Artigo de método

Técnicas de laboratório usadas para manter e diferenciar biótipos de Vibrio cholerae Isolados clínicos e ambientais

DOI:

10.3791/55760

⸱

30 de maio de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Plymouth State University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este manuscrito descreve as técnicas adequadas de manutenção de Vibrio cholerae , além de uma série de ensaios bioquímicos, utilizados coletivamente para a diferenciação rápida e confiável entre a V clínica e ambiental. Biótipos de cholerae em um ambiente de laboratório.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A bactéria aquática Gram-negativa Vibrio cholerae é o agente etiológico da doença gastrointestinal infecciosa cólera. Devido à prevalência global e à gravidade desta doença, V. Cholerae tem sido amplamente estudado em ambientes ambientais e laboratoriais, exigindo técnicas adequadas de manutenção e cultura. Classical e El Tor são dois biótipos principais que compõem o V. Serogrupo de cholerae O1, cada um apresentando características genotípicas e fenotípicas únicas que fornecem mecanismos confiáveis ​​para a caracterização de biótipos e requerem indução de condições de cultivo que induzem a virulência. Independentemente do biótipo da tensão causadora para qualquer infecção ou surto, o tratamento padrão para a doença envolve a terapia de reidratação suplementada com um regime de antibióticos. No entanto, a classificação do biótipo pode ser necessária para estudos laboratoriais e pode ter impactos mais amplos no campo biomédico.No início de 2000, foram identificados isolados clínicos que exibem traços genotípicos e fenotípicos de biótipos clássicos e El Tor. Os híbridos recentemente identificados, denominados variantes de El Tor, fizeram com que a identificação de biótodos isolados clínicos e ambientais se tornasse mais complexa do que os protocolos tradicionais de identificação de ensaio simples. Além de descrever V. Técnicas de manutenção e cultura geral de cholerae , este manuscrito descreve uma série de ecrãs genéticas baseadas em PCR específicas para genes ( ctxB e tcpA ) e testes fenotípicos (resistência a polimixina B, metabolismo de citrato, atividade proteolítica, atividade hemolítica, motilidade e metabolismo de glicose através de Voges- Ensaio Proskauer) usado coletivamente para caracterizar e / ou distinguir entre biótipos clássicos e El Tor. Juntos, esses ensaios fornecem uma abordagem sistemática eficiente para ser usada como alternativa ou, além disso, em experiências caras e intensivas em mão-de-obra na caracterizaçãoÇão de V. Isolados clínicos (e ambientais) de cholerae .

Introdução

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A cólera é uma doença do intestino delgado distal causada pelo consumo de alimentos contaminados ou água contendo a bactéria Gram-negativa Vibrio cholerae aquática. Os sintomas da cólera incluem vômitos e diarréia aquosa incontrolável, levando a desidratação severa, que, se não for tratada adequadamente, resultará em morte. V. Cholerae pode ser dividido em mais de 200 serogrupos com base na estrutura do antígeno O de lipopolissacarídeo de superfície celular. No entanto, apenas 2 sorogrupos, O1 e O139, mostraram potencial epidêmico ou pandêmico 1 , 2 . Além disso, o serogrupo O139 foi isolado principalmente no Sudeste Asiático 3 , 4 , enquanto o serogrupo O1 está distribuído em todo o mundo. Além disso, o sorogrupo O1 pode ser dividido em 2 biótipos principais: clássico e El Tor. O biótipo clássico foi responsável pela primeira pandemia de cólera 6Entre 1817 e 1923. A sétima pandemia em curso é resultado do biótipo El Tor, que deslocou globalmente o biótipo clássico no ambiente 5 , 6 , 7 . Recentemente, surgiram tensões que contêm características distintivas dos biótipos clássicos e El Tor 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 e desde então foram denominadas variantes 13 , 17 de El Tor. Algumas variantes de El Tor demonstraram capacidades de virulência elevadas com progressão de doença mais rápida e grave do que a observada anteriormente, enfatizandoA necessidade de uma abordagem mais abrangente para identificação de agentes e prevenção e tratamento de doenças 8 , 9 , 18 . Embora a identificação do biótipo não dê de imediato o tratamento, os avanços no desenvolvimento da vacina e nos futuros agentes terapêuticos podem beneficiar da distinção biótipo.

