tubo de centrífuga de 12 mL e adicionar lentamente 2,5 mL de sacarose 1 M / CaCl2 0,1 mM em cima de cada tubo para formar o gradiente de sacarose.
Nota: Rotule a posição oF da interface de gradiente no tubo de centrífuga utilizando um marcador permanente. - Pesar e equilibrar os tubos de centrífuga com solução IB dentro dos suportes de aço correspondentes e com as tampas de fechamento.
- Centrifugar os tubos durante 3 h a 100 000 x g e 4 ° C usando uma centrífuga de rotor de balde giratório. Completamente preencher o rotor com todos os suportes de aço (mesmo vazio, se necessário).
- Descarte a camada superior contendo mielina. Com uma pipeta Pasteur, coletar o anel branco entre a interphase de sacarose 1,25-M e 1-M correspondente à fração de sinaptossoma.
- Diluir os sinaptossomas com 9X seu volume usando IB em um tubo de centrífuga.
- Pesar e equilibrar os tubos de centrífuga com solução IB dentro dos suportes de aço correspondentes e com as tampas de fechamento.
- Centrifugar os tubos durante 30 min a 15.000 x g e 4 ° C usando uma centrífuga de rotor balde balançando.
- Descartar o sobrenadante eE pellet com 1,1 mL de solução IB. Recolher 100 μL desta solução sinaptosomal e centrifugar durante 5 min a 11.000 x g e 4 ºC.
- Ressuspender o sedimento sinaptosomal em 5% de dodecilsulfato de sódio (SDS) e armazenar esta amostra a -20 ºC.
Nota: Esta amostra corresponderá à fracção de sinaptossoma total para análise Western-blot adicional. A fração sinaptosomática restante (~ 1 mL) pode ser congelada a -20 ºC até ser utilizada ou processada para posterior fracionamento sub-sináptico. Os sinaptossomas ou sinapses purificadas representam entre 1 e 2% do volume total do hipocampo 12 .
2. Isolamento pré, pós e extra-sináptico
- Preparar 2x tampão de solubilização fresco, pH 6,0; 1x tampão de solubilização, pH 6,0; Tampão de solubilização, pH 8,0; E CaCl2 0,1 mM (ver Tabela 1 ). Chill as soluções em gelo.
Nota: O pH destas soluções deve ser accuratelY ajustado para se obter um bom fraccionamento subsináptico. - Diluir lentamente a fracção sinaptossómica ressuspendida de 1 mL (ver passo 1.12) com 5 mL de CaCl2 0,1 mM.
- Adicionar o mesmo volume (5 mL) de tampão de solubilização 2x gelado, pH 6,0, e incubar durante 50 min em gelo sob agitação elevada num copo em gelo.
Nota: Enquanto 1% de Triton X-100 a pH 6,0 solubiliza todas as proteínas da membrana plasmática, preserva proteínas dentro dos contatos sinápticos ou junções ( isto é, estruturas pré e pós-sinápticas) 4 . - Coloque a solução num tubo de centrífuga. Pesar e equilibrar os tubos com volumes equivalentes de CaCl2 0,1 mM e solução de tampão de solubilização 2x, pH 6,0, dentro dos seus suportes de aço correspondentes e com as suas tampas de fecho.
- Centrifugar os tubos durante 30 min a 40.000 x g e 4 ° C usando uma centrífuga de rotor balde balançando. O sobrenadante resultante representa a fracção extra-sináptica,E o grânulo corresponde às junções sinápticas ( ie, frações pré e pós-sinápticas).
- Concentrar o sobrenadante contendo a fracção extra-sináptica para um volume final de 200 μL utilizando um tubo de filtro de 15 ml 10 K centrifugado a 4 000 xg e 4 ºC.
- Precipitar a fracção extra-sináptica concentrada resultante (200 μL) com 5 volumes (1 mL) de acetona pré-arrefecida (-20 ° C) durante a noite a -20 ° C.
