Artigo de método

Agulhas personalizadas para alevinos do cérebro de roedor

11.1K vistas

⸱

DOI:

10.3791/55751

⸱

24 de janeiro de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, and National Institute of Neurosciences, University of Ferrara, 2Laboratory for the Technologies for Advanced Therapies (LTTA), University of Ferrara

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Descrevemos aqui um protocolo para o microinjection do cérebro de roedores que usa agulhas de quartzo. Estas agulhas não produzir dano tecidual detectável e assegurar a entrega confiável, mesmo em regiões profundas. Além disso, eles podem ser adaptados às necessidades de pesquisa pelos projetos personalizados e podem ser reutilizados.

Resumo

Microinjeções têm sido utilizadas por um longo tempo para a entrega de drogas ou toxinas dentro de áreas específicas do cérebro e, mais recentemente, eles têm sido utilizados para entregar produtos de terapia genética ou célula. Infelizmente, as técnicas de microinjeção atual usar agulhas de aço ou vidro, que são de qualidade inferior por várias razões: em particular, agulhas de aço podem causar danos nos tecidos e agulhas de vidro podem dobrar quando abaixado profundamente no cérebro, ausente da região de destino. Neste artigo, descrevemos um protocolo para preparar e usar agulhas de quartzo que combinam um número de características úteis. Estas agulhas não produzir dano tecidual detectável e, sendo muito rígida, garantir a entrega confiável na região desejada cérebro mesmo quando usando coordenadas profundas. Além disso, é possível personalizar o design da agulha, fazendo vários furos do diâmetro desejado. Vários furos facilitam a injeção de grandes quantidades de solução dentro de uma área maior, Considerando que grandes buracos facilitam a injeção de células. Além disso, estas agulhas de quartzo podem ser limpos e reutilizadas, tal que o procedimento se torna rentável.

Introdução

Microinjeções têm sido utilizadas por um longo tempo para a entrega de compostos farmacologicamente ativos de modular a atividade neuronal em áreas específicas do cérebro. Além disso, eles têm sido usados para injetar toxinas perto de populações neuronais particulares, para imitar neurodegenerativas eventos característicos de determinadas doenças, por exemplo 6-hidroxi-dopamina no sistema de dopamina nigrostriatal para imitar a doença de Parkinson 1 , 2 ou o saporin de IgG immunotoxin 192 a lesão do sistema colinérgico3. Mais recentemente, procedimentos de microinjeção tem sido usados para entregar enxertos de vetores ou células virais para terapia de gene ou célula cerebral experimental transtornos4,5.

O tipo clássico de agulhas utilizadas nestes estudos é feito de aço inoxidável. Apesar de fácil e prático de usar, agulhas de aço têm um número de problemas6: eles são relativamente grandes e podem danificar o tecido, com vazamento da barreira hemato - encefálica e ativação de astrócitos; Além disso, eles podem produzir dielétrico de tecido cerebral que entra a agulha, criando um obstáculo, ou até mesmo completamente evitando o fluxo da solução desejada. Mais recentemente, agulhas de vidro preparado ad hoc dos capilares foram introduzidas no usam7,8. Estas não causam ativação de danos nem astrocyte significativa de tecido, mas são relativamente flexíveis e podem dobrar quando introduzida em estruturas profundas, reduzindo a precisão da localização (observações pessoais).

Portanto, há uma necessidade de reduzir, tanto quanto a possíveis danos (especialmente ao realizar experimentos para curar danos) aumentando a precisão e reprodutibilidade (i.e., certifique-se de que toda solução é entregue e assegurar a localização correta). Além disso, seria desejável usar projetos diferentes da agulha para garantir uma distribuição ideal da solução injetada em áreas do cérebro com diferentes geometrias. Neste artigo, descrevemos um protocolo para preparar e usar agulhas de quartzo para alevinos do cérebro de roedor. Devido ao alto ponto de fusão, capilares de quartzo não podem ser puxados em um extrator convencional e, portanto, tem não sido usados no passado para gerar agulhas. Quartzo, no entanto, oferece algumas vantagens importantes sobre o vidro, em particular de alta rigidez e quebra resistência9. Por causa da sua rigidez, agulhas de quartzo são ideais para injeções em regiões do cérebro ventral. Por causa de sua alta resistência à quebra, eles podem ser modelados para incluir vários furos, obtendo projetos que possam revelar-se mais eficazes mesmo quando segmentando regiões do cérebro com geometrias complexas10.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comité de ética da Universidade de Ferrara para a experimentação Animal e pelo Ministério da saúde italiano. A chegada (pesquisa Animal: Reporting em experimentos Vivo11) orientações foram seguidas.