A primeira série de protocolos listados aqui permitirá que os investigadores mantenham corretamente V. Cepas de cólera em um ambiente de laboratório. Consistência e análise subseqüente requerem a preparação de estoque e o crescimento de isolados, o que não é biótipo-dependente. No entanto, para induzir de forma otimizada a expressão de genes de virulência, são necessárias técnicas de cultura de bioótipo independentes 19 . Além disso, a preparação para vários ensaios genéticos e bioquímicos é descrita neste manuscrito.

A toxina da cólera (CT) e a toxina co-rePilula gulosa (TCP) são dois principais fatores de virulência controlados pelo regulador mestre ToxT em ambos biótipos do V. Serogrupo 20 de cholerae O1. CT é uma toxina bipartida composta por cinco CtxB Subunidades envolvendo uma única subunidade CtxA, e é responsável pela perda rápida de eletrólito associada à cólera. TCP é um pilus tipo IV codificado pelo operão tcp ( tcpABQCRDSTEF ), e está envolvido na fixação e colonização do intestino delgado distal. TcpA é o primeiro gene do operão tcp que codifica as subunidades individuais de pilina essenciais para a construção do pilus 8 . A sequência de genes para ctxA é completamente conservada entre biótipos clássicos e El Tor, enquanto ctxB e tcpA diferem entre os dois biótipos, mas são conservados dentro de cada biótipo 8 . CtxB é completamente conservado entre biótipos, exceto em dois pontos básicos(115 e 203). No biótipo de El Tor, a timina reside nas posições de base 115 e 203, enquanto o biótipo clássico contém citosina nestas bases. TcpA é completamente conservado dentro de cada biótipo, mas diferem em bases múltiplas entre biótipos. Essas distinções genéticas servem como marcadores primários de identificação de biótipo e, depois de seqüenciar o produto de amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR), incluindo esses locais, as seqüências isoladas podem ser comparadas com O395 ou WT El Tor N16961 de tipo selvagem (WT) para determinar o fundo do biótipo De CT e TCP, respectivamente, em um isolado de V. cholerae .

Numerosos protocolos foram desenvolvidos para caracterizar as distinções fenotípicas entre os biótipos clássicos e El Tor 21 , 22 , 23 . A polimixina B é um antibiótico peptídico que compromete a integridade da membrana celular externa em bactérias Gram-negativasE a resistência à polimixina B podem ser visualizadas através do ensaio de resistência à polimixina B 21 . O citrato é um substrato primário do ciclo do Kreb e a capacidade de metabolizar o citrato como única fonte de carbono pode ser determinada utilizando o ensaio de metabolismo de citrato 22 . HapR codifica um regulador global e o regulador mestre de sensor de quorum em V. cholerae, HapR, que se liga a várias regiões promotoras e regula a expressão de genes e operões 24 . Algumas cepas patogênicas de V. cholerae têm uma mutação de mudança de quadro natural no gene hapR que causou a perda da densidade da expressão de genes da virulência 24 , 25 . Medir a atividade de protease regulada por HapR usando meios de agar de leite permite ao pesquisador identificar se um isolado particular contém um HapR 23 funcional. oTestes de análise de hemólise para a capacidade de uma cepa de secretar enzimas hemolíticas que lisam glóbulos vermelhos; O grau de hemólise pode ser visualizado em placas de agar de sangue 23 . A mobilidade é freqüentemente associada à virulência em V. cholerae e pode ser analisada usando placas de ágar de motilidade 23 . O teste de Voges-Proskauer prova a capacidade de uma cepa para fermentar a glicose como única fonte de carbono e produzir o acetato de subproduto 21 . Com o surgimento de variantes de El Tor, é difícil prever os resultados de qualquer teste fenotípico dado sem rastreio genotípico extensivo e antes de deduzir o fundo biótipo de V. Isolados de cholerae , recomenda-se a realização desta montagem de ensaios 23 e compare os resultados com as cepas de referência como na Tabela 2 .

