Artigo de método

Glycoengineering metabólica do ácido siálico usando N-acil-modificado Mannosamines

DOI:

10.3791/55746

⸱

25 de novembro de 2017

 , 
1Max von Pettenkofer-Institut & Genzentrum, Virologie, Nationales Referenzzentrum für Retroviren, Medizinische Fakultät, LMU München, 2Institut für Laboratoriumsmedizin, klinische Chemie und Pathobiochemie, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Institut für Physiologische Chemie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Neste artigo

Resumo

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Ácido siálico é uma monossacarídeo-unidade típica encontrada em glicoconjugados. Está envolvido em uma infinidade de interações moleculares e celulares. Aqui nós apresentamos um método para modificar a expressão de superfície de ácido siálico célula usando glycoengineering metabólica com derivados de N- acetylmannosamine.

Resumo

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Ácido siálico (Sia) é um componente altamente importante de glicoconjugados, tais como N- e O- os glicanos ou glicolipídeos. Devido à sua posição na termini não-redução de oligo - e polissacarídeos, bem como suas características químicas únicas, ácido siálico é envolvido em uma infinidade de interações ligante-receptor diferente. Modificando a expressão de ácido siálico na superfície das células, dependentes de ácido siálico interações serão influenciadas consequentemente. Isto pode ser útil para investigar interações ácido siálico-dependente e tem o potencial para influenciar certas doenças de uma forma benéfica. Via metabólica glycoengineering (MGE), a expressão de ácido siálico na superfície da pilha pode ser modulada. Neste documento, células, tecidos ou mesmo todo animais são tratados com C2-modificado derivados de N- acetylmannosamine (ManNAc). Estes aminoácidos açúcares atuam como moléculas de ácido siálico precursor e, portanto, são metabolizados para ácido siálico espécie correspondente e expressa na glicoconjugados. Aplicar este método produz efeitos intrigantes sobre diversos processos biológicos. Por exemplo, ele pode reduzir drasticamente a expressão de ácido polysialic (polySia) em células neuronais tratadas e afeta, portanto, diferenciação e crescimento neuronal. Aqui, nós mostramos a síntese química de duas das mais comuns derivadas - acylmannosamine C2-modificado N, N- propionylmannosamine (ManNProp) bem como o N- butanoylmannosamine (ManNBut) e ainda mostrar como esses não-naturais aminoácidos açúcares podem ser aplicados em experiências da cultura de pilha. A expressão de espécies modificadas ácido siálico é quantificada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e mais analisada através de espectrometria de massa. Os efeitos sobre a expressão de ácido polysialic são elucidados através de Western blot utilizando um anticorpo ácido polysialic comercialmente disponível.

Introdução

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Ácido siálico é um monossacarídeo que normalmente pode ser encontrado na termini não-redução de glicoconjugados, tais como N- e O- os glicanos ou glicolipídeos. Entre todos os monossacarídeos, ácido siálico tem algumas características químicas únicas. Tem um backbone de átomo C 9, um grupo carboxílico na posição C-1, que é deprotonado e, assim, negativamente carregadas sob condições fisiológicas e uma função amino na posição C-5. Embora a data1, caracterizaram-se mais de 50 naturais variantes de ácido siálico, a forma predominante de ácido siálico, encontrado em seres humanos é N- acetilneuramínico ácido (Neu5Ac). Outros mamíferos também expressam quantidades mais elevadas de N- glycolylneuraminic ácido (Neu5Gc)2,3.

Devido à sua posição exposta em glicoconjugados, ácido siálico é envolvido em uma infinidade de interações ligante-receptor, por exemplo, a vinculação dependente de hemaglutinina do vírus da gripe ao anfitrião células4. Um epítopo de ácido siálico, com importantes funções biológicas, especialmente durante a embriogênese e no sistema nervoso, é o ácido polysialic. O ácido Polysialic é um polímero de até 200 ácidos siálicos de 2,8-lig alfa. O portador de proteína principal do ácido polysialic é a molécula de adesão celular neural (NCAM). Polysialic ácido expressão modula a propriedade adesiva da NCAM em que polysialic ácido expressão diminui a adesão e aumenta a plasticidade com o sistema nervoso5.