1. preparação de agulhas de quartzo

  1. Limpar e esterilizar os capilares de quartzo (ver Tabela de materiais), colocando-os por 5 min em água destilada, 5 min em 99% de etanol e 5 min em éter dietílico.
  2. Deixe os capilares sob o capô pelo menos 1 h para deixá-los secar completamente.
  3. Prepare as agulhas usando um extrator de laser de acordo com os parâmetros que permitem a produção de uma agulha suficientemente longo, suficientemente fina, dependendo das necessidades individuais.
    Nota: Nós usamos um puxador de laser (veja a Tabela de materiais). Use um programa de duas linhas para puxar. A primeira linha usa alta potência, o maior comprimento de digitalização (correspondente ao valor de filamentos) e não há força puxando. Esta combinação de parâmetros leva ao derretimento da porção maior do capilar com a menor velocidade de extensão, permitindo a formação de uma agulha longa com grande tamanho interno/externo e reduzida da haste. Desta forma, a agulha preserva uma alta resistência mecânica e diâmetro largo interno que permite a passagem de células-tronco ou partículas virais sem obstrução. Velocidade e atraso desta linha do programa devem parar a extensão capilar antes que a ponta se torna demasiado pequena e longa, perdendo as características de forma e mecânica necessária. A segunda linha do programa puxar é executada automaticamente, uma vez que o quartzo esfria para baixo (5 s). Parâmetros do poder, filamento e força de tracção são funcionais, cortar uma ponta com o menor comprimento possível ponta e íngreme da haste, evitando a separação das duas agulhas com uma ruptura de ponta. Rotineiramente, com o nosso equipamento, usamos o seguinte: 1 (uma) linha = potência 990, filamento 5, velocidade de 130, atraso 110, puxar 0; (b) linha 2 = poder 970, filamento 3, velocidade 0, demora 70, puxar o 0.
  4. Colocar as agulhas em um prato de Petri previamente limpado com álcool 70%.
    1. Cubra o prato com um filme plástico de parafina.
  5. Corte os capilares do micro-Dissecador.
    1. O start-up, deixe-o laser executar um processo de magazines para verificar a potência e a energia entregado. Em seguida, defina os parâmetros de corte.
      Nota: Nós usamos um micro-Dissecador (ver Tabela de materiais) e os seguintes parâmetros: energia de pulso de energia (63 µ j), diâmetro do feixe do laser de 20% da máxima abertura a laser (abertura máxima: 1,0 µm) e velocidade de corte de 10% da velocidade máxima (maximal velocidade: 30 µm/s).
    2. Firmemente fixar a agulha sobre a mesa do microscópio e posicione sua ponta no centro da tela do computador.
    3. Na barra de menus, clique no ícone do lápis e usá-lo para desenhar uma marca para o corte a laser da agulha.
      Nota: O corte deve ser em um ângulo de aproximadamente 45 ° em relação à superfície da agulha.
    4. A função de barra lateral, selecione a bandeira que contém o botão "Começar a cortar" para permitir que o laser cortar o local previamente marcado.
    5. Se necessário, cortar o furo do lado, repetindo os procedimentos descritos em 1.5.2-3; Não há nenhuma necessidade de reposicionar a agulha (Figura 1).
  6. Pós-corte de limpeza.
    1. Conecte a agulha a uma bomba de vazia através de um tubo de plástico.
    2. Ligue a bomba e definir manualmente a taxa de fluxo para a frente a uma velocidade moderada (3 µ l/min).
    3. Aspire o 99% etanol primeiro e depois a água destilada para remover impurezas devido ao corte.
    4. Aspire o 99% etanol novamente para facilitar a secagem.
      Nota: Cada etapa deve durar pelo menos de 3 min.
  7. Armazene as agulhas em um prato de Petri devidamente coberto até o dia da cirurgia.
  8. Agulhas podem ser re-utilizadas; no final do experimento, limpe com água sanitária e álcool para remover a solução e possíveis resíduos de tecido. Para uma limpeza mais completa, colocar as agulhas em um frasco de armazenamento micropipeta com a ponta apontando para baixo, encha a jarra com água destilada até que as pontas estão cobertas, ferva por 1,5 min remover todo o tecido restante e, em seguida, lave com etanol.

