Preparação de Vesículas de Membranas Plasmáticas de Células-Tronco Mesenquimais de Medula Óssea para Terapia Potencial de Substituição de Citoplasma

Resumo

As doenças relacionadas à idade estão associadas a múltiplos defeitos nos componentes do citoplasma. Aqui, apresentamos um protocolo para preparar vesículas de membranas plasmáticas de células estaminais mesenquimais de medula óssea. Esta técnica poderia potencialmente ser utilizada como um meio de terapia de substituição do citoplasma para melhorar ou mesmo reverter fenotipos associados à idade.

Resumo

Nós já relatamos sobre a geração de vesículas de membrana plasmática (PMVs) através da extrusão mecânica de células de mamíferos. A fusão de PMVs com células RhoO deficientes mitocondriais restaurou a actividade mitótica em condições de cultura normais. A aterosclerose, diabetes tipo 2, doença de Alzheimer e cancro são doenças relacionadas com a idade que foram relatadas como estando associadas a múltiplos defeitos mecânicos e funcionais no citosol e organelas de uma variedade de tipos de células. As células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSCs) representam uma população única de células da medula óssea que possuem capacidades de auto-renovação, mantendo a sua multipotência. A suplementação de células de senescência com citoplasma jovem a partir de BMSCs autólogas através da fusão de PMVs proporciona uma abordagem promissora para melhorar ou mesmo reverter fenotipos associados à idade. Este protocolo descreve como preparar PMVs de BMSCs através de extrusão através de uma membrana de policarbonato com 3Determinam a existência de mitocôndrias e examinam a manutenção do potencial de membrana dentro de PMVs usando um microscópio confocal, concentram PMVs por centrifugação e realizam a injeção in vivo de PMVs no músculo gastrocnêmio de camundongos.

Introdução

Uma enorme quantidade de esforço tem sido dedicada ao estabelecimento de abordagens para genes, enzimas e terapias de reposição celular. Isto resultou em grandes avanços e mesmo aplicações clínicas ^{1 , 2 , 3} . Recentemente, uma polêmica mitocôndria substituição terapia baseada em tecnologia de transferência de núcleo foi aplicado à fertilização in vitro para mulheres de idade avançada ou portador de uma mitocondrial letal DNA mutação [ ^4] . Defeitos encontrados em doenças relacionadas à idade, incluindo aterosclerose, diabetes tipo 2, doença de Alzheimer e câncer, são geralmente multifacetados. Tem sido documentado que a acumulação de gotículas lipídicas; A deposição de proteína amilóide; A retenção de proteínas desdobradas no retículo endoplasmático; E proteassoma defeituoso, autofagosoma e mitocôndrias contribuem para o desenvolvimento ou agravamento destas doenças"Xref"> 5 ^{, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} . Actualmente, não existe nenhum mecanismo disponível destinado a remediar directamente o mau funcionamento no citosol e organelas, o que provoca a senescência e os fenótipos de envelhecimento.

Nós já relatamos sobre a geração de vesículas de membrana plasmática (PMVs) através da extrusão mecânica de células de mamíferos ¹² . Com exceção do núcleo, componentes em membrana ou citosol, incluindo proteínas e RNA, bem como as organelas, como mitocôndrias, foram encontrados em PMVs. Essencialmente, um PMV pode ser considerado como uma célula enucleada em miniatura. Mais importante ainda, a fusão de PMVs com células RhoO deficientes em mitocôndrias restaurou a actividade mitótica em condições de cultura normais. Este é o primeiro relatório sobreUma abordagem potencialmente eficiente para a terapia de substituição do citoplasma.

As células estaminais mesenquimais da medula óssea (BMSCs) são células progenitoras multipotentes que são rotineiramente geradas a partir da medula óssea e são facilmente expandidas em cultura. Marcadores de células estaminais embrionárias Oct4, Nanog e SOX2 foram detectados em baixos níveis em MSCs ¹³ . A actividade de telomerase também é mensurável. Além disso, a ausência de moléculas co-estimuladoras e moléculas de antígeno leucocitário humano (HLA) de classe II, bem como a baixa expressão de HLA Classe I em MSCs, tornam-se células ideais para uso alogênico ou "off-the-shelf" Tanto a medicina regenerativa quanto as aplicações imunomoduladoras ¹⁴ .