Alterações na expressão de ácido siálico de (poli) acabará por afectar uma infinidade de interações biológicas diferentes. Isso pode ser usado para estudar processos dependentes de conhecido de ácido siálico em um nível molecular, para descobrir o romance glicoconjugado interações, ou explorar possíveis abordagens terapêuticas. Existem diferentes métodos disponíveis pelo qual a expressão de ácido siálico na superfície da pilha pode ser modulada, por exemplo, tratamento com ácido siálico glicosidases específico (sialidases), inibição de enzimas envolvidas na biossíntese de ácido siálico6 ,7,8, ou derrubando ou mudar a expressão da enzima chave da biossíntese de ácido siálico9.

Outro método versátil para modular a expressão de ácido siálico é MGE (engenharia metabólica também conhecido como oligossacarídeo, MOE). Neste documento, células, tecidos ou até os animais são tratados com não-naturais derivados de ManNAc que levam a modificações C2-amino. Sendo moléculas precursoras para o ácido siálico, após a absorção celular, estes análogos de ManNAc são metabolizados para não-natural unidirecionais siálico ácidos e podem ser expressa na sialylated glicoconjugados. As células tratadocom com derivados de ManNAc carregando C2-modificações alifáticas, tais como ManNProp ou ManNBut, incorporar ácido de N- propionylneuraminic (Neu5Prop) ou N- butanoylneuraminic acid (Neu5But) em seus glicoconjugados10 , 11. usando grupos funcionais apresentados a posição C2 de ManNAc, podem ser acoplados os ocorrendo ácidos siálicos não-naturais, por exemplo, através da ligadura de Staudinger ou a azida alkine cicloadição, com corantes fluorescentes e, portanto, visualizado na superfície celular12.

A expressão destes ácidos siálicos do não-natural tem efeitos intrigantes em muitos processos biológicos, incluindo infecções do patógeno, a adesão e migração de células tumorais, adesão celular geral, bem como vascularização e diferenciação (para revisão Ver: Wratil et al . 13). Curiosamente, MGE com N-acil modificado mannosamines também pode ser usado para interferir com a expressão de ácido polysialic. O ácido Polysialic é gerado por dois polysialyltransferases diferentes (ST8SiaII e ST8SiaIV). Foi demonstrado, que polysialyltransferase ST8SiaII é inibida pela natural ácido siálico precursores, tais como ManNProp ou ManNBut de14,15. Além disso, foi demonstrado em células de neuroblastoma humano que ManNProp ou ManNBut aplicativo reduz também sialylation no total15.

MGE com N-acil modificado mannosamines é um fácil de aplicar o método que tem sido utilizado com sucesso, não só em mamíferos e cultura de células de bactérias mas também em toda animais de diferentes espécies, tais como Caenorhabditis elegans16, zebrafish17ou18,de ratos a19,20,21. Especialmente ManNAc derivados alifáticas modificações, incluindo ManNProp e ManNBut, do rolamento são insignificante citotóxicos, mesmo em concentrações milimolar em meio de cultura celular ou plasma sanguíneo. Além disso, eles são relativamente fáceis de sintetizar.

Aqui, nós fornecemos detalhes sobre como usar o MGE com N-acetil modificado mannosamines. Primeiro, a síntese química de dois dos mais utilizados derivativos ManNAc neste campo, ManNProp e ManNBut, é explicado. Em seguida, mostramos como MGE pode ser aplicada em um experimento na vivo . Como exemplo, a linhagem de células de neuroblastoma Kelly foi escolhida para demonstrar a diminuição da expressão do epítopo polysialic por Western blot após o tratamento com os derivados de ManNAc. Os ácidos siálicos não-natural na superfície da pilha foram quantificados por CLAE e mais analisados através de espectrometria de massa.

