Artigo de método

De células T isolamento da população Side em Myc induzida por leucemia linfoblástica aguda no peixe-zebra

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DOI:

10.3791/55711

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4 de maio de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Hematology-Oncology, The University of Chicago, 2Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos uma técnica para isolar as células de população lateral de um modelo zebrafish de leucemia linfoblástica aguda induzida por myc-T (T-ALL). Este ensaio de população lateral é altamente sensível e é descrito para T-ALL de peixe-zebra, mas pode ser aplicável a outros tipos de células zebrafish malignas e não malignas.

Resumo

populações celulares heterogéneas, a partir de qualquer dos tecidos saudáveis ​​ou malignas, podem conter uma população de células caracterizadas por uma capacidade diferencial para efluxo do corante de ligao a ADN Hoechst 33342. Este "população lado" de células podem ser identificados utilizando métodos de citometria de fluxo após a Hoechst 33342 corante é excitado por um (UV) do laser ultravioleta. A população lado de muitos tipos de células contem células progenitoras de haste ou semelhante. No entanto, nem todos os tipos de células têm uma população lado identificável. Danio rerio, peixe-zebra, tem um robusto em modelo vivo de células T leucemia linfoblástica aguda (LLA-T), mas se estes T-alls peixe-zebra tem uma população lado é desconhecida. O método descrito aqui descreve como para isolar as células da população lado em peixes-zebra T-ALL. Para começar, a T-ALL no peixe-zebra é gerado através da microinjeção de plasmídeos tol2 em embriões em estágio de uma célula. Uma vez que os tumores cresceram a uma fase em que eles se expandir para mais de metade do aniO corpo de mal, as células T-ALL podem ser colhidas. As células são depois coradas com Hoechst 33342 e examinadas por citometria de fluxo para as células da população lado. Este método tem amplas aplicações em peixe-zebra T-ALL pesquisa. Embora não existam marcadores de superfície celular conhecidos no peixe-zebra que confirmam se estas células da população lado são células-tronco como cancro, in vivo, ensaios de transplante funcionais são possíveis. Além disso, transcriptómica de célula única poderiam ser aplicados para identificar as características genéticas destas células população lado.

Introdução

O ensaio população lado capitaliza sobre a capacidade aumentada de determinadas células dentro de um tecido que efluxo o corante de ligao ao ADN Hoechst 33342, devido aos elevados níveis da cassete de ligao de ATP (ABC) proteínas transportadoras sobre a membrana celular. As células que efluxo o corante Hoechst 33342 pode ser identificado utilizando análise de citometria de fluxo duplo comprimento de onda após o corante é excitada por um laser de UV. Este ensaio foi utilizado pela primeira vez para identificar células estaminais hematopoiéticas murinas (HSCs) 1, mas foi uma vez utilizado para identificar populações de células estaminais / progenitoras em muitos tecidos e tipos de cancro (revisto em referência 2). No entanto, nem todas as populações de células têm uma população lado, e nem todas as populações laterais são enriquecidas para as células estaminais / progenitoras.

O peixe-zebra é um poderoso vertebrado sistema modelo genético para o estudo do cancro humano 3, 4, com um número de vantagens em relação mo murino tradicionaldels de cancro. Embriões de peixe-zebra são externamente fertilizado e são opticamente transparentes, facilitando transgénese e a observação in vivo de processos patológicos, incluindo a iniciação e progressão do cancro. Até à data, o ensaio população lado para detectar potenciais de células estaminais ou progenitoras só foi aplicada para a medula do rim em peixes-zebra para identificar HSCs, e não a quaisquer modelos de cancro de peixe-zebra 5, 6.

