Aqui, descrevemos a preparação de fatias ventriculares viáveis de camundongos adultos e seu uso para gravações de potencial de ação de eletrodos afiados. Essas preparações multicelulares proporcionam uma estrutura de tecido in vivo preservada, o que os torna um modelo valioso para estudos eletrofisiológicos e farmacológicos in vitro .
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Artigo de método
Faixas de coração ventricular de eixo curto murino para estudos eletrofisiológicos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os cardiomiócitos murinos têm sido amplamente utilizados para estudos in vitro de fisiologia cardíaca e novas estratégias terapêuticas. No entanto, as preparações multicelulares de cardiomiócitos dissociados não são representativas da estrutura complexa in vivo de cardiomiócitos, não miocitos e matriz extracelular, que influencia as propriedades mecânicas e eletrofisiológicas do coração. Aqui descrevemos uma técnica para preparar fatias ventriculares viáveis de corações de mouse adultos com uma estrutura de tecido preservada in vivo e demonstrar sua adequação para gravações eletrofisiológicas. Após a excisão do coração, os ventrículos são separados dos átrios, perfundidos com solução livre de Ca2 + contendo monoxime de 2,3-butanodiona e incorporados em um bloqueio de agarose com baixo teor de fusão a 4%. O bloco é colocado em um microtomo com uma lâmina vibratória, e fatias de tecido com uma espessura de 150-400 μm são preparadas mantendo a vibração freDa lâmina a 60-70 Hz e movendo a lâmina para a frente o mais lentamente possível. A espessura das fatias depende da aplicação adicional. As fatias são armazenadas na solução de Tyrode gelada com Ca2 + 0,9 mM e monoxime de 2,3-butanodiona (BDM) durante 30 min. Depois, as fatias são transferidas para DMEM a 37 ° C durante 30 min para lavar o BDM. As fatias podem ser usadas para estudos eletrofisiológicos com eletrodos afiados ou arrays de microeletrodos, para medidas de força para analisar a função contrátil ou para investigar a interação de cardiomiócitos derivados de células estaminais transplantadas e tecido hospedeiro. Para gravações de eletrodos afiados, uma fatia é colocada em um prato de cultura de células de 3 cm na placa de aquecimento de um microscópio invertido. A fatia é estimulada com um eletrodo unipolar, e os potenciais de ação intracelular de cardiomiócitos dentro da fatia são registrados com um eletrodo de vidro afiado.
Introdução
As fatias de tecido fino têm sido utilizadas com freqüência na ciência básica, uma vez que Yamamot e Mcllwain mostraram em 1966 que a atividade elétrica de fatias de cérebro é mantida in vitro 1 . Desde então, estudos eletrofisiológicos e farmacológicos foram realizados em fatias do cérebro 2 , fígado 3 , pulmão 4 e tecido miocárdico 5 , 6 , 7 . As primeiras gravações de patch-clamp em fatias ventriculares de corações de ratos neonatais foram descritas em 1990 8 , mas essa técnica caiu no esquecimento por algum tempo. Mais de uma década depois, nosso grupo estabeleceu um novo método para preparar as fatias de coração de embrião murino 9 , neonatal 10 e adulto 11 . Estas fatias de tecido viáveis podem ser usadas para experiências agudas (fatias adultasS podem ser cultivadas por várias horas) ou experiências culturais de curto prazo (fatias embrionárias e neonatais podem ser cultivadas por alguns dias). As fatias mostram in vivo como características eletrofisiológicas e uma dispersão de excitação homogênea conforme avaliado pelo potencial de ação de eletrodo afiado e gravações de microeletrodos 11 . Devido à sua morfologia "bidimensional", eles permitem o acesso direto dos eletrodos de gravação a todas as regiões do ventrículo, o que os torna uma ferramenta interessante para investigações eletrofisiológicas e levanta novas opções experimentais em comparação com os corações inteiros de perfumes de Langendorff. A resposta ao fármaco das fatias aos bloqueadores dos canais iônicos, como o verapamil (bloqueador de canal Ca 2+ ), lidocain (bloqueador de canais de Na + ), 4-aminopiridina (bloqueador de canal K + não -seletivo dependente da tensão) e linopirdina (KCNQ K + -Bloqueador de canal) 9 , 11 correspondeu a efeitos conhecidos em cardiomiócitos dissociados. As medidas da força isométrica revelaram uma relação de freqüência de força positiva e sugeriram fortemente a função contrátil intacta 10 . Esses achados demonstraram que as fatias ventriculares murinas são adequadas como um modelo de tecido in vitro para estudos fisiológicos e farmacológicos. Além disso, as fatias ventriculares de corações receptores em combinação com gravações afiadas de eletrodos provaram ser uma ferramenta muito útil para caracterizar a integração elétrica e mecânica, bem como a maturação dos 12 cardiomiócitos transplantados 12 , 13 , 14 e derivados de células-tronco.