- No dia seguinte, centrifugar a fracção extra-sináptica durante 30 min a 18.000 x g e -15 ° C. Após centrifugação, descartar o sobrenadante de acetona e secar o sedimento para remover qualquer vestígio de acetona.
- Finalmente, ressuspender o sedimento contendo as proteínas extrasinápticas com 200 μL de SDS a 5%. Sonicate o pellet, se necessário.
- Sem interrupção, lavar cuidadosamente a pastilha contendo as fracções pré e pós-sinápticas com 2 mL de tampão de solubilização 1x, pH 6,0. Descarte o buffer.
- RessuspenderO sedimento com 10 mL de tampão de solubilização 1x, pH 8,0, utilizando uma pipeta Pasteur de vidro.
Nota: Enquanto 1% de Triton X-100 a pH 8,0 solubiliza a especialização pré-sináptica, preserva a densidade pós-sináptica insolúvel 4 . - Incubar a suspensão durante 50 min em gelo sob agitação elevada num copo em gelo.
- Coloque a solução num tubo de centrífuga. Pesar e equilibrar os tubos com uma solução tampão de solubilização 1x, pH 8,0, dentro dos seus suportes de aço correspondentes e com as suas tampas de fecho.
- Centrifugar os tubos durante 30 min a 40.000 x g e 4 ° C usando uma centrífuga de rotor de balde giratório; O sobrenadante resultante corresponde à fracção pré-sináptica e ao grânulo à fracção pós-sináptica.
- Processar o sobrenadante contendo a fracção pré-sináptica, como descrito nos passos 2.6-2.9.
- Ressuspender o sedimento contendo a fracção pós-sináptica com 200 μL de SDS a 5%. Sonicate o pellet, iF necessário.
3. Analisar as amostras por imunotransferência para validar o fraccionamento da membrana
- Determine a quantidade de proteína em cada fração ( isto é, as frações total, extra, pré e pós-sinápticas) usando o ensaio de proteína de ácido bicinconínico.
- Tomar 20 μg de proteína de cada fracção e diluí-la até um volume final de 50 μL em tampão de amostra de electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Ferva durante 5 min a 100 ºC.
- Separar as proteínas por electroforese SDS-PAGE a 10%, com um gel concentrador a 4% sob condições redutoras. Eletroforese a uma tensão constante de 80 V até o corante entrar no gel inferior e então aumentar a tensão para 120 V.
- Transferir as proteínas para uma membrana de PVDF e bloquear com solução de bloqueio IB durante 45 min à temperatura ambiente sob agitação contínua.
- Incubar a membrana durante a noite a 4 ºC com o anticorpo primário indicado ( isto é, anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-sinaptofisina ou anti-GPR37) diluída em solução de bloqueio IB sob agitação contínua.
- Lavar a membrana três vezes (10 min cada) com solução de lavagem IB para eliminar o anticorpo primário não ligado.
- Incubar com o anticorpo secundário indicado durante 90 min em condições escuras à temperatura ambiente sob agitação contínua.
- Lavar a membrana três vezes (10 min cada) com solução de lavagem IB para eliminar o anticorpo secundário não ligado.
- Incubar a membrana com substrato quimioluminescente (preparar a mistura em condições escuras e seguir a proporção 1: 1 das soluções A e B fornecidas pelo fabricante).