Aqui, avançamos uma série de protocolos, utilizando coletivamente o referidoEnsaios fenotípicos e fenotípicos referentes a uma abordagem mais abrangente para a caracterização de V. Biótipos de cólera . Além disso, descrevemos as distinções genotípicas e fenotípicas do V conhecido. Variantes de cholerae El Tor (MQ1795 e BAA-2163), em comparação com as estirpes de referência de biótopos comummente usadas (WT clássico O395, WT El Tor C6706 e WT El Tor N16961, Tabela 1 ). O surgimento de variantes de El Tor apresentou desafios à confiabilidade de protocolos de caracterização de bióto simples de ensaio previamente empregados; No entanto, este sistema de identificação de múltiplos ensaios permitirá uma caracterização mais confiável do V clínico e ambiental. Isolados de cólera .

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Protocolo

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Nota: As considerações de tempo para cada ensaio devem ser feitas uma vez que as preparações de mídia individuais exigem tempos diferentes. Por exemplo, meios sólidos de placas de ágar devem ser deixados suficientemente arrefecer e secar (1-2 dias). Considerações de tempo adicionais ( isto é, colônia única e crescimento da cultura durante a noite) são especificadas em cada protocolo e são encontradas na Tabela 2 .

1. Preparação de mídia

  1. 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS)
    1. Pesar 4,0 g de NaCl, 0,1 g de KCl, 0,72 g de Na2HPO4 e 0,12 g de KH2PO4. Combine os constituintes em um frasco Erlenmeyer de 1 L, ajuste o volume para 500 mL com água desionizada, ajuste o pH para 7,2 usando um medidor de pH e adicione HCl gota a gota à solução, e autoclave ou filtre a esterilização usando um filtro de 0,22 μm. 1x PBS pode ser armazenado à temperatura ambiente indefinidamente.
      CUIDADO: O HCl é um ácido concentrado e deve ser manuseado de acordo comPara regulamentos institucionais, locais, estaduais e federais. Para obter as orientações de manuseio adequadas, consulte a ficha de dados de segurança fornecida pelo fabricante.
  2. Luria-Bertani (LB) Caldo
    1. Pesar 5,0 g de triptona, 2,5 g de extrato de levedura e 2,5 g de NaCl. Combine os constituintes em uma garrafa de 1 L, ajuste o volume para 500 mL com água desionizada, autoclave e armazene à temperatura ambiente por até 6 meses. Para condições clássicas de indução de virulência de biótipo, ajuste o pH para 6,5 ​​usando HCl antes do autoclave.
  3. Meio AKI contendo 0,03% (p / v) de NaHCO3
    1. Para Componente 1 (meio AKI): pesa 7,5 g de peptona, 2,0 g de extracto de levedura e 2,5 g de NaCl. Combine os constituintes em uma garrafa de 1 L, ajuste o volume para 450 mL com água desionizada e autoclave. O meio AKI pode ser armazenado à temperatura ambiente por até 6 meses.
    2. Para Componente 2 (NaHCO 3 ): pesa 1,5 g de NaHCO 3 e ajuste o volumeA 50 mL com água desionizada em uma vesícula estéril. Filtre a esterilização de NaHCO 3 usando um filtro de 0,22 μm. NaHCO 3 deve ser preparado imediatamente antes da utilização.
    3. Combine aspticamente os dois componentes criando uma relação de 1:10, filtrando o Componente 2 no Componente 1 antes de usar.
  4. Placas de agar de Luria-Bertani (LB)
    1. Pesar 5,0 g de triptona, 2,5 g de extracto de levedura, 2,5 g de NaCl e 7,5 g de ágar. Combine os constituintes em um frasco Erlenmeyer de 1 L, ajuste o volume para 500 mL com água desionizada, autoclave e prepare-se em placas de Petri esterilizadas de tamanho normal de 100 mm x 15 mm. A mídia chapeada pode ser armazenada em plástico por até 6 meses, com a tampa aberta a 4 ° C.
  5. Placas de Agar LB suplementadas com polimixina B
    1. Para Componente 1 (agar LB): pesa 5,0 g de triptona, 2,5 g de extracto de levedura, 2,5 g de NaCl e 7,5 g de ágar. Combine os constituintes em um frasco Erlenmeyer de 1 L, ajuste o volume para 500 mL wiÁgua desionizada e autoclave.
    2. Para o Componente 2 (polimixina B): dissolver a polimixina B em água desionizada em um tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL até uma concentração de 50 000 UI / μL e esterilizar o filtro usando um filtro de 0,22 μm.
