Apresenta-se um protocolo para isolar fragmentos microvasculares derivadas de tecido adiposo que representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser isolados rapidamente, não requerem processamento in vitro e, assim, pode ser utilizado para prevascularization um passo em diferentes campos da engenharia de tecidos.
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Artigo de método
Isolamento de Murino adiposo derivada de tecido microvascular Fragmentos como Vascularização Unidades para engenharia de tecidos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma rede microvascular funcional é de importância crucial para a sobrevivência e integração de construções de tecido de engenharia. Para isso, várias estratégias angiogênicos e prevascularization foram estabelecidas. No entanto, a maioria das abordagens com base em células in vitro incluem passos que consomem tempo para a formação de uma rede microvascular. Assim, eles não são adequados para procedimentos de uma etapa intra-operatórios. Adiposos fragmentos microvasculares derivadas de tecido (ad-MVF) representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser facilmente isolados a partir de tecido gordo e exibem uma morfologia de microvasos funcional. Além disso, eles rapidamente remontar em novas redes microvasculares após implantação in vivo. Além disso, ad-MVF foram mostrados para induzir linfangiogênese. Finalmente, eles são uma fonte rica de células-tronco mesenquimais, que pode ainda contribuir para o seu alto potencial de vascularização. Em estudos anteriores que demonstraram a vascularizati notávelna capacidade de ad-MVF em substitutos ósseos e pele de engenharia. No presente estudo, são descritos em um protocolo padronizado para o isolamento enzimático de ad-MVF de tecido adiposo murino.
Introdução
A engenharia de tecidos centra-se na fabricação de tecidos e de órgãos substitutos que manter, aumentar ou restaurar a função de inoperável em homólogos in vivo 1, 2. O destino de construções de engenharia de tecidos depende essencialmente uma vascularização adequada 3. Redes microvasculares dentro dessas construções devem ser hierarquicamente organizado com arteríolas, capilares e vênulas para permitir perfusão sanguínea eficiente após inosculation a vasculatura do destinatário 4. A geração de tais redes é um dos principais desafios em engenharia de tecidos. Para isso, um amplo espectro de estratégias de vascularização experimentais foi introduzido ao longo das últimas duas décadas 5, 6.
abordagens angiogénicos estimular o crescimento de microvasos em receptores tiss engenhariaues por meio de modificação estrutural andaime ou físico-químicas, tais como a incorporação de factores de crescimento 7. No entanto, a vascularização de grandes construes tridimensionais, estratégias dependentes da angiogénese são marcadamente limitados por baixas taxas de crescimento de microvasos a desenvolver 8.
Em contraste, o conceito de prevascularization tem como objectivo para a geração das redes microvasculares funcionais dentro do tecido constrói antes da sua implantação 9. Prevascularization convencional envolve a co-cultura de células formadoras de vasos, tais como células endoteliais, células mural ou células-tronco 10, dentro de andaimes. Após a formação da rede microvascular, as construções prevascularized pode então ser implantado num defeitos de tecidos. Contudo, tal abordagem prevascularization é difícil de aplicar em um ambiente clínico, porque se baseia no complexo e demorado in vitro </ em> procedimentos, que são restritos por grandes obstáculos regulatórios 9. Por conseguinte, existe ainda uma necessidade para o desenvolvimento de novas estratégias prevascularization que são mais adequados para uma aplicação clínica ampla.
Tal estratégia prevascularization pode ser a aplicação de fragmentos microvasculares derivadas de tecido adiposo (ad-MVF). ad-MVF representam unidades de vascularização potentes que podem ser colhidas em grandes quantidades a partir do tecido adiposo de ratos 11, 12 e 13 ratinhos. Eles consistem de arteríolas, capilares, e segmentos de vasos venulares, que exibem uma morfologia de microvasos fisiológico com um lúmen e estabilizantes células perivasculares 14, 15. Esta característica única permite a implantação imediata de andaimes ad-MVF-semeado em defeitos de tecido sem pré-cultura. Lá, o ad-MVF remontar rapidamente ema redes microvasculares funcionais. Além disso, ad-MVF representam uma rica fonte de células-tronco mesenquimais 16, que pode ainda contribuir para a sua capacidade de regeneração impressionante. Por conseguinte, ad-MV F são cada vez mais utilizado em diferentes campos da engenharia de tecidos 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
O isolamento de ad-MVF foi estabelecida originalmente em ratos 11, 12. Aqui, nós descrevemos um protocolo, que permite o isolamento padronizado de murino ad-MVF de almofadas de gordura epididimal. Isto pode facilitar uma melhor compreensão sobre os mecanismos moleculares subjacentes à função de ad-MVF usando modelos de ratinhos transgénicos.
