Glycoengineering metabólica do ácido siálico usando N-acil-modificado Mannosamines

Resumo

Ácido siálico é uma monossacarídeo-unidade típica encontrada em glicoconjugados. Está envolvido em uma infinidade de interações moleculares e celulares. Aqui nós apresentamos um método para modificar a expressão de superfície de ácido siálico célula usando glycoengineering metabólica com derivados de N- acetylmannosamine.

Resumo

Ácido siálico (Sia) é um componente altamente importante de glicoconjugados, tais como N- e O- os glicanos ou glicolipídeos. Devido à sua posição na termini não-redução de oligo - e polissacarídeos, bem como suas características químicas únicas, ácido siálico é envolvido em uma infinidade de interações ligante-receptor diferente. Modificando a expressão de ácido siálico na superfície das células, dependentes de ácido siálico interações serão influenciadas consequentemente. Isto pode ser útil para investigar interações ácido siálico-dependente e tem o potencial para influenciar certas doenças de uma forma benéfica. Via metabólica glycoengineering (MGE), a expressão de ácido siálico na superfície da pilha pode ser modulada. Neste documento, células, tecidos ou mesmo todo animais são tratados com C2-modificado derivados de N- acetylmannosamine (ManNAc). Estes aminoácidos açúcares atuam como moléculas de ácido siálico precursor e, portanto, são metabolizados para ácido siálico espécie correspondente e expressa na glicoconjugados. Aplicar este método produz efeitos intrigantes sobre diversos processos biológicos. Por exemplo, ele pode reduzir drasticamente a expressão de ácido polysialic (polySia) em células neuronais tratadas e afeta, portanto, diferenciação e crescimento neuronal. Aqui, nós mostramos a síntese química de duas das mais comuns derivadas - acylmannosamine C2-modificado N, N- propionylmannosamine (ManNProp) bem como o N- butanoylmannosamine (ManNBut) e ainda mostrar como esses não-naturais aminoácidos açúcares podem ser aplicados em experiências da cultura de pilha. A expressão de espécies modificadas ácido siálico é quantificada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e mais analisada através de espectrometria de massa. Os efeitos sobre a expressão de ácido polysialic são elucidados através de Western blot utilizando um anticorpo ácido polysialic comercialmente disponível.

Introdução

Ácido siálico é um monossacarídeo que normalmente pode ser encontrado na termini não-redução de glicoconjugados, tais como N- e O- os glicanos ou glicolipídeos. Entre todos os monossacarídeos, ácido siálico tem algumas características químicas únicas. Tem um backbone de átomo C 9, um grupo carboxílico na posição C-1, que é deprotonado e, assim, negativamente carregadas sob condições fisiológicas e uma função amino na posição C-5. Embora a data¹, caracterizaram-se mais de 50 naturais variantes de ácido siálico, a forma predominante de ácido siálico, encontrado em seres humanos é N- acetilneuramínico ácido (Neu5Ac). Out....

Protocolo

1. preparação dos reagentes e Buffers

1. Preparação da solução de metóxido de sódio 3 mM
   1. Dissolva o metóxido de sódio 8,1 mg em 50 mL de metanol (3 mM) em um frasco de vidro de 100 mL com uma barra de agitação. Armazenar em temperatura ambiente (RT) durante várias semanas.
2. Preparação de tampão Tris-HCl
   1. Combinar a 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl e 146 mg de EDTA em uma garrafa de vidro de 100 mL com uma barra de agitação e dissolver em 80 mL de água.
   2. Adicionar o hidróxido de sódio (1 M, em água) ou HCl (20%, em água) para a solução de agita, enquanto observa o pH com um medid....

Resultados

Cromatogramas HPLC do fluorescente etiquetado Neu5Ac e os padrões de Neu5Gc estão representadas na Figura 2. Usando o método descrito neste documento, Neu5Gc DMB-rotulado elutes tipicamente entre 7-9 min tempo de eluição e DMB-Neu5Ac entre 10 a 12 min. Vários pequenos picos no cromatograma costumam aparecem entre 2-6 min. Estes picos representam não tenha reagido DMB e reação intermediários²⁵.