2. o procedimento

  1. Seguindo as instruções fornecidas pelo manual do usuário da bomba, selecione o menu de configurações para calibrar a bomba de acordo com o diâmetro/volume da seringa microinjeção e definir a taxa de fluxo em 0,3 µ l/min.
  2. Encher uma seringa de 10 mL (equipada com uma agulha (por exemplo, agulha de Hamilton, 30 G) e um tubo curto de politetrafluoroetileno) com água estéril e usá-lo para encher a seringa de microinjeção (após ter muito cautelosamente retirado o pistão) e a injeção kit de peças de montagem para a bomba manual microinjeção (MMP).
    Nota: O kit MMP é usado para montar com firmeza a agulha na armação estereotáxica (Figura 2). O kit inclui: um tubo de politetrafluoroetileno, acoplador de luer-para-tubulação, titular da pipeta e gaxetas para pipetas com diferentes diâmetros externos.
  3. Conecte a agulha para o kit MMP.
    1. Liberar mais água através do sistema através da seringa de 10 mL e verificar se a água sai a agulha.
      Nota: Certifique-se de remover quaisquer bolhas de ar dentro do sistema, repetindo as etapas de enchimento.
  4. Desconecte a seringa de 10 mL seringa microinjeção enquanto lentamente empurra o pistão para sair uma gota de água na parte superior da seringa microinjeção. Insira o êmbolo na seringa microinjeção.
  5. Conecte a seringa de microinjeção de bomba e definir a taxa de fluxo em 0,3 µ l/min.
    Nota: Aguarde até que haja uma gota vazando da ponta da agulha e deixaram cair por mais 3 minutos.
  6. Definir o fluxo em 0,1 µ l/min e iniciar o procedimento de cirurgia. A bomba deve ser contínua durante a execução da operação.
    Nota: Para os experimentos relatados neste artigo, nós usamos ratos Sprague Dawley masculinos, de 300g (3 meses de idade). No entanto, o procedimento é aplicável a outras espécies, os ratos em particular.
  7. Induzi a anestesia geral, utilizando um método aprovado pela legislação local.
    Nota: Nós usamos uma mistura de injeção intraperitoneal (i.p.) de 85 mg/kg quetamina e 8 mg/kg de xilazina para 20-50 min de anestesia. É importante que pitadas de cauda e/ou dos pés são usadas para garantir que o animal está totalmente sedado. Nível de anestesia e sinais vitais básicos são avaliados antes de cirurgia começa e monitorado a cada 10 minutos durante a realização da cirurgia. A temperatura do corpo animal é mantida constante antes, durante e após procedimentos cirúrgicos, usando um re-circulação almofada de aquecimento de água. Os animais são monitorados até totalmente recuperado (por exemplo, eles são eretas e ambulatório). Além disso, animais recebem analgésicos (tramadol, 5-7 mg/kg, i.p.) no período pós-operatório a cada 24 horas durante três dias.
    1. Raspar a cabeça do animal e preparar adequadamente o local cirúrgico para cirurgia asséptica. Realize uma esfoliação de dois estágios com solução à base de iodo (Betadine), seguida por 70% de etanol. Além disso, para manter a assepsia, enrole o local cirúrgico com um pano cirúrgico (no vídeo foi omitido para fins de demonstração).
  8. Posicione o rato no quadro estereotáxica sobre uma água de re-circulação cobertor térmico. Para proporcionar alívio da dor adicional, no local da cirurgia, aplicar solução de lidocaína 0,5% (não exceder 7 mg/kg). Pre-esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos usar uma grânulo esterilizador ou líquido fria desinfecção por imersão o equipamento em qualquer 2% glutaraldeído mais 7,05% de fenol (Sporodicin ou Cidex) seguido de enxágue com água estéril ou soro fisiológico. A desinfecção deve ser realizada até mesmo entre os procedimentos. Fazer um corte longitudinal sobre o crânio, usando um bisturi esterilizado. Cuidado para evitar sangramento excessivo. Abra o couro cabeludo utilizando uma espátula plana e aplicar grampos cirúrgicos sobre os retalhos de pele para mantê-lo aberto. Muito suavemente, desanexe o periósteo para expor o bregma e a área do crânio através do qual será inserida a agulha.
  9. Montar o braço na armação estereotáxica (enquanto o fluxo está em curso) e mova a ponta da agulha exatamente em cima de bregma, prestando atenção para não quebrar sua ponta. Anotar as coordenadas antero-posterior e medio-lateral do bregma e traduzir para as coordenadas desejadas. Guiado por um estereomicroscópio, abaixe a agulha até sua ponta quase toca o crânio, marca a perfuração local depois de levantar um pouco o braço estereotáxica.