O modelo de peixe-zebra de células T de leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) é morfologicamente e geneticamente semelhante ao humano T-ALL 7, 8, 11. T-ALL é uma neoplasia agressiva que, em humanos, é responsável por 10-15% dos pediátrica e 25% dos adultos TODOS os casos 9. Embora o tratamento de LLA-T tem melhorado, recaída ainda é comum e está associado a um prognóstico pobre. T-ALL tumores são hétérogèneous e conter muitas subpopulações de células de tumor diferentes, incluindo leucemia iniciar células (PBR). PBR são definidas pela sua capacidade de voltar a crescer todo o tumor a partir de uma única célula, e a frequência de PBR dentro de uma população de células de tumor pode ser calculado através do transplante de células doses variadas para receptores por meio de um ensaio de transplante de diluição limitante (LDA). Embora as experiências foram efectuadas de LDA em peixes-zebra para calcular a frequência de PBR 8, 10, 11, esta determinação é feita em retrospectiva e não permite o isolamento potencial do PBR. Por conseguinte, um método para isolar prospectivamente uma população enriquecida em actividade de células estaminais do cancro é inexistente. A identificação e isolamento de células da população lado de peixe-zebra t-alls é o primeiro passo no sentido de resolver esta deficiência.

O protocolo aqui apresentado descreve como gerar de forma eficiente T-ALL tumores em ZEBRafish utilizando transgénese mediada por tol2, a colheita das células T-ALL tumores, e mancham-los com Hoechst 33342 para identificar a população de células lado. Futuro em experiências in vivo com peixe-zebra LLA-T poderia incluir se as células da população lateral são enriquecidos para os PBR ou têm outras propriedades de haste ou progenitoras semelhantes.

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Protocolo

Todos os procedimentos com peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) na Universidade de Chicago. A Universidade de Chicago é credenciada pela Associação para Avaliação e Acreditação de Laboratório Animal Care (AAALAC).