    3. Uma vez que o Componente 1 é frio ao toque, mas ainda não solidificado, adicione assépticamente 500 μL de Componente 2 ao Componente 1 criando uma concentração final de 50 UI / μL e misture bem. Prepare-se em placas de Petri estéril padrão de 100 mm x 15 mm, despejando meios misturados de agar nos pratos de Petri. A mídia revestida pode ser armazenada em plástico por até 3 meses, com a tampa aberta a 4 ° C.
  6. Pratos de Agar Médio de Citrato Mínimo
    1. Para Componente 1 (agar com azul de bromotimol): pesa 7,5 g de ágar e 0,02 g de azul de bromotimol. Combine os constituintes em um frasco Erlenmeyer de 1 L, ajuste o volume para 450 mL com água desionizada e autoclave a mistura.
    2. Para Componente 2 (10x VBMM): pesa 10,00 g de MgSO4 7H2O, 10,0 g de ácido cítrico H2O, 50,0 g de K 2 HPO 4 anidro e 17,5 g de NaNH 4 HPO 4 4H 2 O. Combine os constituintes em um frasco Erlenmeyer de 1 L, ajuste o volume para 500 mL Com água desionizada e autoclave ou filtro esterilizado usando um filtro de 0,22 μm. VBMM 10x pode ser armazenado a temperatura ambiente até 6 meses.
    3. Adicione 50 mL do Componente 2 ao Componente 1 e prepare-se em placas de Petri esterilizadas de tamanho padrão de 100 mm x 15 mm, despejando meios de agar misturados nas placas de Petri. A mídia chapeada pode ser armazenada em plástico por até 6 meses, com a tampa aberta a 4 ° C.
  7. Pratos de Agar de Leite
    1. Para o Componente 1 (leite): pesar 8,0 g de leite seco sem gordura instantânea em um frasco Erlenmeyer de 1 L, ajuste o volume para 200 mL com água desionizada e autoclave.
    2. Para Componente 2 (agar com infusão cérebro-coração): pesa 3.68 g de infusão cérebro-coração e 6,0 g de ágar. Combine o conEm um balão Erlenmeyer de 500 mL, ajuste o volume para 200 mL com água desionizada e autoclave.
    3. Combine os dois componentes despejando o Componente 2 no Componente 1, depois de se autoclavar e misture bem. Prepare em placas de Petri estéril de 150 mm x 15 mm. As placas de leite podem ser armazenadas por até uma semana em plástico, lado da tampa para baixo a 4 ° C. Prepare-se em placas de Petri estéril de 150 mm x 15 mm, despejando meios de agar misturados nas placas de Petri.
  8. Placas de Agar Motilidade
    1. Para o Componente 1 (agar LB): pesa 5,0 g de triptona, 2,5 g de extracto de levedura, 2,5 g de NaCl e 2,0 g de ágar. Combine os constituintes em um frasco Erlenmeyer de 1 L, ajuste o volume para 500 mL com água desionizada e autoclave.
    2. Para o Componente 2 (cloreto de trifeniltetrazólio de 1% (p / v); TTC): pesar 0,25 g TTC. Ajuste o volume para 25 mL com água desionizada em uma vesícula estéril e filtre-se esterilizando usando um filtro de 0,22 μm. Armazenar até 6 meses a temperatura ambiente embrulhadoEm papel alumínio para minimizar a exposição à luz.
    3. Adicione 2,5 mL de TTC estéril a 1% (p / v) a mídia autoclavada.
    4. Despeje a mídia tão grossa quanto possível (≥50 mL / placa) em grandes placas de Petri estéril de 150 mm x 15 mm. A mídia revestida pode ser armazenada em plástico por até uma semana, com a tampa aberta a 4 ° C. Prepare-se em placas de Petri estéril de 150 mm x 15 mm, despejando meios de agar misturados nas placas de Petri.
  9. Voges-Proskauer (VP)
    1. Para o Componente 1 (caldo Metil Red-Voges-Proskauer, MR-VP): pesa 1,7 g de meio MR-VP em um balão Erlenmeyer de 500 mL, ajuste o volume para 100 mL com água desionizada e autoclave. O resíduo esterilizado MR-VP pode ser armazenado à temperatura ambiente por até 6 meses.
    2. Para Componente 2 (5% (p / v) alfa (α) naftol): pesa 1,0 g de a-naftol em uma vesícula estéril e ajuste o volume para 20 mL com etanol a 95%. O α-naftol pode ser armazenado à temperatura ambiente por até 1 semana envolvido em papel alumínio para minimizar a luz expOsure.
    3. Para o Componente 3 (40% (p / v) de hidróxido de potássio; KOH): pesar 20,0 g de KOH em uma vesícula estéril, ajustar o volume para 50 mL com água desionizada estéril. KOH pode ser armazenado por até 6 meses a temperatura ambiente em um recipiente de plástico.