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Protocolo
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Instituto Nacional de diretrizes de saúde para o uso de animais de laboratório e seguindo as orientações institucionais (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Alemanha).
1. Preparação de Instrumentos Cirúrgicos
- Manter prontas as tesouras de dissecação, pinças cirúrgicas, uma tesoura pequena de preparação, uma pinça fina e uma placa de Petri estéril com meio de Eagle modificado por 15 ml de Dulbecco (DMEM, 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 100 U / mL de penicilina, 0,1 mg / mL de estreptomicina ) para a colheita de almofadas de gordura epididimal.
- Expor os instrumentos cirúrgicos para uma solução desinfectante para 5 min. Alternativamente, esterilizá-los (esterilização a vapor; 121 ° C, 20 min).
2. Animais e Anestesia
- Escolher cuidadosamente a estirpe de ratinhos, tal como indicado para o estudo e o assunto sob investigação.
Nota: Neste estudo foi utilizada macho de tipo selvagem ratinhos C57BL / 6 como dadores para a colheita de gordura epididimal. De interesse, ad-MVF pode ser também isolado a partir de transgénicos proteína fluorescente (GFP) animais dadores -positivas verdes (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) 22. Isto leva a grande vantagem de que os fragmentos são facilmente detectáveis por coloração imuno-histoquímica de GFP após a implantação em ratinhos de tipo selvagem GFP-negativo 14. - Anestesiar os animais com uma injecção intraperitoneal de xilazina (15 mg / kg) e cetamina (75 mg / kg). Certifique-se de que os animais estão profundamente anestesiados através da realização de uma pitada dedo do pé sem resposta. lubrificante olho não é indicada como os animais dadores são sacrificados após a colheita de gordura.
NOTA: Certifique-se de que a analgesia e esterilidade cirúrgica estão de acordo com as respectivas diretrizes do país e instituição onde estão previstos os experimentos.
- Transferir o animal a uma mesa de operação. Colocar o animal em decúbito dorsal sob uma lupa cirúrgica e confirmar anestesia profunda usando toe pitada.
- Imobilizar as patas gravando-los para um campo cirúrgico e desinfectar o abdome com solução desinfetante.
- Separar a pele abdominal livre da camada muscular subjacente com a tesoura de dissecção.
- Executar uma laparotomia na linha média com as tesouras de dissecação e lateralmente desdobrar as abas da parede abdominal.
- Bilateralmente identificar testículo, epidídimo e a gordura epididimal usando os fórceps finos (Figura 1). Não prejudicar as estruturas intestinais para evitar a contaminação fecal das bolsas de gordura.
- Colher as almofadas de gordura epididimal com as pequenas tesouras de preparação e as pinças finas sob o microscópio estereoscópico. Manter uma margem de segurança de vários mm entre o epidídimo e a gordurareduzir o risco de colheita epididimal acidental.
NOTA: Este procedimento também pode ser realizado sem um microscópio estereoscópico. No entanto, isto pode aumentar ainda mais o risco de lesão acidental do epidídimo e cabos espermático. - Transferir as almofadas de gordura epididimal em uma placa de Petri contendo 15 ml de DMEM pré-aquecida a 37 ° C durante o transporte para o laboratório de células.
- Sacrificar o animal por incisão da aorta abdominal ou luxação cervical.
4. Isolamento de ad-MVF
- Prepare três placas de Petri estéreis com 15 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), estéril de polipropileno de 14 mL tubos (PP), uma de 50 mL estéril, Erlenmeyer estéreis de 1,5 ml cónico de tubos de microcentrífuga e tesouras finas esterilizados.