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Protocolo

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1. preparação dos reagentes e Buffers

  1. Preparação da solução de metóxido de sódio 3 mM
    1. Dissolva o metóxido de sódio 8,1 mg em 50 mL de metanol (3 mM) em um frasco de vidro de 100 mL com uma barra de agitação. Armazenar em temperatura ambiente (RT) durante várias semanas.
  2. Preparação de tampão Tris-HCl
    1. Combinar a 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl e 146 mg de EDTA em uma garrafa de vidro de 100 mL com uma barra de agitação e dissolver em 80 mL de água.
    2. Adicionar o hidróxido de sódio (1 M, em água) ou HCl (20%, em água) para a solução de agita, enquanto observa o pH com um medidor de pH e ajustar o pH para 8,0.
    3. Adicione o volume de água necessário para alcançar um volume final de 100 mL. Filtre a solução através de um sistema de filtro estéril de 0,22 µm.
      Nota: a reserva de 100 mL de Tris-HCl conterá 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl e 5 mM EDTA (pH 8.0). A solução pode ser armazenada a 4 ° C durante várias semanas.
  3. Preparação da solução de aprotinina
    1. Dissolva a aprotinina 10 mg em 1 mL de água (1,54 mM). Alíquota da solução de aprotinina em 10 x 1,5 mL-plástico tubos (100 µ l cada). Armazenar a-20 ° C durante várias semanas.
  4. Preparação da solução de leupeptin
    1. Dissolva leupeptin 10 mg em 2 mL de água (10 mM). Alíquota da solução leupeptin 10 x 1,5 mL-plástico tubos. Armazenar a-20 ° C durante várias semanas.
  5. Preparação da solução de fluoreto (PMSF) phenylmethylsulfonyl
    1. Dissolva 34,8 mg PMSF em 2 mL de etanol (100 mM). Alíquota da solução PMSF em 10 x 1,5 mL-plástico tubos. Armazenar a-20 ° C durante várias semanas.
  6. Preparação da solução de 1,2-diamino-4,5-methyldioxybenzol-dicloridrato (DMB)
    1. Combine 15,62 mg DMB, 352 µ l β-Mercaptoetanol e solução bissulfito de sódio 48 µ l (39%) e adicionar água de 9,6 mL (6,9 mM DMB, 500mm β-Mercaptoetanol e 0,19% bissulfito de sódio). Alíquota da solução DMB em 40 x 1,5 mL-plástico tubos (250 µ l cada). Armazenar protegido da luz, a-20 ° C durante várias semanas.
  7. Preparação 1 M trifluoroacético (TFA) da solução de ácido
    1. Adicione 770.3 µ l de 100% TFA para 9,23 mL de água em um tubo plástico de 15 mL (1 M). Armazenar a 4 ° C durante várias semanas.
  8. Preparação da solução de TFA de 120 mM
    1. Adicione 92.4 µ l TFA (100%) para 9,91 mL de água (120 mM) em um tubo plástico de 15 mL. Armazenar a 4 ° C durante várias semanas.
  9. Preparação da solução de hidróxido de sódio (NaOH) de 400 mM
    1. 160 mg de NaOH em 10 mL de água (400 milímetros) em um tubo plástico de 15 mL, dissolva. Armazenar a 4 ° C durante várias semanas.
  10. Preparação de Lise borrão ocidental
    1. Dissolver 5,84 g NaCl, 0,1 g de Tris (hidroximetil)-aminomethan (Tris), 0,1 g de CaCl2, 0,95 g MgCl2e Triton-X100 1G em 100 mL de água e ajustar o pH a 7,8. Loja a 4 ° C. Adicione 100 µ l de cada inibidor de protease (aprotinina, leupeptin e PMSF) antes de usar o tampão de Lise.
  11. Preparação do tampão de eletroforese (SDS-PAGE) do sódio Dodecil sulfato gel de poliacrilamida
    1. Dissolver 0,3 g Tris glicina 1,5 g e 0,1 g SDS em 100 mL de água e ajustar o pH para 7,3. Loja em RT.
  12. Preparação do buffer de borrão ocidental
    1. Dissolver 0,3 g Tris, glicina 1,1 g em 90 mL de água e adicionar 10 mL de etanol. Loja em RT.
  13. Preparação da solução de bloqueio
    1. Dissolva 1 g de poder de gordura de leite grátis na salina de 25 mL tamponada fosfato (PBS). Sempre prepare fresco.