2. Manutenção e crescimento de V. Cepas de cólera

  1. Preparação e Uso de Culturas de Stockes Frozen
    1. Pellet 1,8 mL de cultura líquida durante a noite por 2 min por centrifugação (≥8,600 xg) em um tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL, remover o sobrenadante e voltar a suspender o sedimento celular em 900 μL de caldo LB fresco por pipetagem.
    2. Adicione 900 μL de glicerol esterilizado a 60% (v / v) à cultura e misture por vortex.
    3. Transfira a mistura para um tubo criogênico esterilizado de 2 mL e armazene indefinidamente a -80 ° C.
    4. Para usar, remova uma pequena quantidade de estoque congelado usando um loop de inoculação estéril e uma série para colônias individuais em LB agAr chapas. Volte imediatamente o estoque congelado a -80 ° C após o uso para evitar que as culturas descongelam completamente. Incube as placas do lado da tampa para baixo durante 12 a 16 h a 37 ° C.
  2. Crescimento de culturas durante a noite em meio líquido
    1. Streak para colônias únicas (de acordo com a seção 2.1.4) de estoque congelado em placas de agar LB. Incube as placas do lado da tampa para baixo durante 12 a 16 h a 37 ° C.
    2. Inocule 4 mL de caldo LB líquido em um tubo de cultura estéril de 10 mL com uma única colônia, tocando a superfície da colônia única com uma vara de aplicador estéril e transferindo a colônia para o caldo líquido.
    3. Incubar com aeração em uma incubadora de agitador a 225 rpm durante 12 a 16 h a 37 ° C.
  3. Curva de crescimento
    1. Prepare a cultura durante a noite em caldo LB líquido, conforme descrito anteriormente no protocolo 2.2.
    2. Faça uma diluição 1: 100 de cultura durante a noite transferindo 250 μL de cultura durante a noite para 25 mL de caldo LB fresco num balão Erlenmeyer esterilizado de 250 mL.
    3. Medir a densidade óptica das culturas líquidas a 600 nm (OD 600 ) a cada hora a partir do momento da inoculação (T 0 ).
    4. Incubar uma diluição 1: 100 de cultura durante a noite com aeração em uma incubadora de agitador a 225 rpm até 30 h a 37 ° C, ou até que a cultura alcance a densidade máxima.
    5. Grafique o OD 600 vs. Tempo e use regressão linear para determinar o tempo de duplicação aproximado para cada estirpe.
  4. El Tor Biotype Virulence Inducing Conditions
    1. Streak para colônias únicas de estoque congelado em placas de agar LB. Incube as placas com o lado da tampa para baixo, durante 12 a 16 h a 37 ° C.
    2. Inocular 10 mL de meio AKI contendo 0,03% (p / v) de NaHCO3 com uma única colónia.
    3. Incubar cultura sem aeração a 37 ° C durante 3,5 h.
    4. Remova 7 mL de cultura e incuba os 3 mL restantes de cultuRe com aeração em uma incubadora de agitador a 225 rpm por mais 4 h.
  5. Condições Clínicas de Indução de Virulência de Biótipo
    1. Streak para colônias únicas de estoque congelado em placas de agar LB. Incube as placas do lado da tampa para baixo durante 12 a 16 h a 37 ° C.
    2. Inocule 4 ml de caldo líquido LB (pH 6,5) com uma única colônia.
    3. Incubar com aeração em uma incubadora de agitação a 225 rpm durante 12 a 16 h a 30 ° C.
  6. Pellet de células de lavagem em 1x PBS
    1. Pellet 1,8 mL de cultura durante a noite por 2 min por centrifugação (≥8,600 xg) num tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL e remova o sobrenadante usando uma pipeta. Re-suspender o sedimento celular em 1,8 mL 1x PBS por pipetagem.
    2. Repita o procedimento de lavagem três vezes seguido de uma ressuspensão final em 1,8 mL 1x PBS.

