Este trabalho descreve um protocolo que utiliza uma abordagem resolvida por componentes para estudar a sensibilização para alérgenos do pólen em uma coorte de pacientes do sul da China com rinite alérgica e / ou asma.
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Artigo de método
Uma abordagem de diagnóstico resolvida por componente para um estudo sobre alergênios de pólen de grama em sulistas chineses com rinite alérgica e / ou asma
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A sensibilização para o pólen de pastagem impõe um risco global de doenças alérgicas nas vias aéreas. Embora a prevenção baseie-se na investigação local dos alergenos do pólen, os dados sobre este tema são limitados no sul da China. Todos os dados disponíveis foram obtidos por questionários de auto-relato, testes cutâneos e testes de IgE totais ou específicos, utilizando extratos brutos. Por muitos motivos, esses métodos não são confiáveis. A reatividade sérica do soro para gramíneas de Bermuda, Timothy Grass e Humulus scandens em uma coorte de pacientes da Grande Cantão (maior cidade do sul da China e seus arredores) com rinite alérgica e / ou asma foram examinadas usando um analisador de imunoensaio totalmente automatizado como componente Ferramenta de diagnóstico resolvido (CRD).
Pela primeira vez, foi demonstrada uma prevalência consideravelmente alta de positividade da grama de Bermuda em sulistas chineses com rinite alérgica e / ou asma. Nestes pacientes, uma subtil prevalência de sensibilizaçãoPara Timothy grass e Humulus scandens também foi observado , que pode resultar da reatividade cruzada, já que os dois últimos não são comuns na região. Isso também foi apoiado pela detecção de componentes alérgenos.
Os analisadores de imunoensaio totalmente automatizados podem oferecer consistência satisfatória entre regiões, laboratórios e instituições e ao longo do tempo. A automatização do instrumento pode permitir uma detecção padronizada que não teria sido prontamente revelada antes do advento do CRD.
Este é um estudo que usa uma abordagem CRD para investigar a sensibilização para alergenos de pólen de capim no sul da China. Isso acrescenta à evidência atual na literatura. Estudos futuros são necessários para validar esses achados. No entanto, embora o CRD seja uma ferramenta útil, os resultados obtidos com o analisador de imunoensaio totalmente automatizado não devem substituir outras investigações laboratoriais, avaliações clínicas e conhecimentos médicos.
Introdução
O pólen de gramado representa cerca de 50% das alergias relacionadas com a imunoglobulina E (IgE) e, devido à sua natureza no ar, impõe um risco global de doenças das vias aéreas alérgicas, particularmente asma e rinite alérgica 1 , 2 , 3 , 4 . A prevenção contra alergias ao pólipo em uma região depende da informação sobre a distribuição local dos alérgenos do pólen. Infelizmente, o espectro dos alérgenos sensibilizantes varia de um lugar para outro - uma observação geralmente conhecida como especificidade regional.
Na China, um vasto território asiático-oriental, a especificidade regional da sensibilização ao pólen é ainda mais complicada por dados limitados atualmente disponíveis na parte sul deste país nas últimas décadas 5 . Tal escassez de dados levou a uma dificuldade em mostrar o significado geral do pólen da gramaTização neste grande país 6 . Além disso, os dados muito limitados sobre os sulistas chineses foram obtidos em grande parte a partir de questionários de auto-relato, testes cutâneos (em vez de testes de soro de laboratório), medições de IgE total (em vez de IgE específicas de alérgenos (sIgE)) e detecção de SIG para alérgenos ( Em vez de moléculas de componentes alergénicos).
O auto-relato de sintomas alérgicos pode ser pouco confiável quando se trata de alérgenos específicos. Os testes cutâneos, embora amplamente acessíveis, envolvem o uso de extratos de alérgenos brutos não padronizados, que podem conter outros componentes sensibilizantes que confundem a interpretação dos resultados. A confiabilidade do teste cutâneo também depende criticamente de manipulação habilidosa por alergistas ou enfermeiras especializadas, uso recente de histamina e complacência do paciente (às vezes muito difícil para crianças pequenas). A IgE total é útil para rastrear uma alergia, mas não determina sensivelmenteE alergenos ofensivos em um paciente. Além disso, quase todos os alérgenos contêm uma série de moléculas de componentes de alérgenos. A sensibilização para os principais componentes ( isto é, Der p 1 e Der p 2 dos ácaros da poeira doméstica) pode sugerir uma alergia "genuína" (alergia a um alérgeno específico, em vez de falsa positividade devido a reações cruzadas com outros alérgenos), mas a sensibilização Para certos ( isto é, o Der-10 de reacção cruzada, uma tropomiosina) pode não 7 .