- Lavam-se as almofadas de gordura três vezes em placas de Petri com 15 mL de PBS sob uma câmara de fluxo laminar.
- Transferir a gordura para um tubo de 14 mL PP. Determinar o volume de tecido adiposo colhido (em ml), por meio de tele escala tubo. Picar o tecido adiposo mecanicamente com as tesouras finas, até uma suspensão de tecido homogénea.
- Transferir o tecido triturado com dois volumes de colagenase NB4G (0,5 U / mL de PBS) em um balão de 50 mL Erlenmeyer por meio de 10 mL de medição pipeta. O volume total torna-se três vezes o volume de tecido adiposo medida no passo 4.3. Realizar a digestão do tecido em um incubador durante 10 min, sob agitação vigorosa por meio de um agitador automatizado (tamanho da barra de agitação magnética: 25 mm) a 37 ° C e as condições atmosféricas húmida com 5% de CO 2.
- Observar uma pequena fracção (10 pL) do tecido digerido sob um microscópio para julgar se a digestão pode ser parada. Verificar que o digerido contém principalmente "livre" ad-MVF lado de células individuais, indicando o ponto apropriado para interromper o processo de digestão enzimática (Figura 2).
NOTA: Este passo exige experiência com o procedimento e é fundamental para a qualidadede isolado ad-MVF. Prolongada resultados digestão de gordura em uma suspensão de uma única célula, sem ad-MVF. - Neutraliza-se a enzima com dois volumes de PBS / FCS a 20%. O volume total torna-se três vezes o volume da suspensão de células-vaso no passo 4.4. Transferir a suspensão de células-vaso de volta para novos tubos PP.
- Incubar a suspensão durante 5 minutos a 37 ° C para separar ad-MVF de gordura restante por gravidade. Em seguida, remover cuidadosamente o sobrenadante principal gordura com uma pipeta de precisão, 1-mL. Repetir este ciclo várias vezes com uma pipeta de precisão de 100 uL até a suspensão parece ser isento de gordura.
- Colocar um filtro de 500? M por cima de um tubo de centrífuga cónico de 50 ml. Transferir a suspensão de células-embarcação com uma pipeta de medição de 10 ml dos 14 ml tubos PP na membrana de filtro para remover o restante coágulos de gordura. Transferir a suspensão filtrada para novos tubos de 14 mL de PP de acordo com o número de individual ad-MVF isolados para as experiências planeadas.
NOTA: Para em vitrO ensaios de focagem sobre a formação da rede microvascular, pode ser benéfico para purificar ainda mais a suspensão de células-navio para melhorar a qualidade da imagem durante a análises microscópicas. Para este fim, a suspensão pode ser, adicionalmente, uma vez filtrada com um filtro de 20 mícrons para remover as células individuais do ad-MVF recolhidas no filtro. - Centrifugar a suspensão de células-reservatório (600 xg, 5 min, temperatura ambiente) para obter um pelete contendo ad-MVF.
- Após centrifugação, remove-se o sobrenadante até 1 ml é deixado. Ressuspender o sedimento com ad-MVF neste 1 mL e transferir a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml cónico.
- Centrifugar a suspensão ad-MV F no tubo de microcentrífuga (600 xg, 5 min) para obter um pelete.
- Remover o sobrenadante para ressuspender o sedimento no volume final requerido de PBS / FCS a 20%.
NOTA: O número de ad-MVF por isolado pode ser avaliada por contagem microscópica. Para esta finalidade, 1/10 da célula-vesse definitival suspensão foi diluída a 1:10 em PBS e 100 ul desta diluição é transferida para um poço de uma placa de 96 poços. Todo o número de ad-MVF exibindo uma morfologia vaso semelhante é então contado e extrapolado para todo o isolado. A concentração ad-MVF necessário e a purificação pode ser adaptado individualmente ao respectivo in vitro ou in vivo de aplicação do ad-MVF. Isto pode incluir a incorporação de ad-MVF em géis de colagénio para a análise in vitro de formação de rede microvascular ou a semeadura de ad-MVF em andaimes para implantação in vivo em defeitos de tecidos.