Discussão

Se os derivados quimicamente sintetizados do ManNAc, ManNProp e ManNBut são analisados através de espectrometria de massa, apenas o pico de massa correto para ambas as amostras deve ser identificado. Portanto, os produtos podem ser considerados para ter um grau de pureza superior a 99%. Pequenas quantidades de Neu5Gc, que normalmente não é encontrada em células humanas²⁹, são detectadas nas fracções da membrana das células lisadas. Isto provavelmente ocorre através de uma via de salvamento que rec.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células	Sigma-Aldrich	92110411
meio RPMI	Sigma-Aldrich	R8758
Frascos de cultura de tecidos de 75 ml	Greiner	690175
placas de 48 poços	Corning	3548
FCS	PAA	A15-102
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Tripsina	Gibco	15400-054
EDTA	Roth	X986.1
Tris	Serva	37190.03
SDS	Roth	2326.2
Equipamento SDS-PAGE (tanques, vidraria, etc., máquina	VWR	SDS Gel/Blot
Acrilamida	Roth	3019.1
Escada de proteína	Fisher Scientific	267620
Nitrocelulose	GE Healthcare	10600002
Ponceau red	Roth	5938.2
Leite em pó	Roth	T145.3
ECL	Millipore	WBLUF 0500
Unidade de filtro centrífugo de 0,5 ml com membrana de 3 kDa	Merck-Millipore	UFC500324
15 mL	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS430791-500EA
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
2-Propanol	Sigma-Aldrich	34965-1L	HPLC gradiente grau
4,5-metilenodioxi-1,2-fenilenodiamina dicloridrato	Sigma-Aldrich	D4784-50MG
48 poço, placa de cultura de tecidos de fundo plano	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS3548-100EA
Tubos de centrífuga de 50 mL	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS430829-500EA
Acetonitrila	Sigma-Aldrich	34967-1L	HPLC grau gradiente
Aprotinina de pulmão bovino	Sigma-Aldrich	A1153-10MG	pó liofilizado, 3-8 TIU/mg cloreto de
butirila	Sigma-Aldrich	109614-250G
C18 Coluna RP	Phenomenex	00F-4435-E0	110 Å, 3 µ m tamanho de partícula, 4,6 x 150 mm
Cloridrato de D-manosamina	Sigma-Aldrich	M4670-1G
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco	PAN Biotech	P04-36500
Ácido etilenodiaminotetracético	Sigma-Aldrich	E9884-100G
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	56302-50ML-GL
Solução	de ácido clorídricoSigma-Aldrich	H1758-100ML	36,5-38,0%, em água
Leupeptina	Sigma-Aldrich	L2884-10MG
Metanol	Carl-Roth	T169.2	HPLC grau gradiente
N-Acetil-D-manosamina	Sigma-Aldrich	A8176-250MG
Ácido N-acetilneuramínico	Sigma-Aldrich	A0812-25MG
Ácido N-glicolilneuramínico	Sigma-Aldrich	G9793-10MG
Fluoreto de fenilmetanossulfonil	Sigma-Aldrich	P7626-250MG
Cloreto de propionila	Sigma-Aldrich	P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1,5 mL, âmbar (proteção contra luz)	Eppendorf	30120191
Safe-Lock Tubes, 1,5 mL,	Eppendorf	30120086
solução de bissulfito	Sigma-Aldrich	13438-1L-R-D	40%, em água
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	746398-500G-D
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	795429-500G-D
Solução de hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	319511-500ML	1,0 M, em água
Metóxido de sódio	Sigma-Aldrich	164992-5G
Ácido trifluoroacético	Sigma-Aldrich	T6508-100ML-D
Cloridrato de tris	Sigma-Aldrich	T5941-100G
Tripsina 0,25% / EDTA 0,02% em PBS	PAN Biotech	P10-019100
Água	Carl-Roth	T905.1	HPLC gradiente grau
de sílica gel 60	Carl-Roth	9779.1
HPLC	Agilent
Sistema ESI-MSD	Agilent

Tubos de centrífuga sólido Sodium incolor