  10. Broca (broca ponta Ø: 0,8 mm; velocidade de broca: 1.000 rpm) o crânio no local marcado. Deve ter cuidado para não penetrar a dura-máter durante os procedimentos de perfuração. Durante a perfuração, pinga soro fisiológico estéril, para evitar dano ósseo e necrose.
  11. Cortar um pequeno pedaço de filme plástico da parafina e coloque-o sobre o crânio. Usando a pipeta µ l 10, faça uma gota da solução a injetar no filme plástico de parafina. Parar a bomba, ligeiramente recuperar o empurrador da bomba e criar uma pequena bolha de ar no capilar, puxando suavemente o êmbolo da seringa microinjeção.
  12. Abaixe o braço estereotáxico até a ponta da agulha atinge a queda. Desenhe a amostra, (muito lentamente) puxando o êmbolo da seringa microinjeção, evitando qualquer formação de bolha. Substituir o empurrador de bomba em contacto com o pistão e ligue a bomba com um caudal de 0,3 µ l/min. espere até a formação de uma gota (poucos min) antes de prosseguir para a próxima etapa.
    Nota: No presente experimento exemplo, líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) foi infundido no striatum (AP: + 1,5, ML: ±2.7; DV:-5.0) e no hipocampo dorsal (AP: -3,5, ML: ±2.1; DV: -3,5; em mm da dura-máter), 2 µ l/site. Para facilitar a comparação entre os métodos de injeção de dois, cada área do cérebro foi infundida usando uma agulha de quartzo em um hemisfério e uma ponta romba de 26 G ou uma agulha de aço inoxidável de ponta em bisel 30 G no outro.
  13. Reduzir o fluxo de 0,1 µ l/min, nick a dura-máter com uma agulha de bisel-ponta de aço inoxidável e abaixe lentamente o braço estereotáxico no dorso-ventral Machado, entrando no tecido cerebral. Quando a posição desejada é atingida, vai para baixo um adicional 0,1 mm, parar a bomba, levante o braço estereotáxico de 0,1 mm e começar novamente a bomba com o caudal a 0,3 µ l/min.
    Nota: A razão para manter um fluxo lento reduzindo a agulha é garantir uma pressão positiva que evita a penetração de pequenos fragmentos de tecido com a agulha em si. Tal evento obstruiria a ponta, prejudicando a entrega da solução. Desde que a taxa de fluxo é muito lenta, enquanto abaixando a agulha e a velocidade de redução é de cerca de 10 s/mm, isto implica que a quantidade de solução que permanecem ao longo da trilha de agulha é insignificante em comparação com aqueles injetado no local de destino. Esta precaução pode ser evitada quando usando agulhas com orifícios laterais.
  14. Iniciar o temporizador... e esperar o tempo necessário, dependendo do volume desejado para injetar (por exemplo, 6 min 40 s se injetando 2 µ l). Monitore a movimentação de bolha enquanto injetando. No final, parar a bomba e espere 5 min antes de recuperar lentamente a agulha. Quando a agulha de quartzo é completamente extraída, verificar a formação de uma gota na ponta da agulha e recomeçar a bomba.
  15. Selar a abertura na superfície com cera para osso do crânio, remover os clipes hemostáticos e suturar o couro cabeludo, revestir a área ao redor da ferida com um creme antibiótico (por exemplo, neosporin) e retornar o animal da gaiola em casa.
    Nota: Seguindo o protocolo de eutanásia aprovado pelo Comitê de ética institucional, para os experimentos descritos neste artigo, os animais foram profundamente anestesiados com uma injeção i.p. de 43 mg/kg de ketamina e xilazina 7 mg/kg e decapitados. Cérebros foram removidos, postfixed de modo em formol para 48 h e parafina incorporado. Coronais seções (8 µm) dos cérebros foram cortadas usando um micrótomo.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Comparamos os danos induzidos por microinjeção direta no hipocampo dorsal de rato e striatum usando uma agulha de quartzo (ponta de diâmetro externo 60 µM; buraco de lado um 20 µM de diâmetro e tipo C, Figura 1), em comparação com dois clássico, fim brusco 26 G e borda chanfrada de 30 G agulhas de aço inoxidável. Para este objectivo, injetamos 2 µ l de aCSF na direita e deixou o hipocampo dorsal e striatum usando respectivamente o quartzo e a agulha de aço e,...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