1. Geração e isolamento de células T-ALL marcadas fluorescentemente em Zebrafish

  1. Microinjeção em embriões de peixe-zebra singênico
    1. Utilizando kits comercialmente disponíveis, isolar o ADN plasmídico de rag2 : c-myc e rag2 : proteína fluorescente verde ( rag2 : GFP) contendo repetições terminais invertidas reconhecidas por tol2 transposase (ver Tabela de Materiais para fonte de ADN plasmídico) 12 e eluir o ADN Em água estéril.
      NOTA: O GFP é usado neste estudo, mas qualquer proteína fluorescente funcionará.
    2. Preparar pCS2-transposase (tol2) RNA
      1. Isolar o ADN plasmídico tol2 utilizando kits comercialmente disponíveis (ver tele Tabela de Materiais para a fonte de ADN de plasmídeo) 12 e elui-se o ADN em água estéril.
      2. Incubar 1 ug de ADN tol2 a 37 ° C durante 1 h com 5 unidades de enzima de restrição de Notl no tampão apropriado para linearizar o plasmídeo. Calor-inactivar o NotI a 65 ° C durante 20 min.
      3. Transcrever o ARN tol2 com polimerase de ARN de SP6 do ADN linearizado utilizando um kit de transcrição de ARN disponível comercialmente 13. Armazenar o ARN em alíquotas de uso único, a -80 ° C.
    3. Preparar a mistura de injecção em gelo pela adição de 250 ng de RAG2: ADN de plasmídeo c-myc, 250 ng de RAG2: GFP plasmídeo de ADN, 150 ng de ARN tol2, e 0,5 mL de fenol vermelho. Ajustar o volume para 10 mL com água isenta de nuclease.
    4. Injectar ~ 1 nL de mistura de injecção para a célula de um estádio de uma célula de embrião do peixe-zebra singeneicos utilizando um micro-injector e a agulha puxada a partir de um tubo capilar de vidro, seguindo anteriormente estabemétodos cido 8, 14.
      NOTA: peixe-zebra Singênico gerado por partenogénese 15 são utilizados aqui para eliminar a heterogeneidade genética e rejeição imunitária após o transplante. No entanto, também pode ser utilizado de tipo selvagem de peixe-zebra ou qualquer estirpe desejada.
    5. Remover embriões mortos, subdesenvolvidos, ou malformados às 24 h e 48 h pós-injecção 16.
    6. Coloque o peixe injectado no sistema de peixe aos 6 dias pós-injecção e levantá-los de acordo com o protocolo padrão de 6.
  2. Rastreio de peixe-zebra injectada e acompanhar o crescimento tumoral
    1. Aos 21 dias pós-injecção, colocar uma única larva injectado em uma gota de meio de embriões em uma placa de Petri e tela de fluorescência de GFP por meio de um microscópio de epifluorescência (excitação de passagem de banda: 470/40, de passagem de banda de emissão: 525/50) 8.
      NOTA: larvas do peixe que hAve integrada tanto rag2 : c-myc e rag2 : GFP terá um timo fluorescente verde (peixe positivo) e pode já exibir a expansão de células fluorescentes verdes malignas para além do timo. Todos os peixes com um GFP + timo irão desenvolver um GFP + T-ALL. As larvas que não demonstram a integração dos plasmídeos não terão quaisquer células fluorescentes verdes (peixes negativos).
    2. Separar os peixes negativos (com base numa falta de fluorescência) num tanque diferente e monitorizar os peixes novamente aos 28 e 35 dias após a injecção. Aos 28 e 35 dias após a injeção, anestesiar o peixe com 0,02% de tricaína tamponada (MS-222) em água do sistema de peixes antes do rastreio.
    3. Coloque cada larva zebrafish que é positivo para um timo marcado fluorescentemente ou um tumor marcado fluorescentemente em um tanque individual para monitorar o crescimento do tumor três vezes por semana.
  3. A recolha de células T-ALL marcadas fluorescentemente a partir do peixe de tumor primário
    1. Preparar pelo menos 20 ml de soro fetal de bovino inactivado pelo calor 10% em 0,9x tampão fosfato salino (FBS / PBS).
    2. Adicionar 1 mL de FBS / PBS a um frasco de sal de sódio de heparina (300 unidades).
    3. Seleccionar peixe portadores de tumores em mais de 50% do corpo, ou aqueles peixes que tem dificuldade em comer ou natação. Sacrificar o peixe por sobredosagem com eles tricaina ou por imersão em água gelada. Confirmar a morte por falta de um movimento de emalhar e os batimentos cardíacos.
    4. Utilizar uma lâmina de barbear para remover a cabeça do peixe.
    5. Lava-se a cavidade do peixe com a solução de heparina, para remover os glóbulos vermelhos em excesso.
      1. Usando uma pipeta, injectar 100 ul de solução de heparina (preparado no passo 1.3.2) na cavidade do corpo do peixe. Remover todo o líquido que sai (irá conter os glóbulos) e pipeta-lo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      2. Usar uma nova ponta de pipeta para lavar o corpo de novo. Executar, pelo menos, três lavagens, ou até que o líquido que sai aparecer livre de blOod.
      3. Descarte todo o líquido das lavagens nos passos 1.3.5.1 e 1.3.5.2, uma vez que não será utilizado em análises adicionais.
    6. Recolher as células de leucemia.
      1. Injectar 100 μL de FBS / PBS na cavidade corporal do peixe.
      2. Aplique suave pressão para o exterior do corpo do peixe com a ponta da pipeta para espremer / empurrar as células tumorais.
        NOTA: Se esta etapa é realizada usando um microscópio de dissecação, as células tumorais derramando fora da cavidade do corpo será evidente.
      3. Recolher o líquido e as células de cada lavagem em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      4. Repita os passos 1.3.6.1-1.3.6.3 até a maioria das células tumorais serem coletadas (geralmente 5-10 vezes). Recolher todas as células tumorais no mesmo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Manter as células à temperatura ambiente.
    7. Misturam-se as células tumorais recolhidas do passo 1.3.6 pipetando-as suavemente para dissociar os aglomerados de células. Filtrar a suspensão de células através de um 4Filtro de malha de 0 μm. Lavar o filtro 1-2 vezes com 100 μL de FBS / PBS. Manter as células à temperatura ambiente.
    8. Misture 2 μL de suspensão celular com 18 μL de azul de tripano (0,4%, diluído 1:10 e filtrado) num novo tubo. Carregar 10 μL num hemocitómetro e contar o número de células fluorescentes vivas (não azuis) para calcular o número de células tumorais isoladas.
      NOTA: As células GFP-negativas não-azuis são provavelmente células T normais não malignas e não devem ser contadas. São necessárias pelo menos 2 x IO6 células para corar as células com Hoechst 33342.