Em resumo, as fatias ventriculares são um modelo de tecido multicelular valioso e bem estabelecido e devem ser consideradas complementares a cardiomiócitos dissociados e corações perfundidos por LangendorffNa pesquisa cardiovascular, com a principal vantagem de fornecer uma estrutura de tecido in vivo (em contraste com células dissociadas), bem como acesso direto de tecnologias de medição, como gravações de eletrodos afiados para todas as regiões do coração (em contraste com preparações de coração inteiro).
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Protocolo
O manuseio de animais deve ser conforme às diretrizes do comitê local de bem-estar animal e à Diretiva 2010/63 / UE do Parlamento Europeu.
1. Prepare Soluções
- Preparar a solução de Tyrode sem Ca 2+ (composição em mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH2PO4 0,33, MgCl2 1, glucose 10, HEPES 5, 2,3-butanodiona monoxime (BDM) 30. Ajustar o pH para 7,4 Com NaOH a 4 ° C.
- Preparar a solução de Tyrode com Ca 2+ (composição em mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH2PO4 0,33, MgCl2 1, glucose 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0,9. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH a 4 ° C.
- Prepare 4% de agarose com baixo teor de fusão: Coloque 0.6 g de agarose com baixo teor de fusão em 15 mL de solução de Tyrode sem Ca 2+ . Aqueça a mistura em um forno de microondas duas vezes a 750 W por 10-15 s até que a agarose seja dissolvida. Mantenha a solução a uma temperatura constante de 37 &# 176; C e mexa continuamente.
- Mantenha o Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) sem soro a 37 ° C com borbulhante com 5% de CO 2 , 95% de O2).
2. Prepare o Microtome
- Ligue o microtome.
- Encha a câmara externa do microtomo com gelo.
- Preencha a câmara interna do microtomo com solução de Tyrode gelada sem Ca 2+ e oxigene continuamente a solução com 100% de O2.
- Coloque uma lâmina de aço no suporte da lâmina do microtomo.
3. Isolamento do coração do mouse
- Injete 2,500 U de heparina por via subcutânea. Aguarde 15 min.
- Sacrifique o animal pela luxação cervical.
- Abra o tórax por esternotomia.
- Dispare cuidadosamente o pericárdio usando pequenas tesouras e uma pinça # 5.
- Inserir uma cânula na aorta ascendente e perfundir as artérias coronárias in situ com o gelo TyrodeSolução sem Ca 2 + até o sangue restante ser removido.
- Respete suavemente o coração com uma pinça e uma tesoura e transfira o coração na solução gelada de Tyrode montada sem Ca 2+ .
- Separe os átrios dos ventrículos com um bisturi ou uma tesoura.
4. Incorporação dos Ventrículos em 4% de Agarose com baixo ponto de fusão
- Coloque os ventrículos com o ápice voltado para cima no molde de agarose ( Figura 1 ). Coloque o pino no meio do molde na câmara ventricular esquerda.
- Encha o molde com 4% de agarose de baixo teor de fusão a 37 ° C, até que o coração esteja completamente coberto.
- Coloque o molde no gelo para um endurecimento mais rápido da agarose, evitando a flutuação do tecido.
- Remova o bloco de agarose contendo os ventrículos do molde com um bisturi.
- Gire o bloco de cabeça para baixo e cubra as câmaras ventriculares e o espaço na parte traseira do bloco de agarose, que euS deixado pelo pino da muda, com 4% de agarose de baixo teor de fusão usando uma seringa com uma agulha de 20 G.
- Corte o bloco de agarose com um bisturi para conseguir um fundo plano do bloco e posição vertical do ápice cardíaco.
5. Cortando o tecido ventricular
- Corrija o bloco no suporte de amostra do microtome com uma gota de cola de cianoacrilato. Enfrente o ápice cardíaco para cima.
- Coloque o suporte de amostra na câmara de amostra interna do microtomo, que é preenchido com Tyrode gelado sem Ca 2+ . Cubra completamente o bloco de agarose com a solução de Tyrode.
- Prepare fatias de eixos curtos com uma espessura de 150-400 μm, dependendo da aplicação adicional (para gravações de eletrodos afiados de 150-200 μm), mantenha a freqüência de vibração da lâmina a 60-70 Hz e mova a lâmina para frente o mais rápido possível .
- Use uma escova fina para remover cuidadosamente a agarose restante das fatias.
- Gentilmente transfeR fatiga com uma pipeta Pasteur na solução de Tyrode com Ca2 + 0,9 mM arejado com 100% de O2 e armazená-los durante pelo menos 30 minutos em gelo para recuperar do processo de corte.
- Depois, mantenha as fatias durante 30 min em DMEM a 37 ° C, arejado com carbógeno, para lavar o BDM antes de continuar a usar.
6. Preparando a Configuração do Eletrodo Sharp
- Para pré-aquecimento, ligue todos os dispositivos elétricos 30 min antes do início das gravações.
- Coloque um prato de cultura de células de 3 cm na placa de aquecimento colocada no microscópio invertido.
- Coloque o eletrodo de anel personalizado ( Figura 2 ) no prato e conecte os fios de aterramento do pré-amplificador e o eletrodo de estimulação.
