Artigo de método

De células T isolamento da população Side em Myc induzida por leucemia linfoblástica aguda no peixe-zebra

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DOI:

10.3791/55711

4 de maio de 2017

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos uma técnica para isolar as células de população lateral de um modelo zebrafish de leucemia linfoblástica aguda induzida por myc-T (T-ALL). Este ensaio de população lateral é altamente sensível e é descrito para T-ALL de peixe-zebra, mas pode ser aplicável a outros tipos de células zebrafish malignas e não malignas.

Resumo

populações celulares heterogéneas, a partir de qualquer dos tecidos saudáveis ​​ou malignas, podem conter uma população de células caracterizadas por uma capacidade diferencial para efluxo do corante de ligao a ADN Hoechst 33342. Este "população lado" de células podem ser identificados utilizando métodos de citometria de fluxo após a Hoechst 33342 corante é excitado por um (UV) do laser ultravioleta. A população lado de muitos tipos de células contem células progenitoras de haste ou semelhante. No entanto, nem todos os tipos de células têm uma população lado identificável. Danio rerio, peixe-zebra, tem um robusto em modelo vivo de células T leucemia linfoblástica aguda (LLA-T), mas se estes T-alls peixe-zebra tem uma população lado é desconhecida. O método descrito aqui descreve como para isolar as células da população lado em peixes-zebra T-ALL. Para começar, a T-ALL no peixe-zebra é gerado através da microinjeção de plasmídeos tol2 em embriões em estágio de uma célula. Uma vez que os tumores cresceram a uma fase em que eles se expandir para mais de metade do aniO corpo de mal, as células T-ALL podem ser colhidas. As células são depois coradas com Hoechst 33342 e examinadas por citometria de fluxo para as células da população lado. Este método tem amplas aplicações em peixe-zebra T-ALL pesquisa. Embora não existam marcadores de superfície celular conhecidos no peixe-zebra que confirmam se estas células da população lado são células-tronco como cancro, in vivo, ensaios de transplante funcionais são possíveis. Além disso, transcriptómica de célula única poderiam ser aplicados para identificar as características genéticas destas células população lado.

Introdução

O ensaio população lado capitaliza sobre a capacidade aumentada de determinadas células dentro de um tecido que efluxo o corante de ligao ao ADN Hoechst 33342, devido aos elevados níveis da cassete de ligao de ATP (ABC) proteínas transportadoras sobre a membrana celular. As células que efluxo o corante Hoechst 33342 pode ser identificado utilizando análise de citometria de fluxo duplo comprimento de onda após o corante é excitada por um laser de UV. Este ensaio foi utilizado pela primeira vez para identificar células estaminais hematopoiéticas murinas (HSCs) 1, mas foi uma vez utilizado para identificar populações de células estaminais / proge....

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Protocolo

Todos os procedimentos com peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) na Universidade de Chicago. A Universidade de Chicago é credenciada pela Associação para Avaliação e Acreditação de Laboratório Animal Care (AAALAC).

1. Geração e isolamento de células T-ALL marcadas fluorescentemente em Zebrafish

  1. Microinjeção em embriões de peixe-zebra singênico
    1. Utilizando kits comercialmente disponíveis, isolar o ADN plasmídico de rag2 : c-myc e rag2 : proteína fluorescente verde ( rag2 : GFP) contendo repetições terminais invertidas reconhecidas por tol2 transp....

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Resultados

Para gerar eficientemente tumores T-ALL induzidos por myc induzidos por fluorescência em peixe-zebra, as construções de ADN circulares flanqueadas por locais de transposase tol2 podem ser co-injectadas com ARN tol2. Estudos prévios da injeção de DNA linearizado em embriões de peixe-zebra relatam uma taxa de transgênese de 5% 8 . Com o protocolo ajustado para incluir a transgénese mediada por tol2, podem ser observadas taxas de transgénese que variam de 10-44% (

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Discussão

O ensaio de população lateral é altamente sensível; Portanto, pequenas alterações no protocolo podem resultar em uma dificuldade na detecção de células populacionais laterais. Em primeiro lugar, a temperatura durante o passo de coloração é específica para cada sistema de animal / célula. Para sistemas de mamíferos, o ensaio de população lateral é tipicamente realizado a 37 ° C 2 . Quando as células T-ALL de zebrafish foram incubadas a 37 ° C, muitas das células morreram, o que tornou esta tempera.......

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela University of Chicago Women's Board, o Wendy Will Case Fund, e da Universidade de Chicago Comprehensive Cancer Center Grant Grant (P30 CA014599). Gostaríamos de agradecer ao Flow Cytometry Core da Universidade de Chicago por sua ajuda na criação deste experimento, bem como outros membros do laboratório de de Jong, particularmente Leslie Pedraza e Sean McConnell.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Peixe-zebra singênico (CG2)Ver Mizgireuv et al., 2006
rag2:plasmídeoLaboratório Langenau
rag2:Plasmídeo GFP construído no promotor do Laboratóriorag2 do
plasmídeo
Laboratório NotI -HF enzima de restriçãoNew England Bio-Labs Inc.R3189S500 unidades em 25 e micro;
L mMessage Machine SP6 Kit de TranscriçãoAmbionThermo Fisher Scientific - AM134025 reações
QIAGEN Plasmid Midi KitQiagen, Inc.12643
SteREO Discovery V8Microscopia Carl Zeiss Microscopia495015-0008-000
Digital MicroinjetorTritech ResearchMINJ-D
Suporte de agulha de braço reto de latãoTritech ResearchMINJ-4
Base magnética e suporteTritech ResearchMINJ-HBMB
MicromanipuladorNarishige InternationalMN153
capilares de vidroSutter Instrument Co.B100-50-10 10cm sem filamento
Extrator de micropipetas flamejante/marromSutter Instrument Co.Ponteiras de pipeta P-97
MicroloaderEppendorf North America Inc.
solução de vermelho de fenolSigma Life ScienceP0290de 0,5% 100 mL
pipetas de transferência de plásticoFisherbrand137119Dgraduado 7,5 mL bulbo
de tricaína metanossulfonato (MS-222)Western Chemical, Inc.Fisher Scientific - NC0342409100 g
de soro fetal bovino (FBS)HyClone Laboratories, Inc.Fisher Scientific - SH3007103500 mL
de solução salina tamponada com fosfato (PBS)Gibco da Life Technologies1001-023pH 7.4 (1x) - 500 mL
Sal de heparina sódicaSigma-Aldrich210615 - 300 unidades de frascos 40
µ m filtro de malhaFalcon Corning Brand352340Caixa de 50
Trypan blueSigma Life ScienceT815420 mL - Solução (0.4%)
Hoechst 33342Life TechnologiesH357010 mL
VerapamilSigma Life ScienceV46291 g
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma Life ScienceD8418100 mL
Propidium IodideLife TechnologiesP356610 mL
FACSAria Classificador de células de fusãoBD Biosciences
BD FACSDiva 8.0.1BD Biosciences
FlowJo v10.2FlowJo, LLC
c-myc de Jong pCS2-transposase do Laboratório Langenau 930001007 concentração

Referências

  1. Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
  2. Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S.

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