2. Coloração das células T-ALL marcadas fluorescentemente com Hoechst 33342 para identificar a população lateral

  1. Diluir Hoechst 33342 1:10 com H 2 O nuclease-livre para fazer a concentração de trabalho de 1 mg / mL. Armazenar o corante a 4 ° C e no escuro.
  2. Preparar uma solução 100 mM de verapamil por dissolução de 49,1 mg em 1 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO).
    NOTA: Verapamil é um inibidor de transportadores ABC e é um importante controle para experimentos de populações laterais. A adição de verapamilo a amostras irá inibir a capacidade dos transportadores ABC de efluxar o corante Hoechst 33342. Portanto, uma verdadeira população lateral desaparecerá quando o verapamil for adicionado à amostra.
  3. Coloque um banho-maria a 28 ° C.
  4. Preparar amostras e controles no escuro, adicionando células e soluções a fluorescência ativado por classificador de células (FACS) tubos.
    1. Prepare as amostras adicionando 10 6 células, 15 μL de Hoechst 33342 a 1 mg / mL e 2,5 μL de DMSO a um tubo FACS. Ajustar o volume para 1 mL com FBS / PBS.
    2. Preparar os controlos adicionando 10 6 células, 15 μL de Hoechst 33342 a 1 mg / mL e 2,5 μL de verapamil 100 mM a um tubo FACS. Ajustar o volume para 1 mL com FBS / PBS.
      NOTA: Recomenda-se um mínimo de 10 6 células / amostra, mas é preferível a coloração de células, especialmente se a população lateralcélulas de iões serão classificados para análise posterior. Não exceder 10 6 células / ml, e manter a concentração de Hoechst 33342 a 15 ug / mL. Se 10 x 10 6 culas s coradas, o volume total da reacção é de 10 ml.
  5. Incubar em um banho de ua 28 ° C no escuro durante 120 min.
  6. Após a incubação, colocar as células imediatamente em gelo e mantê-los no escuro.
  7. Sedimentar as células a 4 ° C durante 6 min a 300 x g. Remover o sobrenadante. Lava-se com 1 mL de FBS / PBS.
  8. Sedimentar as células a 4 ° C durante 6 min a 300 x g. Remover o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 ml de FBS / PBS.
  9. Manter a 4 ° C até à separação de células.
  10. 15 min antes da separação de células, adiciona-se 2 mL de iodeto de propídio estoque (PI) (1 mg / mL) para cada 1 mL de FBS / PBS (concentração final: 2 ug / ml). Misture bem.

3. Use FACS encontrar o População Side dentro do T-ALL população de células fluorescente etiquetado

  1. Analisar os T-ALL suspensões de células coradas de peixe-zebra em um classificador de células equipado com um laser de UV para a Hoechst 33342 corante de excitação e um laser de 488 nm para a excitação PI e para a detecção dos GFP + células T-ALL.
  2. Determine um portão para o ao vivo, GFP + T-ALL células.
    1. Uso de dispersão frontal (FSC) e dispersão lateral área (SSC) a porta para fora detritos.
      NOTA: FSC é usado para distinguir o tamanho celular e SSC é usado para distinguir a granularidade da célula.
    2. Use FSC eo SSC width para discriminar dobletes.
      NOTA: Não há três componentes identificados pelo citetro de fluxo detectores: área, altura e largura. Área é normalmente usado para medir a fluorescência da célula. Largura mede a tempo de voo e é o dobro da largura, se duas células são aglutinados.
    3. Para as células tumorais vivas, desenhar uma porta em torno das células positivas para GFP e negativas para PI usando os detectores apropriados (por exemplo, FITC para GFP e PerCP Cy5-5 para PI).
  3. No portão de células vivas, medir a Hoechst 33342 fluorescência através dos filtros de banda Hoechst azul e Hoechst vermelhos (450/50 e 670/30, respectivamente).
    NOTA: A população lado, se estiver presente, será evidente após este está configurado. Importante, a população lado deve desaparecer no controlo verapamil em ordem para que possa ser considerada uma população lado verdadeiro.
  4. Se a classificação de células da população lado para outras experiências, utilizar o grande ponta do bocal (100? M) e recolher as células num tubo de FACS contendo 3 mL de 100% de FBS. Utilizar uma ponta maior do bocal (100 um) em vez da ponta menor (70? M) para melhorar a viabilidade celular, após separação.