- Ligue os tubos flexíveis do sistema de perfusão ao prato.
- Encha o reservatório do sistema de perfusão com DMEM, arejado com carbógeno.
- Ligar a bomba de perfusão e ajustar a perfusãoA 2-3 mL / min.
- Ajuste a temperatura do DMEM no prato a 37 ° C, regulando o aquecedor de fluxo e a placa de aquecimento.
7. Gravações de Ação Potencial
- Coloque uma fatia ventricular no prato cheio de DMEM.
- Verifique a integridade estrutural e a viabilidade (com base na função contrátil) do tecido com o microscópio invertido.
- Preencha um eletrodo de vidro de gravação com KCL de 3 M.
- Preencha um eletrodo de estimulação com DMEM.
- Coloque o eletrodo de gravação e o eletrodo de estimulação nos suportes dos eléctrodos.
- Coloque o eletrodo de estimulação cuidadosamente na fatia e ligue o estimulador elétrico. Comece com uma frequência de estimulação de 1-2 Hz.
- Mova o eletrodo de gravação com o micromanipulador sobre a posição de gravação pretendida.
- Abaixe lentamente o eletrodo de gravação até a ponta tocar o tecido.
- Aplique um curto impulso elétrico retangular através doGravação de eletrodo para penetrar a membrana celular.
- Desconexe cuidadosamente o eletrodo de gravação até garantir um sinal estável.
- Comece a gravar os potenciais de ação.
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Resultados
O infarto do miocárdio leva a uma perda praticamente irreversível de cardiomiócitos. A terapia de reposição celular com cardiomiócitos derivados de células estaminais para regeneração cardíaca exógena é uma abordagem terapêutica promissora. A integração e a maturação elétrica das células transplantadas são cruciais para a segurança e eficiência da terapia de reposição celular.
Para avaliar a integração e maturação, transplanta...
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Discussão
As fatias ventriculares permitem estudos eletrofisiológicos, farmacológicos e mecânicos com uma estrutura de tecido preservada in vivo e acesso direto da tecnologia de medição a todas as regiões do coração. As propriedades potenciais de ação fisiológica foram demonstradas em fatias embrionárias, neonatais e adultas 9 , 10 , 11 . A vitalidade das fatias, com exceção das camadas superficiais diretamente danifica...
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Divulgações
Os autores não têm nada a declarar.
Agradecimentos
Reconhecemos o apoio prestado pelas oficinas e a instalação animal do Instituto de Neurofisiologia. Este trabalho foi apoiado por Walter und Marga Boll-Stiftung, Köln Fortune e Deutsche Stiftung für Herzforschung.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha | Micrótomo com lâmina vibratória. | |
| Lâminas de Aço Inoxidável | Campden Instruments, Loughborough, Inglaterra | 7550-1-SS | |
| Pipetas Pasteur | Sigma-Aldrich, St. Louise, EUA | Z627992 | |
| Pincel fino, e.g. tamanho 6 (4/32") | VWR, Internacional, Radnor, EUA | 149-2125 | |
| Mesa | feita por mim mesmo | ||
| para embutir ventrículos em seringa | feita por conta própria | ||
| Becton, Dickinson; Franklin Lakes, EUA | 300013 | ||
| 27 G x 3/4'' Agulhas | Braun, Melsungen, Alemanha | 4657705 | |
| 20 G 11/2'' Agulhas | 4657519 | ||
| Tesoura pequena | WPI, Sarasota, EUA | 501263 | |
| Pinças #5, ponta de 0,1 x 0,06 mm | WPI, Sarasota, EUA | 500342 | |
| Gás oxigênio (grau médico O2) | Linde, Munique, Alemanha | ||
| Gás carbógeno (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munique, Alemanha | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, EUA | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, EUA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, EUA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, EUA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, EUA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, EUA | S5761 | |
| D(+)-glicose | Sigma-Aldrich, St. Louise, EUA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cola de cianoacrilato | Henkel, Dü sseldorf, Alemanha | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Alemanha | 6351.2 | |
| Heparina-sódio-25000 I.E./5 mL | Ratiopharm, Ulm, Alemanha | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), glicose alta, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, EUA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplificador | npi electronic GmbH, Tamm, Alemanha | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Alemanha | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Alemanha | ||
| Micromanipulador de baixa ampliação | Narashige, Tóquio, Japão | Nm-3 | |
| Micromanipulador de três eixos de alta ampliação | Narashige, Tóquio, Japão | MHW-3 | |
| Bomba | de perfusão peristálticaSistemas Multicanal, Reutlingen, Alemanha | PPS2 | |
| de 2 canais | Sistemas Multicanal, Reutlingen, Alemanha | TCO02 | |
| Estimulador de pulso quadrado | Natus Europe GmbH, Planegg, Alemanha | Grama SD9 | |
| Capilares de vidro | WPI, Sarasota, EUA | 1B150F-1 |
Referências
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Reimpressões e permissões