- Analisar a membrana em um dispositivo de detecção quimioluminescente.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A metodologia descrita tem sido amplamente utilizada para a análise subsináptica de proteínas neuronais em geral e para o isolamento e caracterização bioquímica de receptores sinápticos 5 , 6 , 7 , 8 , 9 em particular. Curiosamente, o resultado representativo apresentado aqui mostra a utilidade deste procedimento experimental ...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo aqui apresentado constitui uma poderosa ferramenta bioquímica para o estudo da distribuição subsináptica de proteínas específicas em qualquer região do cérebro. No entanto, existem algumas desvantagens inerentes à técnica que merecem ser destacadas aqui. Por exemplo, uma das principais limitações é a quantidade relativamente grande de tecido necessária para purificar uma quantidade razoável de proteína para realizar a análise de immunoblot de todas as frações subsinápticas. Esse problema pode estar relacionad...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Economia e Competitividade / Instituto de Saúde Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 e PIE14 / 00034), Instituciò Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA Academia 2010) ), E FC pertencem ao grupo de pesquisa acreditado "Neuropharmacology and Pain" (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . O trabalho também foi apoiado pelo "Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras" da CAPES (Brasil) para FC
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| de Sacarose | Quí mica SL, Barcelona, Espanha | 1.316.211.211 | |
| CaCl2 | Pancreac Quí mica SL, Barcelona, Espanha | 2.112.211.210 | |
| MgCl2· 6H2O | Pancreac Quí mica SL, Barcelona, Espanha | 1,313,961,210 | |
| Conjunto de coquetel inibidor de protease III | Millipore, Darmstadt, Alemanha | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Quí mica SL, Barcelona, Espanha | 1,236,541,209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glycerol | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Bromofenol Blue | Pancreac Quí mica SL, Barcelona, Espanha | 1,311,651,604 | |
| Dithiothreitol | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Leite | |||
| NaCl | Pancreac Quí mica SL, Barcelona, Espanha | 1.216.591.211 | |
| KCl | Pancreac Quí mica SL, Barcelona, Espanha | 1.314.941.210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Quí mica SL, Barcelona, Espanha | 1.316.781.211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Espanha | ||
| Polytron VDI 12 Homogeneizador Adaptável | VWR, Radnor, PA, EUA. | ||
| Tubos Ultra-Clear (14x89mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | 344059 | Os tubos devem ser preenchidos quase completamente quando usados para evitar o colapso devido à ultracentrifugação. |
| Filtros centrífugos Amicon Ultra-15 Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha | UFC901008 | |
| Centrífuga 5430R | Eppendorf, Hamburgo, Alemanha | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Espanha | ||
| Pasteur Pippetes de vidro descartáveis 230 mm | VWR, Radnor, PA, EUA | 612-1702 | |
| Balança compacta EK-610 | A& D, Tóquio, Japão | ||
| Pierce™ Kit de Ensaio de Proteína BCA | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA | ||
| SuperSignal substrato quimioluminescente pico oeste | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA | ||
| GR 200 Balança de Precisão | A& D, Tóquio, Japão | ||
| Anti-GPR37 Anticorpo | caseiro anti-GPR37 produzido e validado no Laboratório Francisco Ciruela. | Anticorpos primários usados em uma concentração final de 0,250 μ g/mL | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-sinaptofisina | Abcam, Cambridge, Reino Unido | Anticorpos primários diluídos 1:10.000 | |
| HRP cabra conjugada anti-camundongo IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA. | Anticorpo secundário diluído 1:10.000 | |
| HRP cabra conjugada anti-coelho IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA. | Anticorpo secundário diluído 1:30.000 |
Referências
- Foster, M., Sherrington, C. S. Part III: The Central Nervous System. A Text Book of Physiology. , Macmillan: London. (1897).
- Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. The fine structure of the nervous system. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).
- Phillips, G. R., et al. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution. Neuron. 32, 63-77 (2001).
- Pinheiro, P. S., et al. Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).
- Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Res. 987, 49-58 (2003).
- Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat. Neuroscience. 132, 893-903 (2005).
- Rodrigues, R. J. Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat. J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).
- Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum. Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).
- Lopes, J. P., et al. The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system. J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR J. 38, 41-48 (1997).
- Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications. Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).
- Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).
- Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization. EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).
- Rezgaoui, M., et al. The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37. J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).
- Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain. J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).
- Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).
- Takahashi, R., Imai, Y. Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease. J. Neurol. 250, 9(2003).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
