Apresentamos um protocolo que combina o isolamento celular e a gravação de grampos-grampos de células inteiras para medir as propriedades elétricas das células epiteliais dissociadas primárias dos epidídimos da cauda do rato. Este protocolo permite a investigação das propriedades funcionais das células epiteliais primárias epidídmicas para elucidar ainda mais o papel fisiológico do epidídimo.
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Artigo de método
Gravação de grampos-grampo de células inteiras de células epiteliais primárias isoladas do epidídimo
Neste artigo
Resumo
Resumo
O epidídimo é um órgão essencial para a maturação do esperma e a saúde reprodutiva. O epitélio epididimétrico consiste em tipos de células intrinsecamente conectados que são distintos, não apenas em características moleculares e morfológicas, mas também em propriedades fisiológicas. Essas diferenças refletem suas diversas funções, que juntos estabelecem o microambiente necessário para o desenvolvimento do esperma pós-testicular no lúmen epidídimo. A compreensão das propriedades biofísicas das células epiteliais epididimais é fundamental para revelar suas funções no esperma e na saúde reprodutiva, em condições fisiológicas e fisiopatológicas. Embora suas propriedades funcionais ainda não tenham sido totalmente elucidadas, as células epiteliais epididimais podem ser estudadas usando a técnica de patch-clamp, uma ferramenta para medir os eventos celulares e as propriedades da membrana de células isoladas. Aqui, descrevemos os métodos de isolamento celular e gravação de grampos-grampos de células inteiras para meaCom certeza as propriedades elétricas das células epiteliais dissociadas primárias dos epidídimos da cauda do rato.
Introdução
O epidídimo no trato reprodutivo masculino é um órgão alinhado com uma camada de células epiteliais de mosaico. Como em outros tecidos epiteliais, os vários tipos de células do epitélio epidídmico, incluindo células principais, células claras, células basais e células dos sistemas imunológico e linfático, trabalham de forma concertada para funcionar como a barreira na linha de frente do túnete e como a Células de suporte para a maturação do esperma e fisiologia 1 , 2 , 3 . Assim, essas células epiteliais desempenham um papel essencial na saúde reprodutiva.
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Protocolo
Todos os experimentos com animais são realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Uso e Cuidados de Animais Institucionais da Universidade Shanghai-Tech, que cumprem os requisitos locais e internacionais.
1. Animais experimentais
- Use ratos Sprague-Dawley machos adultos (~ 300-450 g) entre 8 a 12 semanas de idade. A esta idade nos ratos, o esperma chegou aos epidídimos da cauda.
2. Isolamento de células epiteliais de Epididímides de Cauda de Rato
NOTA: As seguintes etapas são realizadas em condições não assépticas, salvo indicação em contrário.
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Resultados
O procedimento de digestão enzimática descrito para o isolamento de células epiteliais dos epidídimos de cauda de rato é um protocolo modificado de nossos estudos anteriores 9 , 12 . Este método produz uma mistura de células individuais com mais de 90% de viabilidade e sem bolhas de superfície ou volume de células inchadas. A mistura celular heterogênea consiste principalmente de células principais, células claras e células basai.......
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Discussão
Neste protocolo, a dispersão enzimática dos epidídimos de cauda de ratos produziu consistentemente células epiteliais saudáveis. A qualidade das células epiteliais epidídmicas para as experiências de grampos e grampo depende de alguns passos críticos no protocolo. Por exemplo, a centrifugação da mistura celular com baixa força centrífuga (30 xg) é importante para remover os espermatozóides e o conteúdo luminal epidídmico; As células epiteliais epididimais tornam-se pouco saudáveis na presença dos espermatozóides na cu.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Christopher Antos por comentários úteis sobre o texto. Este trabalho foi apoiado por fundos de inicialização da Universidade ShanghaiTech concedidos a Winnie Shum e pelo financiamento da National Natural Science Foundation of China (NNSFC nº 31471370).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Instrumento do sistema AXON | |||
| Amplificador controlado por computador | Dispositivos Moleculares - Amplificador Axon | Multiclamp 700B patch-clamp | |
| Sistema de Aquisição Digital | Dispositivos Moleculares - Conversor | Axon Digidata 1550 | |
| Câmara | MPC-325 | ||
| Instruments | TC-324C | ||
| Instrumento do sistema HEKA | |||
| Patch Clamp amplificador | Harvard Bioscience - HEKA | EPC-10 Microscópio duplo | |
| Câmara | Sutter Instruments MPC-325 | ||
| Warner Instruments | TC-324C | ||
| Outro Instrumento | |||
| Micropipeta Extrator | Sutter Instrument | Câmara de Gravação P-1000 | |
| Warner Instruments | RC-26G ou câmara | ||
| Vidro capilar de borosilicato com filamento | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Mesa de isolamento de vibração | TMC | 63544 | |
| Câmera Digital | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| strong>Reagents para isolamento | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihidrotestosterona | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Capricórnio | bovino fetal | FBS-12A | |
| Soluções internas de micropipeta (solução à base de K+) (pH 7,2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/vários | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/vários | M2393 | |
| EGTA, 0,1mM | Sigma/vários | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/ vários | V900477 | |
| K-gluconato, 100mM | Sigma / vários | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma / vários | A9187 | |
| < forte > A solução salina fisiológica de registro externo padrão (PSS) (pH 7,4, 300-310 mOsm) < / forte > | |||
| NaCl, 140mM | Sigma / vários | V900058 | |
| KCl, 4,7mM | Sigma/vários | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/vários | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/vário | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/vário | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/vário | V900477 | |
| Glicose, 10mM | Sigma / vários | V900392 | |
| < forte > para ajuste de pH< / forte > | |||
| NaOH | Sigma / vários | V900797 | Pureza > = 97% |
| KOH | Sigma / vários | 60371 | Pureza > = 99,99% |
Referências
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J.....
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Reimpressões e permissões