3. Caracterizando V. Biótipos de cólera

  1. PTelas genéticas baseadas em CR usando ctxB e tcpA
    1. Desenhe um conjunto de primers, que recozem aproximadamente 50-70 pb a montante e a jusante dos locais de inicialização e parada de translação de ctxB e tcpA , respectivamente.
    2. Prepare a cultura durante a noite em caldo LB líquido, conforme descrito anteriormente no protocolo 2.2.
    3. Isolar DNA cromossômico usando um kit comercialmente disponível projetado para bactérias Gram-negativas. O DNA cromossômico purificado pode ser armazenado indefinidamente a -20 ° C. O isolamento de DNA cromossômico usando kits comercialmente disponíveis geralmente leva cerca de 4 h.
    4. Use um espectrofotômetro de micro-volume para garantir que a amostra de DNA cromossômico seja de alta qualidade (A 260/280 > 1,8).
    5. Para cada isolado de DNA cromossômico, prepare a (s) reação (s) em cadeia da polimerase (PCR) no gelo em tubos de PCR de 200 μL estéreis e amplifique as regiões de ctxB e tcpA usando componentes de PCR padrão: Taq polymerase and buFfer (ou equivalentes), solução dNTP e primers forward / reverse. Use parâmetros de PCR padrão (~ 3 h). Por exemplo, use o seguinte protocolo:
      1. Desnaturação inicial a 95 ° C por 120 s.
      2. Desnaturação a 95 ° C por 60 s.
      3. Imprima os iniciadores a 60 ° C por 45 s.
      4. Estende-se a 72 ° C por 90 s.
      5. Repita as etapas 3.1.5.2 até 3.1.5.4 para 34 ciclos.
      6. Extensão final 72 ° C por 600 s.
      7. Suporte infinito a 4 ° C.
    6. Dye 5 μL de produto (s) de PCR respectivo (s) utilizando um corante de carga de gel de ADN 6x padrão e carrega aproximadamente 10 μL de escada de 1 kb e 10 μL de produto de PCR num gel de agarose a 1% em 1x Tris-Borate-EDTA (TBE) amortecedor.
    7. Execute a eletroforese em gel a 130 V até a frente do corante atingir a extremidade, mas não desligada, do gel (aproximadamente 90 min). O monitoramento constante é recomendado porque a tensão e os tempos de funcionamento podem variar dependendo do equipamento.
    8. Após verificação deAmplificação de PCR bem sucedida no tamanho esperado, purifique os demais produtos de PCR de 45 μL usando um kit de limpeza e concentrado de DNA comercialmente disponível.
    9. Produto (s) de PCR limpo de seqüência usando os mesmos primers utilizados para amplificação por PCR e prepara-se por diretrizes de facilidade de seqüenciamento local.
    10. Compare o formato FASTA das sequências de genes de cada isolado para a seqüência publicada disponível no site do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/), pesquisando os seguintes números de acesso na caixa de consulta de pesquisa.
    11. CtxB : região (clássica) entre VC0395_A1059 a VC0395_A1060 (El Tor) VC_1456
    12. TcpA : (clássico) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828
  2. Ensaios fenotípicos para a classificação do biótipo através da mancha