Aqui, descrevemos como preparar PMVs de BMSCs de ratos por extrusão através de uma membrana de policarbonato com poros de 3 μm, determinar a existência de mitocôndrias e examinar a manutenção do potencial de membrana em PMVs usando confocAl microscopia, preparar PMVs concentrados mas não agregados por centrifugação e realizar a injeção in vivo de PMVs no músculo gastrocnêmio de camundongos.

Protocolo

Foram adquiridos ratinhos BALB / c com 8 a 12 semanas de idade de Xangai Experimental Animal Center (Xangai, China) e criados numa instalação animal específica isenta de agentes patogénicos e com ar condicionado. O cuidado animal e os procedimentos experimentais estavam em conformidade com as diretrizes para o uso e cuidado de animais de laboratório estabelecidos pela Universidade de Shantou.

1. Montagem do Aparelho

1. Para garantir a esterilidade, ligue a luz UV de um capuz de cultura de tecidos durante 30 min antes de usar.
2. Desparafuse uma unidade de filtro descartável de 25 mm e mergulhe a tampa eo fundo da unidade em uma xícara de vidro de 200 mL cheia com etanol a 75% por 30 min. A unidade é feita de polipropileno de grau médico.
3. Pegue a tampa ea parte inferior da unidade usando fórceps, sacuda o restante etanol à mão, e deixe as peças ao ar seco por 10 min no capô.
4. Molhar uma membrana de policarbonato de 19 mm em PBS e colocá-lo cuidadosamente em cima da matriz de suporte do bottoM da unidade. A película de polímero tem uma superfície lisa, plana e poros trilhados de 3 μm.
5. Volte a montar a unidade apertando firmemente a tampa contra o fundo. Certifique-se de que a membrana não é deslocada do centro.
6. Remover a agulha de uma seringa de insulina de 1 mL e extrair 1 mL de PBS. Conecte a seringa à unidade de filtro e, em seguida, empurre PBS através da unidade para molhar o conjunto e para testar se houver qualquer vazamento.

2. Geração de Vesículas de Membrana de Plasma (PMVs)

1. Estabelecer uma cultura BMSC, conforme relatado por Nemeth et al. ¹⁵ , em meio de cultura DMEM contendo 15% de FBS e 1% de penicilina / estreptomicina. Cultivar as células numa placa de 6 poços numa incubadora humidificada contendo 5% de CO2 à temperatura de 37 ° C.
2. Para propagar as células, remover o meio de cultura e enxaguar o poço com 0,5 mL de PBS sem cálcio.
3. Adicionar 0,5 mL de tripsina-EDTA a 0,25% e incubar as células a 37 ° CDurante 3 min. Toque a placa contra a palma da mão algumas vezes para facilitar o destacamento celular. Parar a digestão por adição de 1 mL de meio de cultura.
4. Recolher as células em um tubo cônico de 15 mL e girar a 200 xg por 2 min em uma centrífuga de bancada. Ressuspender as células em 4 mL de meio de cultura e alíquota as células em dois poços de uma placa de 6 poços.
   NOTA: As células normalmente atingem a confluência em torno de 24 h.
5. Para gerar PMVs, recolher as células de um poço (cerca de 5 x 105 células) de uma placa de 6 poços por digestão com tripsina e monodispersar as células em 0,5 mL de meio de cultura.
6. Coloque as células na seringa de insulina, prenda-a à unidade de filtro e empurre o êmbolo rapidamente para espremer as células através do filtro. Descarte o meio extrudido, porque deve haver apenas alguns PMVs dentro dele.
7. Coloque mais 0,5 ml de meio na seringa e empurre-o rapidamente através do filtro. Recolhido o meio da segunda extrusão, que contémS PMVs de vários tamanhos.
8. Carregar 150 μL do meio coletado em uma placa de fundo de vidro de 35 mm e deixar as PMVs se assentarem para o fundo por cerca de 10 min. Examine os PMVs sob um microscópio de contraste de fase invertido equipado com uma câmera CCD usando a lente de objetivo 20X.