Antes da introdução de diagnósticos resolvidos por componentes (CRD), esses contratempos decepcionantes impediram os estudos de alergenos na China. O CRD detecta precisamente os componentes de um alergénio usando moléculas de alérgenos recombinantes ou purificadas, tornando assim a medida facilmente quantificável e caracterizável 8 . Nas últimas décadas, estudos de alergia freqüentemente empregavam extratos brutos de alérgenos que inevitavelmente contêm uma série de componentes irrelevantes. Muitos desses coOs fabricantes são inertes, mas ocasionalmente, alguns podem levar a confundir reações positivas. O uso de moléculas de alergênio recombinantes ou purificadas em CRD pode contornar isso e, portanto, proporcionar uma melhor precisão do teste. Quando processado em microarrays, uma abordagem CRD rapidamente monitora ou identifica sensibilização para centenas de moléculas de alérgenos em indivíduos individuais. Atualmente, um estudo CRD bem desenhado sobre a sensibilização ao pólen do gramado no sul da China está faltando. Idealmente, esse estudo deve incluir uma população local de cobertura geográfica considerável, responsável pelos pólenes de gramado comumente relatados na China e abordar os aspectos técnicos mencionados acima. Para atingir um nível prático de relevância clínica e para facilitar o recrutamento de amostras de soro, a investigação precoce sobre a sensibilização aos pólenes de capim como alérgenos inaladores também pode ser focada em pacientes com distúrbios respiratórios alérgicos e não na população em geral.
Este trabalho descreve um métodoUsado para testar a reatividade sérica do soro para Bermuda, Timothy Grass e Humulus scandens em pacientes da Grande Cantão (maior cidade do sul da China e seus arredores) com rinite alérgica e / ou asma usando a abordagem CRD 5 . Essas descobertas sobre a sensibilização a esses pólenes de capim subtropical e temperado no sul da China adicionam evidências importantes para o que atualmente está na literatura.
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Protocolo
O protocolo do estudo, incluindo o uso da amostra de soro humano, foi aprovado pelo Comitê de Ética, Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangzhou. Todos os participantes ofereceram consentimento informado por escrito, independentemente ou através dos pais (no caso de crianças). O protocolo foi registrado on-line (Chinese Clinical Trial Registry, Reg No .: ChiCTR-DCC-13004003, consulte http://www.chictr.org/cn/).
1. Identificação da população estudada
NOTA: O Repositório de Informações de Alergia do Laboratório Chave de Doença Respiratória (AIR-SKLRD) é a principal fonte de recrutamento de pacientes, pois o AIR é o banco de dados grande bem documentado de pacientes para testes de alérgenos no sul da China 9 , 10 . O AIR tem armazenado amostras de soro de pacientes há quase uma década. Resumidamente, essas amostras armazenadas foram previamente preparadas por centrifugação de 5 mL deF sangue venoso flebotomizado durante 10 min a 3.000 xg e recuperando o sobrenadante. As amostras de soro foram colocadas em refrigeradores de -80 ° C para armazenamento a longo prazo. As amostras que atendiam aos critérios de inclusão do paciente estavam prontas para uso para todos os testes no presente estudo.
- A partir do banco de dados AIR, recuperar dados sobre pacientes com rinite alérgica e / ou asma que foram submetidos a exames de soro para alergênio de capim entre janeiro de 2013 e junho de 2015, o período de estudo pré-concebido.
- Selecione pacientes com rinite alérgica leve a moderada e / ou asma de acordo com a Rinite Alérgica e Seu Impacto sobre a Asma (ARIA) 11 e a Iniciativa Global para Asma (GINA) 12 diretrizes. Atribua-os como o "grupo de estudo".
- Excluir pacientes com registros médicos incompletos, aqueles perdidos para acompanhamento, aqueles que se recusam a dar consentimento informado sobre o uso de suas amostras de soro para fins científicos, aqueles com identificados iA deficiência muscular, as que atualmente estão em imunoterapia ou agentes imunomoduladores, ou as que têm infecções parasitárias.
- Selecione uma coorte contemporânea de pacientes com alergias não respiratórias (por exemplo, eczema, dermatite alérgica e alergia alimentar) de acordo com os mesmos critérios de exclusão e atribua-os como o "grupo controle".
- Certifique-se de que as amostras de soro foram coletadas antes de qualquer receita ou tratamento foram administrados para minimizar os efeitos de confusão nos achados laboratoriais. Exclua qualquer amostra de soro que não cumpra este requisito.
- Certifique-se de que todos os assuntos são residentes permanentes de todas as partes da Grande Cantão ( ou seja, nascido ou vivido lá por mais de 10 anos).
2. Fluxo de estudo e medições de interesse
- Recupere as amostras de soro de pacientes elegíveis do bio-banco. Para testar um componente alérgeno / alérgeno, use 140 μL de soro (incluindo 100 μL para preencherAté o espaço morto).