    1. Prepare a cultura durante a noite em caldo LB líquido, conforme descrito anteriormente no protocolo 2.2.
    2. Lavar a (s) pastilha (s) de células conforme especificado no protocolo 2.6.
    3. Use uma pipeta paraDetectar 1 μL de cultura lavada no respectivo meio. Para as especificações de seleção e incubação médias, consulte a Tabela 2.
  3. Ensaio de Motilidade
    1. Prepare a (s) cultura (s) durante a noite no caldo LB líquido, como indicado anteriormente no protocolo 2.2.
    2. Lavar a (s) pastilha (s) de células conforme especificado no protocolo 2.6.
    3. Inocule as placas de agar de motilidade inserindo inoculação de facada na cultura líquida lavada e "stab" verticalmente na mídia. Entre cada inoculação, esterilize a faca através de um queimador de Bunsen e, quando apanhar agar, assegure-se de que a faca de inoculação não se dobre, pois isso pode alterar os resultados.
    4. Incubar as placas do lado da tampa para cima durante 14 a 24 h a 37 ° C. Após 14 h, monitore as placas de motilidade de perto para evitar o crescimento excessivo de culturas.
  4. Ensaio Voges-Proskauer (VP)
    1. Prepare a (s) cultura (s) durante a noite no caldo LB líquido, como indicado anteriormente no protocolo 2.2.
    2. Inocular 4ML de caldo de Voges-Proskauer de metal vermelho ou caldo MR-VP, por pipetagem de 10 μL de cultura durante a noite previamente preparada em 4 mL de caldo de MR-VP em um tubo de cultura estéril e incuba com aeração em uma incubadora de agitador a 225 rpm por 12 a 16 H a 37 ° C.
    3. Adicionar 150 μL de α-naftol a 5% (p / v) e 50 μL de KOH a 40% (p / v) a 1 mL de alíquotas de RM-VP durante a noite, em tubos de cultura estéril, respectivamente.
    4. Em breve vortex e deixe repousar a temperatura ambiente por até 4 h até a mudança de cor se desenvolver.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para uma manutenção e uso adequados de qualquer tensão bacteriana, recomenda-se conhecer o tempo de duplicação da (s) tensão (ões) de interesse. Aqui, as taxas de crescimento variáveis ​​dos V comummente utilizados . As cepas de colesterol foram demonstradas através de uma curva de crescimento, e tempos de duplicação aproximados foram calculados usando regressão linear. WT El Tor N16961 e a variante El Tor MQ1795 demonstraram tempos de duplicação mais curtos (~...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dos mais de 200 V identificados. Sorogrupos de colesterol, apenas O1 e O139 têm potencial de epidemia. O serogrupo O1 pode ser dividido em dois biótipos: clássico e El Tor. No entanto, emergiram as variedades híbridas, denominadas Variantes 13 , 17 de El Tor , que possuem o fundo do biótipo El Tor e apresentam características clássicas 8 , 9 , 10

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pesquisa apoiada por New Hampshire-INBRE através de um Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA), P20GM103506, do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais do NIH.

