O objetivo deste protocolo é demonstrar a preparação, cultura, tratamento e imunocoloração de explantes cocleares murinos neonatais. A técnica pode ser utilizada como ferramenta de seleção in vitro na pesquisa auditiva.
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Artigo de método
Técnica Explosiva Cochlear Murina Neonatal como um
Neste artigo
Resumo
Resumo
Embora tenha havido avanços notáveis na pesquisa auditiva nas últimas décadas, ainda não há cura para a Perda auditiva sensorial (SNHL), uma condição que tipicamente envolve danos ou perda das delicadas estruturas mechanosensoriais da orelha interna. Ensaios sofisticados in vitro e ex vivo surgiram nos últimos anos, permitindo a triagem de um número crescente de compostos potencialmente terapêuticos, minimizando os recursos e acelerando os esforços para desenvolver curas para SNHL. Embora as culturas homogêneas de certos tipos de células continuem a desempenhar um papel importante na pesquisa atual, muitos cientistas agora contam com culturas organotípicas mais complexas de orelhas internas murinas, também conhecidas como explantes cocleares. A preservação de estruturas celulares organizadas dentro da orelha interna facilita a avaliação in situ de vários componentes da infra-estrutura coclear, incluindo células ciliadas internas e externas, neurônios ganglionares espirais, neurItes, e células de apoio. Aqui apresentamos a preparação, a cultura, o tratamento e a imunocoloração de explantes cocleares murinos neonatais. A preparação cuidadosa desses explantes facilita a identificação de mecanismos que contribuem para o SNHL e constitui uma ferramenta valiosa para a comunidade de pesquisa auditiva.
Introdução
Perda auditiva sensorial (SNHL) reflete dano ao ouvido interno ou via auditiva ascendente. Embora a perda de audição seja o déficit sensorial mais comum em humanos 1 , as terapias curativas ainda não existem 2 . Embora os implantes de tronco encefálicos cocleares ou auditivos possam restaurar algum grau de audição para pacientes com SNHL grave a profunda, a audiência fornecida por esses dispositivos ainda é muito diferente da audiência "natural", especialmente durante as tentativas de entender a fala em ruído ou para ouvir música.
Embora a degeneração de células ciliadas tenha sido considera....
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Protocolo
O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal (IACUC) do Massachusetts Eye and Ear. Os experimentos foram realizados de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial.
1. Preparando a dissecação
- Preparando a mesa cirúrgica
- Use etanol a 70% para desinfectar a mesa cirúrgica.
- Coloque duas pastilhas não preparadas ao lado do microscópio.
- Prepare a bandeja do instrumento, incluindo tesouras de operação esterilizadas por calor, uma alça de bisturí, uma microcarga e fórceps (duas em cada # 4 e # 55). Coloque a bandeja do instrumento e uma....
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Resultados
Enquanto muitos protocolos se concentram no órgão dos explantes de Corti, essa técnica tenta preservar a anatomia de toda a curva coclear, incluindo os SGNs. Isso dá aos pesquisadores a oportunidade de analisar os efeitos de um determinado tratamento sobre neurites e somata de SGNs, além do órgão de Corti. Realizar uma dissecção que preserva parte do modiolus, como descrito aqui, é mais tecnicamente desafiador do que explantar o órgão de Corti sozinho. No entanto, a área de neurite e SGN.......
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Discussão
Os pesquisadores devem aperfeiçoar a técnica de dissecação antes de realizar experiências envolvendo explantes cocleares. As células do cabelo são comumente danificadas durante as dissecações realizadas no início da curva de aprendizado e um momento particularmente problemático para sua integridade é a remoção da membrana tectorial, que requer mãos firmes, ferramentas adequadas e experiência. Para economizar tempo e recursos, um controle visual deve ser realizado sob o microscópio de dissecação e áreas potencialmente da.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do Instituto Nacional de Surdez e Distúrbios da Comunicação R01DC015824 (KMS) e T32DC00038 (suporte de SD), o Departamento de Defesa concede W81XWH-15-1-0472 (KMS), a Fundação Bertarelli (KMS), o Nancy Sayles Day Foundation (KMS) e o Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Agradecemos a Jessica E. Sagers, BA por comentários perspicazes sobre o manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ampicilina, sal de sódio | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 anticorpo, camundongo (IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anticorpo anti-Myo7A, coelho | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H anticorpo, frango | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 anticorpo, camundongo (IgG2a) | Anticorpos Inc. | 75-028 | |
| anticorpo anti-TuJ1, camundongo | BioLegend | 801202 | |
| Adesivo de células e tecidos Cell-Tak, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR de 15 mL, fundo cônico, graduação, Greiner estéril | Bio-One | 188161 | |
| placa de cultura de células CELLSTAR, 100 x 20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| Placa de Cultura de Células CELLSTAR, 35 x 10 mm, 4 anéis internos | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Placa de Cultura de Células CELLSTAR, 60 x 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 mL Tubos de Centrífuga, fundo cônico, Graduação, Greiner Estéril | Bio-One | 227261 | |
| Clear Esmalte | Microscopia Eletrônica Ciências | 72180 | |
| Pratos de Fundo de Vidro de Parede Transparente (Vidro 40mm), PELCO®, Manga/20, 50 x 7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Lamínulas, Redondas, Vidro, 10 mm de diâmetro, Espessura #1, 0,13 - 0,16 mm | Ted Pella Inc. | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Água destilada, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM), glicose alta, piruvato, sem glutamina, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Fórceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Fórceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Álcool etílico (EtOH), Puro, 200 provas, anidro, ≥ 99,5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Soro Fetal Bovino (FBS), qualificado, regiões aprovadas pelo USDA, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Alíquota em tubos de 50 mL e armazenar em -20° C freezer |
| cabra anti-frango-647 anticorpo secundário | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| cabra anti-rato (IgG) -568 anticorpo secundário | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| cabra anti-rato (IgG1) -568 anticorpo secundário | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| cabra anti-rato (IgG2a) -488 anticorpo secundário | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| anticorpo secundário anti-coelho-488 de cabra | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, estéril, Água Ultra Pura EmbryoMax, 500 mL | EMD Solução | TMS-006-B | |
| Hank's (HBSS), cálcio, magnésio, sem vermelho de fenol, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| com tampa Faca | TechMed4255 | da Mountainside Medical | |
| - angular 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| , VistaVision, codificadas por cores, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm de espessura, brancas, pacote de 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Suplemento (100X), 5 mL | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Solução de bicarbonato de sódio 7,5%, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, solução de hidróxido de sódio, 1 L | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Tesoura cirúrgica | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| (PFA), Grau Reagente, Cristalino | Sigma-Aldrich | P6148 | Antes de usar: Estabeleça Procedimentos Operacionais Padrão com base em protocolos disponíveis online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave antes do uso |
| Faloidina, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Almofada de Preparação, Não Estéril | Safe-Lock Medline | 05136CS | |
| , Polipropileno, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave antes do uso |
| Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock, Polipropileno, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave antes do uso |
| Lâminas de Bisturi - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Cabo de Bisturi - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Zeiss | 000000-1106-133 | ||
| TCS SP5 microscópio confocal | Leica | N/A | |
| Triton-X (surfactante não iônico) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield meio de montagem antifade para fluorescência | Vector Laboratories, Inc. | Bolsa com zíper H-1000 | |
| , reutilizável, 4 x 6 '' - 2 mm de espessura | Zipline | 0609132541599 |
Referências
- Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062(2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C.
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Reimpressões e permissões
