Criação de um modelo de roedor de aneurisma da Aorta Abdominal, bloqueando adventícia Vasa Vasorum perfusão

Resumo

Inserção de cateter de poliuretano para o lúmen aórtico e ligadura da sutura da aorta induz hipóxia crônica devido a hipoperfusão da adventícia vasa vasorum. Este artigo descreve um novo modelo animal de aneurisma da aorta abdominal (AAA) com características semelhantes da AAA em seres humanos.

Resumo

A adventícia vasa vasorum (VV) fornece oxigênio e nutrientes para a parede da aorta. Hipoxia na parede aórtica pode causar aneurismas da aorta abdominais alargados (AAAs). Este artigo apresenta e descreve um protocolo padrão usado para induzir a AAAs através de adventícia VV hipoperfusão, criado com uma combinação de inserção do cateter de poliuretano para o lúmen aórtico e ligadura da sutura da aorta abdominal infra-renal.

O protocolo envolve o uso de ratos machos, pesando 300-400 g, que são fornecidos alimentos e água ad libitum. Após a laparotomia com uma incisão abdominal na linha média ventral, é realizada a esfoliação da aorta, que bloqueia o fluxo de sangue no tecido perivascular. Aortotomy, envolvendo uma pequena incisão adjacente aos ramos da artéria renal é executada, e um cateter de poliuretano é inserido usando uma agulha de calibre 18 permanência. Após reparar a incisão, apertado da ligadura da aorta sobre o cateter bloqueia o fluxo de sangue VV da direção através da parede da aorta proximal sem perturbar o fluxo de sangue da aorta. Esta técnica pode induzir um AAA com progressiva dilatação da aorta.

O maior benefício deste modelo é que VV hipoperfusão provoca hipóxia do tecido e o desenvolvimento de um infrarrenal AAA, que tem características morfológicas e patológicas semelhantes de um humano AAA.

Introdução

A aorta abdominal é composta das seguintes três camadas: a parede vascular interna (íntima), camada medial (mídia) e parede vascular externa (adventícia), e destes, a adventícia tem um único sangue fornecer sistema conhecido como o vasa vasorum (VV). Tecido aórtico é fornecido com oxigênio através de adventícia VV de perfusão e difusão simples de oxigênio do sangue da aorta fluxo¹. No entanto, geograficamente, a aorta abdominal tem menos distribuição de VVs comparado em outras partes da aorta. ²

Um estudo anterior relatou em hipóxia do tecido em humana aneurisma da aorta abdominal (AAA) as paredes com espessura intraluminal trombo (ILT)³. Além disso, verificou-se que uma adventícia VV em paredes aneurismática é obstruída com alterações arterioscleróticas em uma taxa significativamente maior, que é associado a hipóxia do tecido no AAA paredes⁴. Com base nesses resultados, um novo modelo de roedor de AAA foi criado através da indução de hipoperfusão adventícia VV⁵. Neste modelo, VV hipoperfusão causada hipóxia do tecido e o desenvolvimento de um infrarrenal AAA, que tinha as características morfológicas e patológicas semelhantes de um humano AAA⁶. Principais exemplos foram a presença de ILTs e a acumulação de adipócitos hiperplásico⁶e o potencial de causar ruptura^7,8. Estas conclusões foram raramente observadas nos modelos anteriores de roedores. Portanto, este modelo muito pode contribuir para uma compreensão mais profunda do mecanismo responsável pelo desenvolvimento de AAA e ruptura. Apresentamos e descrever um protocolo padrão usado para induzir a AAAs através de adventícia VV hipoperfusão, e explicamos como induzir hipóxia na parede da aorta, usando técnicas cirúrgicas.

Protocolo

cuidados com animais e experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes de Hamamatsu Universidade escola de medicina Animal Care Comitê no centro para o cuidado Animal.

1. procedimento cirúrgico para criar o modelo

Nota: Coloque os instrumentos cirúrgicos em um esterilizador de grânulo para 10 s no pré-operatório. Usar luvas estéreis no intraoperatório.