2. síntese de ManNProp e afins N-acil-modificado Mannosamines

  1. Dissolva o cloridrato de mannosamine 431,2 mg em 10 mL solução de metóxido de sódio de 3 mM em um frasco de vidro de 50 mL com uma barra de agitação.
  2. Arrefecer a mistura no gelo a 0 ° C. Para a solução de agita, adicione lentamente cloreto de propionil gota 210 µ l (2,4 mmol), ou cloreto de butanoyl 248 µ l (2,4 mmol) para sintetizar ManNProp ou ManNBut, respectivamente. Incube a mistura mexendo a 0 ° C, durante 4 h.
  3. Transferi a solução para um tubo de plástico de 50 mL. Picar furos de 4-8 na tampa do tubo plástico com uma agulha fina. Congelar rapidamente a solução usando nitrogênio líquido e posteriormente lyophilize (gelo seco) para 48 h ou até que esteja completamente seca.
  4. 350 g de gel de sílica 60 se misturam com 750ml etil-acetato/metanol/água (15:2:1) (esta é uma suspensão). Preencher uma coluna de vidro (35 mm de diâmetro e 70 cm de comprimento) com a suspensão de sílica gel 60 e lavar a coluna preparada com uma adicional de 100 mL etil-acetato/metanol/água (15:2:1) antes do uso.
  5. Dissolver os produtos secos da etapa 2.3 (produto de 5 g secada) em 10 mL etil-acetato/metanol/água (15:2:1) e carga-los usando uma pipeta para a sílica gel de coluna. Colete frações 4 mL após 500 mL (para ManNProp). Nota: ManNBut vai eluir da coluna aproximadamente depois de 700 mL.
  6. Transferi as frações eluted para tubos de plástico de 15 mL. Picar 3-6 furos na tampa do tubo plástico com uma agulha fina. Rapid congelar a solução usando nitrogênio líquido e posteriormente lyophilize-la até que esteja completamente seca.
    Nota: Os produtos liofilizados podem ser armazenados por vários meses no RT
  7. Verificar a pureza dos produtos por espectrometria de massa (ver seção 9).
    Nota: Como alternativa, pureza também pode ser verificada por 1H. ressonância magnética Nuclear (RMN).