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60% GlicerolCalbiochem356352http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352
AgarBecto, Dickinson and Co.214030http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch
Ágar com infusão cérebro-coraçãoBecto, Dickinson and Co.237500http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch
AgarosePeqlab732-2789https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+
Anidro K2HPO4Fisher ScientificP288-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID
Placas de Ágar SangueRemelR01200Armazene a 4 ° C;  http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar
Ácido BóricoFisher ScientificA73-500https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID
Bromotimol AzulFisher ScientificB388-10https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID
Ácido cítrico · H2Ode https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363da Fisher ScientificS72836-3
New England BiolabsN0446SLoja em -20 ° C;  https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset
EDTA DissódicoFisher ScientificS311-500https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID
DNA Clean & Concentrador™ -25 KitZymo ResearchD4007http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit
GelGreen Mancha de Ácido NucleicoBiotium41005https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/
Genesys 10SUV-VIS EspectrofotômetroThermo Scientific840-208100
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100 Gentra Puregene Yeast/Bact. KitQiagen158567https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation
HClFisher ScientificA144-212Corrosivo;   https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID
KClFisher ScientificP217-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID
KH< sub>2PO4Fisher ScientificP285-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID
KOHFisher ScientificP250-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID
Le LoopDecon Labs Inc.MP190-25
http://deconlabs.com/products/leloop/ Le StabDecon Labs Inc.MP186-5http://deconlabs.com/products/lestab/
MgSO4· 7H2OFisher ScientificM63-500https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID
Mini-Sub Cell GTBio Rad Labs1704406http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373
MR-VP CaldoDifco216300http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID
NaClFisher ScientificS271-10https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID
NaHCO3Fisher ScientificS233-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID
NaNH4HPO4· 4H2OFisher ScientificS218-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID
NanoDrop Lite EspectrotômetroThermo ScientificND-LITE-PRhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR
Leite em pó desnatadoNestlé CravoN/AN/A
PeptonaBecto, Dickinson and Co.211677http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch
Placas de Petri (100 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875712https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712
Placas de Petri (150 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875714https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID
Sal de sulfato de polimixina BSigma-AldrichP1004-10MUArmazene a 2-4 > C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US
Taq DNA PolimeraseNew England BiolabsM0273SLoja em -20 ° C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Taq Tampão de reaçãoNew England BiolabsM0273SArmazenar em -20 ° C;  https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Termociclador Bio-Rad C1000 Touch™  Bio Rad Labs1840148http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME
Cloreto de trifeniltetrazólioAlfa AesarA10870https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/
Base Tris FisherScientificBP152-1https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID
TriptonaBecto, Dickinson e Co.211705http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch
Extrato de leveduraBecto, Dickinson and Co.212750http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch
&alfa;-naftolMP Biomedicals204189http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189
Kit de Solução de Desoxinucleotídeo (dNTP) Sistema de Eletroforese Horizontal

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
  2. Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups. Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).
  3. Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).
  4. Albert, M. J., et al. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal. Lancet. 342 (8868), 387(1993).
  5. Barua, D. History of Cholera. Cholera. Barua, D., Greenough III, W. B. , Plenum Publishing Corporation. 1-36 (1992).
  6. Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A. Population Genetics of Vibrio cholerae. Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. Faruque, S. M., Nair, G. B. , Caister Academic Press. 29-47 (2008).
  7. Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).
  8. Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).
  9. Ghosh-Banerjee, J., et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).
  10. Ansaruzzaman, M., et al. The Mozambique cholera vaccine demonstration project coordination group. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).
  11. Ansaruzzaman, M., et al. Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique. Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).
  12. Lan, R., Reeves, P. R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).
  13. Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).
  14. Nair, G. B., et al. Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).
  15. Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y. Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1. Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. Faruque, S. M., Nair, G. B. , Horizon Scientific Press. 179-190 (2008).
  16. Safa, A., et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).
  17. Nusrin, S., et al. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic. J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).
  18. Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate. mSphere. 1 (5), e00253(2016).
  19. Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).
  20. DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).
  21. Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).
  22. Vogel, H. J., Bonner, D. M. Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).
  23. Son, M. S., Taylor, R. K. Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor. Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).
  24. Kovacikova, G., Skorupski, K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).
  25. Wang, Y., et al. The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains. Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).
  26. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques. J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).
  27. Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae. Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).

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