Medição da absorção de glicose e resposta à estimulação da insulina em<em&gt; In Vitro</em&gt; Myotubes primários humanos cultivados

Resumo

Neste método, as células musculares primárias humanas são cultivadas in vitro para obter miotubos diferenciados e as taxas de absorção de glicose são medidas. Nós fornecemos um protocolo detalhado para quantificar taxas em estados basais e estimulados por insulina usando [ ³ H] 2-desoxi-D-Glucose radiomarcado.

Resumo

O músculo esquelético é o maior depósito de glicose em mamíferos e contribui em grande parte para a homeostase da glicose. A avaliação da sensibilidade à insulina das células musculares é de grande relevância para todos os estudos dedicados a explorar o metabolismo da glicose muscular e caracterizar alterações metabólicas. Nas células musculares, as proteínas do transportador de glicose 4 (GLUT4) translocam para a membrana plasmática em resposta à insulina, permitindo assim a entrada maciça de glicose na célula. A capacidade das células musculares para responder à insulina, aumentando a taxa de captação de glicose é uma das leituras padrão para quantificar a sensibilidade das células musculares à insulina. Os miotubos primários humanos são um modelo in vitro adequado, uma vez que as células mantêm muitas características do fenótipo do doador, incluindo a sensibilidade à insulina. Este modelo in vitro também é adequado para o teste de quaisquer compostos que possam impactar a capacidade de resposta da insulina. As medições da taxa de absorção de glicose em miotubos diferenciados refletemSensibilidade à insulina.

Neste método, as células musculares primárias humanas são cultivadas in vitro para obter miotubos diferenciados, e as taxas de absorção de glicose com e sem estimulação com insulina são medidas. Nós fornecemos um protocolo detalhado para quantificar as taxas de transporte de glicose passiva e ativa usando [ ³ H] 2-desoxi-D-Glucose radiomarcado ([3H] 2dG). Os métodos de cálculo são fornecidos para quantificar as taxas basais e estimuladas por insulina, bem como a dobra de estimulação.

Introdução

O músculo esquelético é o maior depósito de glicose em mamíferos e contribui em grande parte para a homeostase da glicose. Este tecido responsivo à insulina é o principal local de captação de glicose que é desencadeado pela estimulação de insulina ¹ .

Na diabetes tipo 2, a resistência à insulina é observada em vários tecidos, incluindo o músculo esquelético, e conduz à concentração de glicose no sangue acima do normal. Assim, é de grande relevância para determinar o nível de sensibilidade à insulina deste tecido e suas células, quer seja para caracterizar um defeito em um sujeito, quer para avaliar a eficiência de ....

Protocolo

1. Preparação de meios e soluções de cultura de células

1. Preparação de meios de cultura
   1. Prepare o meio de proliferação (PM), completando o meio F-10 de Ham com glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (5 μg / mL final), 2% de soro de vitelo fetal (FCS) e 2% de suero.
   2. Prepare o meio de diferenciação (DM), completando o meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (5 μg / mL final) e FCS a 2%.
2. Preparação de soluções de absorção de glicose
   Cuidado: o manuseio de material radioativo só é permitido em uma área restrita e controla....

Resultados

No dia 3, os mioblastos alcançam a confluência ( Figura 1A ). Os mioblastos nesta fase são tipicamente mononucleados. O meio foi alterado e no dia 8, a diferenciação foi completada ( Figura 1B ) (seção de protocolo 2). Após 5 dias de diferenciação, os miotubos são alinhados e tipicamente polinucleados. Os miotubos primários humanos foram submetidos a um tratamento com palmitato ou apenas com BSA antes da medição da taxa de absor.......

Discussão

A absorção de glicose é uma medida biológica fundamental para testar ativadores ou inibidores na cultura celular e como eles afetam o uso de glicose e a capacidade da célula de responder à insulina. O método descrito aqui mostrou-se rápido e confiável e tem sido amplamente utilizado em muitos estudos usando miotubos primários de indivíduos saudáveis ​​e / ou pacientes metabólicamente afetados ^{6 , 7 , 10 ,}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Célula muscular primária humana	Preparação interna a partir de biópsias do músculo esquelético humano	Preparação interna a partir de biópsias do músculo esquelético humano	Se não estiver disponível, use fonte comercial
Célula muscular primária humana	Promocell	C-12530	Deve ser cultivada com meios associados C23060 e C23061
Placa de 6 poços	Placas
multipoços Corning 356400 BioCoat Collagen IPresunto F10	Dutscher	L0145-500	1 g/L de glicose
	Glutamina Dutscher	X0551-100
penicilina/estreptomicina 100x	Thermo fisher scientific	15140122
Substituto de soro UltroserG	Pall France	15950.017	substituto de soro em texto
DMEM baixa glicose	Dutscher	L0064-500	1 g/L de glicose
Soro Fetal de Bezerro	Eurobio	CVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Dutscher	L0625-500	Contém Mg2+ (0.5 mM) e Ca2+ (0.9 mM)
Solução de insulina humana	Sigma-Aldrich	I9278
2-desoxi-D-glicose	Sigma-Aldrich	D6134
Albumina bovina	euromedex	04-100-812-E
livre de ácidos graxos BSA	Roche	10,775,835,001
palmitato	Sigma-Aldrich	P0500
Deoxy-D-glicose, 2- [1,2-3H (N)]	PerkinElmer	NET328A001MC	Atividade Específica: 5 - 10 Ci (185-370GBq) / mmol, 1 mCi (37MBq
Citocalasina B	Sigma-Aldrich	c2743
PICO PRIAS VIAL 6 mL	PerkinElmer	6000192
ultima gold MW CA	PerkinElmer	6013159	líquido de cintilação
bê Templar Assassin contra-ataque	PerkinElmer	2900TR