3. cultura celular

  1. Células de neuroblastoma Kelly cultura meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contendo 10% de soro fetal bovino, 100 U penicilina, estreptomicina 100 mg, 2 mM L-glutamina contendo 5 mM ManNAc, ManNProp de 5 mM ou 5 mM ManNBut, a 37 ° C e 5% de CO2.
    Nota: As células cultivadas em meio sem ManNAc ou seus análogos são usadas como um controle.
  2. Antes da aplicação do mannosamines, separar as células de neuroblastoma Kelly incubando-os por 10 min com tripsina/EDTA (0,25%, 0,02%, em PBS) e conta usando um contador-câmara de Neubauer ou célula. As células com números definidos com base no tamanho do prato/placa de semente.
    1. Para medir os monossacarídeos ácido siálico, sementes 1 x 105 células no meio de 500 µ l para uma placa de cultura de tecidos de 48-bem. Para a análise de ácidos polysialic, sementes 1 x 106 células em 3 mL de meio numa placa de cultura de células de diâmetro de 6 cm. Incube a 37 ° C e 5% de CO2. Substitua o medium cada 24 h.
      Nota: O efeito da MGE aumenta com o tempo total de tratamento. Para alta eficiência metabólica trate as células de 5-7 dias.
  3. Após o tratamento, decante o meio. Lave os pratos/placas com PBS. Separe as células incubando-os por 10 min com tripsina/EDTA (0,25%, 0,02%, em PBS). Neutralize a tripsina, adicionando o mesmo volume de meio de cultura celular para as células desanexadas. Transferi as células destacadas para tubos de plástico de 15 mL. Centrifugar as amostras por 3 min a 500 x g e descartar o sobrenadante.
    1. Adicione células de PBS e centrífuga de 5 mL (ver passo 3.3). Repita o procedimento de lavagem mais duas vezes.
      Nota: O centrifugado lavados sem sobrenadante pode ser armazenado a-20 ° C por vários dias. Se a expressão de ácido polysialic é para ser elucidado continuam a seção 10.

4. Lysis da pilha para análise HPLC

  1. Preparação de tampão de Lise HPLC
    1. Combine o tampão Tris-HCl de 5 mL, 5 µ l aprotinina solução, solução de leupeptin 20 µ l e solução PMSF 50 µ l.
      Nota: 5 mL de tampão de Lise HPLC conterá 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 µM aprotinina, 40 µM Leupeptin e 1 mM PMSF (pH 8.0). Esse buffer deve estar sempre preparado fresco antes da lise celular.
  2. Ressuspender as células coletadas Pelotas (passo 3.3) cada em 500 µ l gelada HPLC-Lise e ultraproceda à sonicação as amostras com uma agulha de processador ultrasônico três vezes durante um período de 30 s às amplitudes de média-alta. Fixe as amostras no gelo pelo menos 1 min entre os ciclos.

5. separação da fração de membrana

  1. Centrifugar as amostras de células lisados por 2 h a 20.000 x g e 4 ° C. Separe o sobrenadante (aproximadamente 480 µ l), representando as proteínas cytosolic, em tubos plásticos de 1,5 mL. Determine a concentração de proteína destas frações usando, por exemplo, o Bradford ou ensaio bicinchoninic ácido (BCA).
    Nota: A concentração de proteína (aproximadamente 1 mg/mL) das frações citosólica mais tarde pode estar relacionada com a mediu a quantidade de espécies respeitado ácido siálico. A pelota representa a fração de membrana, que é usada na etapa 6.1.

6. ácido hidrólise

Nota: Oligo - e polissacarídeos nas membranas celulares são hidrolisados a monossacarídeos. Além disso, possível O-modificações nos monossacáridos são hidrolisadas, também. Isto é necessário para a análise quantitativa de HPLC, porque a esmagadora maioria dos ácidos siálicos nas fracções da membrana é naturalmente incorporada em glicoconjugados e possivelmente pode suportar O-acetil ou O- lactolyl modificações.

  1. Adicionar 150 µ l M 1 TFA-solução para as frações separadas da membrana (pelota da seção 5). Incube as amostras por 4 h a 80 ° C com agitação a 200-600 rpm.
  2. Centrifugar as amostras por aproximadamente 30 min em 20.000 x g e 21 ° C, utilizando tubos de filtro de 0,5 mL com 3 membranas de exclusão kDa, até que o volume da fase superior é inferior a 20 µ l.
    Nota: Este passo é importante para eliminar detritos molecular superior.
  3. Transferi a fase inferior contendo moléculas menores, incluindo as espécies de ácido siálico, para tubos de plástico de 2 mL. Picar furos de 2-4 para as tampas dos tubos de plástico com uma agulha fina. Rapid congelar as amostras usando nitrogênio líquido e depois lyophilize-los durante a noite.
    Nota: As amostras secas podem ser armazenadas por vários dias no RT. Replace um boné sem buracos para conservação mais longa.