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Resultados
No presente estudo foi realizada seis procedimentos de isolamento ad-MVF com tecido adiposo a partir de 7- ao macho de tipo selvagem de 12 meses de idade C57BL 6 ratinhos / (peso corporal médio: 35 ± 1 g). A Figura 1 ilustra a colheita das almofadas de gordura epididimal de murino com subsequente isolamento mecânico e enzimática ad-MVF. O tempo necessário para a colheita de gordura foi de 30 minutos e para o isolamento de ad MV F foi de 120 min. No total, o processo levo...
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Discussão
Neste estudo apresentamos um protocolo bem estabelecido para o isolamento de ad-MVF. Obtenção ad-MVF do tecido adiposo murino é um procedimento simples com alguns passos críticos. Os ratinhos exibem diferentes subcutânea e depósitos de gordura intra-abdominais. Como anteriormente descrito para os ratos, a fonte de gordura mais adequado para o isolamento de ad-MV F são as almofadas de gordura epididimal devido ao seu tamanho, estrutura homogénea e contaminação mínima com os vasos sanguíneos maiores
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Somos gratos pela excelente assistência técnica de Janine Becker, Caroline Bickelmann e Ruth Nickels. Este estudo foi financiado por uma concessão do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - Fundação Alemã de Pesquisa) - LA 2682 / 7-1.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| tubo de microcentrífuga cónico de 1,5 ml | VWR, Kelsterbach, Alemanha | 700-5239 | |
| 100-µ Pipeta de precisão L | Eppendorf, Hamburgo, Alemanha | 4920000059 | |
| Pipeta medidora de 10 mL | Costar, Corning Inc., Nova York, EUA | 4488 | |
| Tubos PP de 14 mL | Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemanha | 187261 | |
| Pipeta de precisão de 1 mL | Eppendorf, Hamburgo, Alemanha | 4920000083 | |
| 500-µ m filtro (pluriStrainer 500 µ m) | HISS Diagnostics, Freiburg, Alemanha | 43-50500-03 | |
| Tubo de centrífuga cônico de 50 mL | Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemanha | 227261 | |
| frasco Erlenmeyer de 50 mL | VWR, Kelsterbach, Alemanha | 214-0211 | |
| Placa de 96 poços | Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemanha | 65518 | |
| solução de descolamento de células (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA EUA | 00-4555-56 | |
| Camundongos C57BL/6 | Charles River, Colônia, Alemanha | 027 | |
| Camundongos C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, EUA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha | 553354 | |
| Colagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemanha | 17465.02 | Lote testado pelo fabricante quanto à atividade enzimática |
| Tesoura de dissecção | Braun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, Alemanha | BC 601 | |
| Corante de ligação ao DNA (Bisbenzimida H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha | B2261 | |
| Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Alemanha | P04-03600 | |
| Soro fetal de bezerro (FCS) | Biochrom GmbH, Berlim, Alemanha | S0615 | |
| Pinça fina | S& T AG, Neuhausen, Suíça | FRS-15 RM-8 | |
| Tesoura fina | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, EUA | 503261 | |
| Substituto dérmico da pele (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, França | 62021 | |
| Cetamina | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Alemanha | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA EUA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (solução desinfetante) | Schü lke & Mayer, Norderstedt, Alemanha | 118211 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Biochrom, Berlim, Alemanha | A2213 | |
| Placa de Petri | Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemanha | 664160 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Lonza Group, Basel, Suíça | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µ m (20 µ filtro m) | HISS Diagnostics, Freiburg, Alemanha | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha | 553930 | |
| Tesoura de preparação pequena | S& T AG, Neuhausen, Suíça | SDC-15 R-8S | |
| Pinça cirúrgica | Braun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, Alemanha | Fita BD510R | |
| (Heftpflaster Seide) 1,25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Alemanha | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemanha | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA EUA | 53-9760-82 | A marcação intracelular requer adicionalmente Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha; #554722) |
Referências
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Reimpressões e permissões