3. Exame do Conteúdo dentro dos PMVs Usando Microscopia Confocal

1. Para realizar a transfecção nas BMSCs, diluir 2 μg de ADN plasmídico superenrolado e 6 μL de reagente de transfecção catiónica ( por exemplo, PolyJet) em 50 μL de DMEM isento de soro. Vortex para misturar bem e girar brevemente para recolher todo o líquido dos lados do tubo.
2. Adicionar a solução diluída (do passo 3.1) gota a gota em solução diluída de ADN, agitar vigorosamente durante 1 min, centrifugar brevemente e incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
3. Substituir o meio antigo nas BMSCs, que foram semeadas a cerca de 30% de confluência durante a noite, com 2 mL de meio de cultura fresco e adicionar DNUma mistura de transfecção gota a gota.
4. Substituir por 2 mL de meio fresco após 12 h de transfecção.
5. Para rastrear proteínas citoplasmicamente localizadas, transfectar as células com o plasmídeo contendo uma cassete de expressão de EGFP (pEGFP-N1), como descrito acima. Colher as células por digestão com tripsina 48 h após a transfecção para a geração de PMV, como descrito acima.
6. Para rastrear as mitocôndrias, colorir as células com corante mitocondrial (1 μM, MitoTracker) em meio de cultura fresco durante 30 min a 37 ° C.
7. Para detectar o potencial de membrana das mitocôndrias, corar as células com o corante de cianina JC-1 (iodeto de 5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraetilbenzimi-dazolilcarbocyanina) (10 μg / ML) em meio de cultura fresco durante 30 min a 37 ° C.
   1. Lavar as células com 0,5 mL de PBS três vezes e depois colher as células por digestão com tripsina para a geração de PMV, como descrito acima.
   2. Carregar 150 μL do material coletadoIum num prato de fundo de vidro de 35 mm e permitir que os PMVs se assentem para o fundo durante cerca de 10 min. Examine os PMVs sob um microscópio confocal usando a lente objetiva de óleo 100X.
8. Para detectar EGFP ou o corante mitocondrial, ligar o laser de 488 nm e recolher o sinal a 505-530 nm. Para detectar JC-1, ligar os lasers de 488 nm e 543 nm e recolher os sinais a 505-530 nm e 560-615 nm. Defina o valor do pinhole para cerca de 1,4.

4. Preparação de PMVs Concentrados por Centrifugação

1. Colher as células por digestão com tripsina e gerar PMVs, como descrito acima, em 0,5 ml de meio de cultura.
2. Girar os PMVs a 1200 xg numa centrífuga de bancada durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 μL de meio de cultura com agitação suave.
3. Carregar 50 μL de PMVs num prato de fundo de vidro de 35 mm e deixá-los sedimentar à temperatura ambiente durante cerca de 10 min. Examine os PMVsSob um microscópio confocal usando a lente objetiva de óleo 40X.
4. Adicionar a série de solução de polietilenimina diluída (PEI) à cultura BMSC durante 1 hora e verificar sinais de citotoxicidade.
   NOTA: Aqui, o PEI a 2 μg / mL foi escolhido uma vez que nenhum sinal de toxicidade foi detectado em BMSCs.
5. Colha as células por digestão com tripsina e adicione PEI a 2 μg / mL durante 1 hora para carregar a membrana celular como um meio de prevenir a agregação. Gerar PMVs, como descrito acima, em 0,5 mL de meio de cultura. Concentrar os PMVs e examiná-los sob um microscópio confocal, como descrito acima.