7. fluorescente de rotulagem

  1. Re-suspender as amostras secas em solução de TFA 10 µ l 120 mM e adicionar 50 µ l de solução DMB. Transferi as amostras para tubos de escuro 1,5 mL para protegê-los de luz ultravioleta.
  2. Para os padrões, dissolver 1 µ l Neu5Ac (60 ng/mL, em água) ou 1 µ l Neu5Gc (60 ng/mL, em água) em 10 µ l 120mm TFA solução tubos escuros 1,5 mL. Adicione 50 µ l solução DMB.
  3. Incubar as amostras da membrana celular e os padrões para 1,5 h a 56 ° C protegido da luz. Após a incubação, adicione 4 µ l de solução de NaOH de 400mm para cada amostra para parar a reação de rotulagem.

8. HPLC análise

Nota: Amostras etiquetadas são analisadas em um sistema HPLC equipado com uma coluna C18 RP (110 Å, tamanho de partícula de 3 µm, 4.6 x 150 mm), um detector de fluorescência e um coletor de fração. Os solventes usados são o metanol, acetonitrila e água. Certifique-se de desgaseificar todos os solventes antes da medição, se o sistema HPLC carece de um desgaseificador interno.

  1. Definir a temperatura da coluna a 40 ° C e configurar o detector de fluorescência com 373 nm de excitação e 448 nm por emissão, respectivamente. Injetar o volume de amostra 10 µ l e separar as sondas por 50 min na taxa de fluxo de 0,5 mL/min com água/metanol/acetonitrilo (6:8:86) como eluente. Para análise de espectrometria de massa, recolha os picos de interesse.
    Nota: Neu5Gc deverá eluído após 6-8 min, Neu5Ac após 9-12 min, Neu5Prop depois de 17-23 min e Neu5But após 38-44 min. As amostras fracionadas podem ser armazenadas por vários h a 4 ° C, protegido da luz.
  2. Após a medição de cada amostra, lavar a coluna para 7,5 min a taxa de fluxo de 1,0 mL/min (≈ 1,5 volume) com água/metanol/acetonitrilo (6:25:69) e re-equilibrar o sistema para 7,5 min, a taxa de fluxo de 1,0 mL/min com água/metanol/acetonitrilo (6:8:86).
  3. Para análise quantitativa, calcule a área sob a curva dos picos de interesse usando o software operacional do respectivo sistema de HPLC-22ácido siálico.
    Nota: Os dados obtidos podem ser relacionados para o Neu5Ac ou o padrão de Neu5Gc e as concentrações de proteína medido nas fracções citosólica (ver secção 5.1).

9. espectrometria análise de monossacarídeos ácido siálico

Nota: Picos de retenção HPLC de interesse podem ser mais analisados por espectrometria maciça de cromatografia líquida (LC)-ionização electrospray (ESI-MS), a fim de verificar a espécie natural ácido siálico.

  1. Para análise de espectrometria de massa, injetar 20 µ l de amostra coletada em um sistema Detector seletivo LC/massa (MSD) com metanol de 79,9%, 20% de álcool isopropílico e 0,1% de ácido fórmico como eluente, taxa de fluxo de 0,5 mL/min, 4 kV tensão capilar e 350 ° C temperatura capilar 22 , 23.
  2. Do software de avaliação do respectivo sistema LC/MSD, selecione o pico de interesse no cromatograma total do íon. Ver os o espectro de massa do pico resolvido. Exiba a relação massa/carga positiva entre 300 e 700.
    Nota: DMB rotulagem de ácidos siálicos leva a um aumento na massa molecular de 116,2 g/mol. As espécies de DMB-rotulado o ácido siálico têm as seguintes massas moleculares: DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436.2 g/mol, DMB-Neu5But = 453,2 g/PM comum adutos são acetonitrilo, sódio ou álcool isopropílico.