NOTA: O volume sérico total máximo necessário para cada paciente neste estudo é: 3 alérgenos específicos e 8 componentes de alergênio, sIgE = 140 μL * 11 = 1.540 μL. - Ao usar este instrumento, teste principalmente as amostras de soro para sIgEs para alérgenos inteiros de Bermuda, Timothy Grass e Humulus scandens . Siga as instruções na Seção 3.
NOTA: Esses pólens foram selecionados para as medidas porque Bermuda grass 13 , 14 , 15 e Humulus scandens 16 foram amplamente relatados na China, enquanto Timothy grass 17 , 18 , 19 é uma espécie típica de plantas que vive em ambientes variando de tropical a temperado Zonas e é mais estudado em todo o mundo. - Em segundo lugar, teste as amostras de soro identificadas no passo 2.3 para terSIgEs para alérgenos inteiros para a presença de sIgEs para componentes alergenos de Bermuda [Cyn d 1 (g216)], Timothy [Phlp 1 (g205), Phl p 4 (g208), Phl p 5 (g215), Phl p 6 (g209 ), Phl p 7 (g210), Phl p 11 (g211) e Phl p 12 (g212)] e determinantes de carboidratos reativos cruzados [CCD (o214)]. Siga as instruções na Seção 3.
3. Procedimento de teste totalmente automatizado usando o sistema de análise de imunoensaio
NOTA: Todo o procedimento do teste de alergia, que é totalmente automatizado e descrito em outro lugar 7 , 8 , 9 , 10 , segue o protocolo do fabricante.
- Inicie o analisador de imunoensaio totalmente automatizado ( por exemplo, ImmunoCAP1000) e use-o para realizar o imunoensaio ao longo do estudo. Ative o computador incorporado no Gerenciamento de Dados de Informação (IDM).
NOTA: o imunoensaio analYzer é rotineiramente no modo de espera. - Com o "Alimentação Primária" ligado, ligue o "Sistema de Energia" e aguarde 3 min até o software incorporado começar. Clique em "Load Rinse Solution" e "Load Washing Solution".
- Adicione 140 μL de soro a um frasco para cada teste de componente alérgeno / alérgeno. Rotule cada frasco para injectáveis contendo 140 μL de soro com um número de identificação exclusivo para cada paciente.
- A partir da interface IDM, execute as seguintes etapas clicando no menu.
- Verifique a janela "Lista de solicitação" no IDM para garantir que "sIgE" seja o método de teste escolhido.
- Coloque os tubos de amostra nos racks de amostra e nos tubos de controle de qualidade nas barras de controle de qualidade, com códigos de barras.
NOTA: Para cada paciente, o teste foi inicialmente planejado para sIgE para 3 alérgenos específicos e 8 componentes de alergênio, ou 346 * 11 (3.806) tubos de amostra. Para cada tubo de amostra, 3 tubos de controle de qualidadeQue contêm níveis baixos, médios e altos de controle sIgE (veja a Tabela de Materiais para detalhes) foram combinados. Eventualmente, apenas 58 pacientes que apresentaram resultado positivo no teste primário (etapa 2.3) foram examinados posteriormente no teste secundário (passo 2.3). O carregamento de tubos pode ser configurado automaticamente no console do computador. - Selecione "Carregar Reagentes" na tela "Processamento de Ensaio". Complete o carregamento da amostra e racks de controle de qualidade, solução de desenvolvimento, conjugado, calibradores, transportador, pontas de pipeta, solução de parada e solução de lavagem de acordo com a "Loadlist" (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes).
- Em "Carregar e Iniciar", pressione "OK".
NOTA: No final da medição, os resultados aparecem no IDM. - Na interface IDM, selecione os dados a serem exportados. Clique em "Menu", "Aprovar" e "Salvar como" e exportar os resultados de medição sIgE como um arquivo de planilha.
- Importe o arquivo da planilha eletrônica para um software estatístico ( por exemplo, SPSS) 10 . Usando um módulo específico para os coeficientes de Spearman no menu SPSS, analise as correlações na sensibilização entre estes pollens de grama (sIgE positivo para alérgenos inteiros) e componentes de pólen (sIgE positivo para moléculas de alérgenos).
4. Definição de Reatividade SIGgE
NOTA: Para um espécime de soro não diluído, o intervalo de medição de IgE específica é de 0,35 a 100 kU / L.
- Diluir as amostras com valores sIgE> 100 kU / L 1: 5 e re-ensaiar. Quando o valor permanece superior a 100 kU / L, avance com diluições adicionais até atingir um nível de ponto final até 1.000 kU / L.