A técnica descrita neste artigo cumpre as necessidades descritas na introdução para otimizar alevinos que são executados para vários fins12. As agulhas descritas aqui reduzem o dano a um nível mínimo, essencialmente não-detectável; a variância com agulhas de vidro (que são propensas a dobrar), agulhas de quartzo são rígidas e certifique-se de um hit confiável da região cerebral desejado mesmo em profundas coordenadas. Além disso, o furo lateral garante entrega da solução, mesmo qu...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho tem sido apoiado por uma subvenção da Comunidade Europeia [projecto FP7-pessoas-2011-IAPP 285827 (EPIXCHANGE)].

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Capilares de quartzoSutter Instruments, Novato, CA USAQ100-50-10Sem extrator de filamento
Frasco de armazenamento de micropipetaWorld Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, EUAE210
Leica Microsystems, Wetzlar, AlemanhaLMD6500
Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸ tzerbach, Alemanha19138-U
Bomba de microinfusãoUniventor, Zejtun, MaltaModelo 864
Kit de bomba de microinjeção manualWPIItem#: Kit MMP-KITque permite que as micropipetas sejam montadas com segurança na estrutura estereotáxica
Furadeira de PrecisãoProxxon28510 MicroMot 50/EEixo de acionamento com rolamento de esferas com velocidade variável
Artficial Cerebral Fluido espinhalTocris3525
Agulhas 26 G sem corte e 30 g ChanfroHamilton26 G sem corte: 19138-U
30 G Chanfro: 20757
MicrótomoLeica, AlemanhaLEICA RM212RT
Sutter P2000 Microdissector a laser seringa Hamilton

Referências

  1. Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
  2. Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
  3. Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
  4. Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
  5. Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
  6. Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
  7. Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
  8. Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
  9. Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
  10. Sutter Instruments. P-2000: Laser-Based Micropipette Puller. , Available from: http://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html (2017).
  11. Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
  12. Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Agulhas de QuartzoMicroinje o CerebralLaser PullerEstereot xicaBomba de Microinje oPreven o de Danos TeciduaisAgulhas Reutiliz veisRegi es Profundas do C rebroCustomiza o de Agulhas

Artigos relacionados