10. Western Blot análise de ácido Polysialic em células de Neuroblastoma de Kelly

  1. Preparação de lisados celulares
    1. Adicione 1 mL de tampão de Lise borrão ocidental para as pelotas de célula da etapa 3.3 e vórtice. Incube durante 30 min no gelo. Vórtice cada 5 min. Centrifugar as amostras por 1,5 h em 20.000 x g e 4 ° C. Recolha o sobrenadante contendo as proteínas das células lisadas.
    2. Determine a concentração de proteína das frações de proteína, por exemplo, o Bradford ou o ensaio BCA. Dilua as amostras a uma concentração de proteína de 1,5 µ g / µ l de tampão de Lise.
    3. Preparar as amostras para o SDS-PAGE, adicionando 10 amortecedor da amostra Laemmli µ l a fração de proteína 90 µ l (1,5 µ g / µ l) e ferver a amostra por 5 min24.
  2. Immunoblotting
    1. Use gel de SDS-acrilamida 8% com 20-30 µ l bolsos e 0,75 ou 1 mm de espessura. Funcione o gel a 25 mA por 2 h no RT
    2. Remova cuidadosamente a tampa de vidro do gel. Cortar e descartar a parte superior do gel contendo os bolsos de carregamento. Coloque o gel em uma membrana de nitrocelulose (0,2 µm), previamente embebido em buffer de Western blot. Transferência das proteínas de nitrocelulose, de acordo com a recomendação do sistema (por exemplo, 250 mA para 1 h a 4 ° C).
    3. Remova a membrana de nitrocelulose do sistema mancha. O blot com Ponceau mancha vermelha para visualizar as proteínas. Transferir a membrana de nitrocelulose em uma câmara de plástico e adicionar 10 mL de solução de bloqueio. Incubar durante 1 h no RT ou overnight a 4 ° C.
    4. Decantar a solução de bloqueio e adicionar o anticorpo monoclonal anti-polySia 735 (1 µ g/mL) em PBS. Incubar a membrana por 1h no RT ou overnight a 4 ° C. Após a incubação, lave a membrana pelo menos três vezes por 5 min com PBS.
    5. Adicione policlonal anti-mouse IgG anticorpo secundário (1 µ g/mL) acoplado a peroxidase de rábano (HRP) ou uma etiqueta fluorescente em PBS. Incubar a membrana por 1h no RT Após a incubação, lave a membrana pelo menos três vezes por 5 min com PBS.
    6. Transferi a membrana em uma placa de um adequado sistema de imagem. Detecta o sinal de acordo com as instruções do fabricante.

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Resultados

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Cromatogramas HPLC do fluorescente etiquetado Neu5Ac e os padrões de Neu5Gc estão representadas na Figura 2. Usando o método descrito neste documento, Neu5Gc DMB-rotulado elutes tipicamente entre 7-9 min tempo de eluição e DMB-Neu5Ac entre 10 a 12 min. Vários pequenos picos no cromatograma costumam aparecem entre 2-6 min. Estes picos representam não tenha reagido DMB e reação intermediários25.