5. Injecção de PMVs no Músculo Gastrocnêmio

1. Para corar a membrana, adicione corante CM-DiI (clorometil dialquil-indocarbocianina) (10 μM) em 1 mL de meio de cultura fresco às BMSC durante 30 min.
2. Colher as células (cerca de 5 x IO5) por digestão com tripsina e ressuspendê-las em 0,5 mL de meio de cultura. Adicionar PEI (2 μg / mL) durante 1H. Gerar e concentrar os PMVs em 100 μL de meio de cultura, conforme descrito acima.
3. Anestesiar um rato BALB / c por injecção de barbital de sódio (10 mg / kg) após 12 h de jejum.
4. Limpe o exterior do músculo gastrocnêmio com etanol a 75%. Injete lentamente os PMVs (100 μL) no músculo gastrocnêmio usando uma seringa de insulina 30 G.
5. Depois de administrar a anestesia, coloque uma gaze molhada sobre os olhos para a duração da experiência e aquecer o mouse com uma luz incandescente até que ele acorda. Casa o rato sozinho em uma gaiola de ventilação individual.
6. Para colher o músculo gastrocnêmio 12 h após a operação, matar o rato por deslocação cervical.
7. Polvilhe 75% de etanol sobre o músculo gastrocnêmio, abra a pele com uma tesoura e corte todo o músculo gastrocnêmio em ambas as extremidades.
8. Enxaguar o músculo com PBS e examiná-lo sob um microscópio de fluorescência usando a lente de objetivo 20X.
9. Aparar o músculo com umLâmina de barbear afiada para remover as peças sem fluorescência. Corte as peças com forte fluorescência vermelha em cerca de 9 mm ³ cubos.
10. Incorporar cada cubo em meio de temperatura de corte ótimo (OCT), submergir em nitrogênio líquido por 5 min, e armazená-lo em um congelador de -20 ° C até o uso.
11. Cortar as secções congeladas em pedaços de 20 μ m de espessura usando um criostato e aderir cada seção para um slide de vidro. Enxágüe a seção uma vez com PBS.
12. Desenhe um círculo ao redor da seção com uma haste de círculo de mancha e adicione 100 μL de DAPI (1 μg / mL). Aspirar a solução DAPI após 10 min de incubação à temperatura ambiente no escuro e lavar três vezes com PBS.
13. Coloque o óleo sobre a amostra, cubra-o com um deslizamento de vidro e feche a lâmina com esmalte. Examine a seção sob um microscópio confocal usando a lente objetiva de óleo 100X.
14. Para detectar CM-DiI, ligue o laser de 543 nm e colete o sinal em 560-615 nm. Para detectar DAPI, ligue o 405Nm laser e coletar sinal em 420-480 nm. Defina o valor do pinhole para cerca de 1,4.

Resultados

A chave para uma preparação bem-sucedida de PMVs depende muito da montagem correta da unidade de filtro ( Figura 1 ), que pode ser testada empurrando 1 mL de PBS através da membrana. Se ocorrer vazamento, volte a montar a unidade de filtro e teste novamente. No entanto, a fuga só pode ser testada de forma fiável quando as células são empurradas através da membrana. Se somente alguns PMVs forem detectados sob um microscópio regular usando o objetivo 10X, ou se o tamanho d...

Discussão

A terapia de reposição citoplasmática, conforme proposta neste manuscrito, tem vantagens únicas sobre outras abordagens relatadas, como terapia genética, molecular e celular. Os PMVs gerados a partir de BMSCs encapsulam não apenas os produtos dos genes de stemness, mas também organelas celulares intactas, que são essenciais para remediar os fenótipos de envelhecimento associados à senescência. Quando o citoplasma jovem é entregue às células senescentes, os mecanismos de mau funcionamento podem obter um breve alívio; Ao m...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Membranas IsoporeTM	Millipore	TSTP04700	3 mm de poro
Unidade de filtro descartável	Xinya, Xangai, China	25 mm	Seringa de insulina de polipropileno de grau médico
	BD	328446	1 mL
pN1-EGFP	Clontech	6085-1
MitoTracker	Sondas Moleculares	M7514	Verde FM, 1 μ M
JC-1	Beyotime, Haimen, China	C2006	10 mg/mL
CM-DiI	Beyotime, Haimen, China	C1036	10 mM
PEI	Sigma	P3143	Mn = 75.000
Microscópio de fluorescência	Nikon	Eclipse TE 2000	com câmera CCD
Microscópio Confocol	Carl Zeiss	LSM 510 Meta
PolyJet	SigaGen	SL100688	para transfecção celular