- Com base no valor limiar de 0,35 kU / L, considere um nível sIgE superior a 0,35 kU / L para ser positivo 5 , 7 , 10 . Avalie o reactivDos testes sIgE como: classe 1 (≥0,35 e <0,70 kU / L), classe 2 (≥0,70 e <3,50 kU / L), classe 3 (≥ 3,50 e <17,50 kU / L), classe 4 (≥ 17,50 e <50,00 kU / L), classe 5 (≥50,00 e <100,00 kU / L) e classe 6 (≥100,00 kU / L).
5. Análise estatística
- Analise os dados com software estatístico ( por exemplo, SPSS) 10 . Relata os dados quantitativos como o desvio padrão e médio, os dados qualitativos como os intervalos mediano e intercuartil e os dados categóricos como proporção de resultados positivos.
- Use um teste de qui-quadrado para a comparação entre grupos de proporções, uma prova de T não compensada para dados quantitativos e um teste de soma de classificação para dados qualitativos.
- Use o teste de Pearson para análises de correlação entre dados paramétricos, com os coeficientes de correlação expressos como "r" e o teste de Spearman para valores não paramétricos, com tOs coeficientes de correlação expressos como " r s ". Considere a significância estatística a ser quando P-valor <0,05.
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Resultados
O analisador de imunoensaio totalmente automatizado usado neste estudo possui uma estrutura em fase sólida coberta com alérgenos de alvéolos ou componentes alérgenos covalentemente que reagem com as moléculas de interesse (sIgE) em espécimes de soro do paciente. Com um programa automático, o analisador lava todas as IgE não específicas com 150 μL de solução de enxaguamento e repete isso 5 vezes. Em seguida, adiciona anticorpos anti-IgE marcados com enzimas (50 μL) para gerar um complexo....
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Discussão
Os analisadores de imunoensaio totalmente automatizados podem oferecer consistência satisfatória entre regiões, laboratórios e instituições e ao longo do tempo. Verificou-se que um procedimento tão automático sustenta substancialmente pesquisas de banco e estudos clínicos, permite a detecção padronizada de muitos alérgenos e / ou componentes de alérgenos e identifica a provável reatividade cruzada de alérgenos que não teria sido prontamente revelada antes do advento dos CRDs. Além disso, todo o procedimento de teste pod...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos Yueming Su por sua ajuda na preparação da figura. Este estudo foi financiado pela Fundação Guangdong de Ciência e Tecnologia (Projeto No .: 2014A020212352), o Escritório de Educação de Guangzhou (1201630044; 1201630393) e a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC 81572063; NSFC 81601394).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Instrumento ImmunoCAP 1000 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 12-3800-01 | |
| Pacote de software Phadia Information Data Manager | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 12-3801-11 | |
| Pacote de software, ImmunoCAP 1000 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 12-3801-12 | |
| g2 ( Grama Bermuda) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 14-4131-01 | |
| g6 (Grama Timothy) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 14-4100-01 | |
| w22 (Japanese Hop) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 14-4452-01 | |
| g216 (nCyn d 1) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 14-4972-01 | |
| g205 (rPhl p 1) | Thermo Fisher Scientific, Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 14-5234-01 | |
| g208 (nPhl p 4) | Thermo Fisher Scientific, Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 14-5288-01 | |
| g215 (rPhl p 5b) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 14-5338-01 | |
| g209 (rPhl p 6) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 14-5289-01 | |
| g210 (rPhl p 7) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 14-5290-01 | |
| g211 (rPhl p 11) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 14-5291-01 | |
| g212 (rPhl p 12) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 14-5292-01 | |
| o214 Determinantes de carboidratos de reação cruzada (CCDs) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 14-5339-01 | |
| Conjugado de IgE Específica 400 | Thermo Fisher Scientific, Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 10-9310-08 | |
| Tira de Calibrador de IgE Específica | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 10-9459-08 | |
| Tira de controle de curva de IgE específica | Thermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 10-9312-08 | |
| IgE específica Anti-IgE ImmunoCAP | Thermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 14-4417-01 | |
| ImmunoCAP Controle Negativo de IgE | Específica Thermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 10-9445-01 | |
| Controle de IgE Específica ImmunoCAP L | Thermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 10-9528-01 | |
| Controle de IgE Específica ImmunoCAP M | Thermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 10-9529-01 | |
| Controle de IgE Específica ImmunoCAP H | Thermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 10-9530-01 | |
| Solução | de DesenvolvimentoThermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 10-9439-08 | |
| Solução de parada | Thermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 34-2271-58 | |
| Solução de lavagem | Thermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 10-9202-08 | |
| FluoroC | Thermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 10-9264-01 | |
| Kit de solução de manutenção | Thermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala, Suécia) | 10-9476-01 |
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Reimpressões e permissões