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Discussão

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Se os derivados quimicamente sintetizados do ManNAc, ManNProp e ManNBut são analisados através de espectrometria de massa, apenas o pico de massa correto para ambas as amostras deve ser identificado. Portanto, os produtos podem ser considerados para ter um grau de pureza superior a 99%. Pequenas quantidades de Neu5Gc, que normalmente não é encontrada em células humanas29, são detectadas nas fracções da membrana das células lisadas. Isto provavelmente ocorre através de uma via de salvamento que rec...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos L. D. Nguyen pela revisão do manuscrito e frutíferos debates. Além disso, agradecemos J. Dernedde e H. G. Nguyen nos ajudar a preparar a gravação do vídeo. A maioria das cenas do vídeo foram filmadas nos laboratórios da R. Tauber. Agradecemos também o Instituto Max Planck de coloides e interfaces e por nos dar livre acesso a suas instalações de espectrometria de massa. RH foi apoiado pelo DFG (ProMoAge).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CélulasSigma-Aldrich92110411
meio RPMISigma-AldrichR8758
Frascos de cultura de tecidos de 75 mlGreiner690175
placas de 48 poçosCorning3548
FCSPAAA15-102
Pen/StrepGibco15140-122
TripsinaGibco15400-054
EDTARothX986.1
TrisServa37190.03
SDSRoth2326.2
Equipamento SDS-PAGE (tanques, vidraria, etc., máquinaVWRSDS Gel/Blot
AcrilamidaRoth3019.1
Escada de proteínaFisher Scientific267620
NitroceluloseGE Healthcare10600002
Ponceau redRoth5938.2
Leite em póRothT145.3
ECLMilliporeWBLUF 0500
Unidade de filtro centrífugo de 0,5 ml com membrana de 3 kDaMerck-MilliporeUFC500324
15 mLSigma-Aldrich (Corning)CLS430791-500EA
2-MercaptoetanolSigma-AldrichM6250-10ML
2-PropanolSigma-Aldrich34965-1LHPLC gradiente grau
4,5-metilenodioxi-1,2-fenilenodiamina dicloridratoSigma-AldrichD4784-50MG
48 poço, placa de cultura de tecidos de fundo planoSigma-Aldrich (Corning)CLS3548-100EA
Tubos de centrífuga de 50 mLSigma-Aldrich (Corning)CLS430829-500EA
AcetonitrilaSigma-Aldrich34967-1LHPLC grau gradiente
Aprotinina de pulmão bovinoSigma-AldrichA1153-10MGpó liofilizado, 3-8 TIU/mg cloreto de
butirilaSigma-Aldrich109614-250G
C18 Coluna RPPhenomenex00F-4435-E0110 Å, 3 µ m tamanho de partícula, 4,6 x 150 mm
Cloridrato de D-manosaminaSigma-AldrichM4670-1G
Solução salina tamponada com fosfato de DulbeccoPAN BiotechP04-36500
Ácido etilenodiaminotetracéticoSigma-AldrichE9884-100G
Ácido fórmicoSigma-Aldrich56302-50ML-GL
Soluçãode ácido clorídricoSigma-AldrichH1758-100ML36,5-38,0%, em água
LeupeptinaSigma-AldrichL2884-10MG
MetanolCarl-RothT169.2HPLC grau gradiente
N-Acetil-D-manosaminaSigma-AldrichA8176-250MG
Ácido N-acetilneuramínicoSigma-AldrichA0812-25MG
Ácido N-glicolilneuramínicoSigma-AldrichG9793-10MG
Fluoreto de fenilmetanossulfonilSigma-AldrichP7626-250MG
Cloreto de propionilaSigma-AldrichP51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1,5 mL, âmbar (proteção contra luz)Eppendorf30120191
Safe-Lock Tubes, 1,5 mL,Eppendorf30120086
solução de bissulfitoSigma-Aldrich13438-1L-R-D40%, em água
Cloreto de sódioSigma-Aldrich746398-500G-D
Hidróxido de sódioSigma-Aldrich795429-500G-D
Solução de hidróxido de sódioSigma-Aldrich319511-500ML1,0 M, em água
Metóxido de sódioSigma-Aldrich164992-5G
Ácido trifluoroacéticoSigma-AldrichT6508-100ML-D
Cloridrato de trisSigma-AldrichT5941-100G
Tripsina 0,25% / EDTA 0,02% em PBSPAN BiotechP10-019100
ÁguaCarl-RothT905.1HPLC gradiente grau
de sílica gel 60Carl-Roth9779.1
HPLCAgilent
Sistema ESI-MSDAgilent
Tubos de centrífuga sólido Sodium incolor

Referências

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