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Resultados

Para gerar eficientemente tumores T-ALL induzidos por myc induzidos por fluorescência em peixe-zebra, as construções de ADN circulares flanqueadas por locais de transposase tol2 podem ser co-injectadas com ARN tol2. Estudos prévios da injeção de DNA linearizado em embriões de peixe-zebra relatam uma taxa de transgênese de 5% 8 . Com o protocolo ajustado para incluir a transgénese mediada por tol2, podem ser observadas taxas de transgénese que variam de 10-44% (

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Discussão

O ensaio de população lateral é altamente sensível; Portanto, pequenas alterações no protocolo podem resultar em uma dificuldade na detecção de células populacionais laterais. Em primeiro lugar, a temperatura durante o passo de coloração é específica para cada sistema de animal / célula. Para sistemas de mamíferos, o ensaio de população lateral é tipicamente realizado a 37 ° C 2 . Quando as células T-ALL de zebrafish foram incubadas a 37 ° C, muitas das células morreram, o que tornou esta tempera...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela University of Chicago Women's Board, o Wendy Will Case Fund, e da Universidade de Chicago Comprehensive Cancer Center Grant Grant (P30 CA014599). Gostaríamos de agradecer ao Flow Cytometry Core da Universidade de Chicago por sua ajuda na criação deste experimento, bem como outros membros do laboratório de de Jong, particularmente Leslie Pedraza e Sean McConnell.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Peixe-zebra singênico (CG2)Ver Mizgireuv et al., 2006
rag2:plasmídeoLaboratório Langenau
rag2:Plasmídeo GFP construído no promotor do Laboratóriorag2 do
plasmídeo
Laboratório NotI -HF enzima de restriçãoNew England Bio-Labs Inc.R3189S500 unidades em 25 e micro;
L mMessage Machine SP6 Kit de TranscriçãoAmbionThermo Fisher Scientific - AM134025 reações
QIAGEN Plasmid Midi KitQiagen, Inc.12643
SteREO Discovery V8Microscopia Carl Zeiss Microscopia495015-0008-000
Digital MicroinjetorTritech ResearchMINJ-D
Suporte de agulha de braço reto de latãoTritech ResearchMINJ-4
Base magnética e suporteTritech ResearchMINJ-HBMB
MicromanipuladorNarishige InternationalMN153
capilares de vidroSutter Instrument Co.B100-50-10 10cm sem filamento
Extrator de micropipetas flamejante/marromSutter Instrument Co.Ponteiras de pipeta P-97
MicroloaderEppendorf North America Inc.
solução de vermelho de fenolSigma Life ScienceP0290de 0,5% 100 mL
pipetas de transferência de plásticoFisherbrand137119Dgraduado 7,5 mL bulbo
de tricaína metanossulfonato (MS-222)Western Chemical, Inc.Fisher Scientific - NC0342409100 g
de soro fetal bovino (FBS)HyClone Laboratories, Inc.Fisher Scientific - SH3007103500 mL
de solução salina tamponada com fosfato (PBS)Gibco da Life Technologies1001-023pH 7.4 (1x) - 500 mL
Sal de heparina sódicaSigma-Aldrich210615 - 300 unidades de frascos 40
µ m filtro de malhaFalcon Corning Brand352340Caixa de 50
Trypan blueSigma Life ScienceT815420 mL - Solução (0.4%)
Hoechst 33342Life TechnologiesH357010 mL
VerapamilSigma Life ScienceV46291 g
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma Life ScienceD8418100 mL
Propidium IodideLife TechnologiesP356610 mL
FACSAria Classificador de células de fusãoBD Biosciences
BD FACSDiva 8.0.1BD Biosciences
FlowJo v10.2FlowJo, LLC
c-myc de Jong pCS2-transposase do Laboratório Langenau 930001007 concentração

Referências

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