1. Ratos machos uso, pesando de 300-400 g. permitir que os ratos acesso à comida e água ad libitum.
2. Anestesiar o rato com inalação de isoflurano (2,0-3,0 mL/L). Confirmar anesthetization adequada pela pitada de dedo do pé.
3. Raspar o cabelo no abdômen com um barbeador elétrico e esfregue o abdômen com álcool e uma solução de iodo-povidona.
4. Coloque o rato em posição supina na mesa de operação. Use pomada de veterinário no rato ' s os olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
5. Realizar uma laparotomia com uma incisão abdominal na linha média ventral, usando uma tesoura. Para proteger um campo cirúrgico limpo, embalar o conteúdo abdominal dentro da cavidade abdominal com gaze estéril, usando um retractor ferida.
6. Para desanexar da aorta no tecido perivascular, suavemente pegar e rasgar o retroperitônio com pinças para expor a parede da aorta e esfoliar no espaço retroperitoneal do nível da veia renal esquerda até a bifurcação da aorta infra-renal o tecido perivascular ( figura 1A).
7. Ligam os vasos ramificação da aorta abdominal com uma corda de seda 5-0 ao bloco sangue fornecem em um ponto longe da aorta que não restringem o lúmen aórtico.
8. Para bloquear o fluxo de sangue da aorta, colocar grampos vasculares logo abaixo da artéria renal e logo acima da bifurcação da aorta.
   Nota: O tamanho dos grampos deve ser maior que o diâmetro da aorta para bloquear o fluxo de sangue completamente. Um temporário ligadura de sequência de caracteres de seda 5-0 também é suficiente para bloquear o fluxo de sangue em vez dos clipes.
9. Semelhante a criação de uma hemorragia de ponto na superfície da parede da aorta, cortar a parede da aorta anterior usando um micro-scissor 5mm distalmente do clip da aorta, adjacente aos ramos da artéria renal, para inserir um cateter de poliuretano.
10. Inserir um cateter de poliuretano (diâmetro de 0.55 mm, diâmetro interior exterior 0,37 mm) usando um calibre 24 habitação agulha superficialmente através da incisão para lavar o sangue da aorta com água. Administrar uma seringa de 1 mL, cheia de água dentro do cateter de poliuretano e lavar o sangue restante na aorta com água. Após a irrigação, remova o cateter da aorta.
11. Antes de inserir um cateter de poliuretano (diâmetro de 1,20 mm, diâmetro interior exterior 0,94 mm) usando uma agulha de calibre 18 permanência, corte o cateter de poliuretano de 10 mm de comprimento ( figura 1B).
    1. Insert o corte pedaço do cateter de poliuretano no lúmen aórtico da incisão feita na etapa 1.9. Completamente Coloque o cateter de 10 mm no lúmen da aorta e reposicionar o ponto médio do cateter para coincidir com o local da incisão (ou seja, cobrir a incisão com o cateter).
12. Reparar a incisão com sutura interrompida usando uma sequência de monofilamento de 8-0 ( Figura 1).
13. Ligate a aorta abdominal, usando uma combinação de sequência de caracteres seda 5-0 e o cateter de poliuretano ( Figura 1).
    Nota: O lúmen da aorta pode ser mantido pelo cateter permanente. Ligate da aorta com firmeza para evitar desalinhando a posição do cateter. O cirurgião ' nó s é recomendada, pois adiciona um toque extra quando amarrando o primeiro lance do nó, formando um nó de pescador duplo, e um adicional fornece mais atrito e pode reduzir o afrouxamento.
14. Depois da ligadura, remover o grampo vascular na bifurcação da aorta e em seguida, remover o grampo vascular abaixo da artéria renal para restaurar o fluxo de sangue hemorragias anterógradas. Confirmar a pulsação aórtica bruta.
15. Fechar a incisão abdominal em duas camadas, o peritônio e outras camadas, com uma sutura de polipropileno 4-0. Firmemente de sutura a incisão para evitar um órgão projetava.
16. Aplicar lidocaína tópica na incisão abdominal. Coloque o rato sobre uma almofada de aquecimento até consciência retorna. Não abandone um rato até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Não retornam um rato que foi submetido a operação para a companhia de outros ratos, até que ele se recuperou totalmente.
17. Acompanhar de perto o rato após a operação. Injetar um bolus de solução salina estéril (1,0-2,0 mL) por via subcutânea, se um rato mostra sinais de aflição ou corpo perda de peso.
18. No pós-operatório, observar o desenvolvimento de tempo-curso da aorta alargada no hectograma ultra-som. Medida do diâmetro máximo do interior de borda a borda externa da aorta abdominal como descrito ⁵.

2. Colheita, fixação e coloração de Elastica-van Gieson (EVG)

1. vinte e oito dias no período pós-operatório, administrar pentobarbital de sódio ≥ 100 mg/kg intraperitonealmente para abater os ratos.
2. Abrir o rato ' cavidades abdominal s ventralmente. Fazer a incisão inicial, usando um bisturi. Colheita do aneurisma com uma tesoura e coloque a aorta colhida em formalina 10% tamponada neutra por 24-48 h.
   Nota: O cirurgião deve ser cuidadoso para evitar lesões da aorta e outros órgãos, ao expor o aneurisma. Um órgão abdominal elevado deve ser observado, indicando a formação do AAA. a Figura 2 mostra uma imagem na vivo e ex vivo de imagem; Esta amostra representativa de AAAs não está rompida.
3. EVG coloração ⁹
   1. Solução preparação
      1. preparar Verhoeff ' hematoxilina s misturando os seguintes na ordem determinada: hematoxilina alcoólica 20 mL de cloreto férrico 10% 8,0 mL, e Lugol ' iodo s 8 mL. Misture a solução entre cada adição. Esta solução pode ser preparada fresca, conforme necessário.
      2. Preparar Van Gieson ' s solução de fucsina ácida 1% de mistura 1 mL e ácido pícrico saturado 45 mL. Deixe ficar durante a noite e misture bem. Esta solução é estável por 2 semanas.
      3. Preparar solução diferenciadora (2% cloreto de férrico) misturando-se 10% FeCl ₃ 10 mL em 40 mL de água destilada. Esta solução pode ser preparada fresca, conforme necessário.
      4. Prepare 5% hipo por dissolver 5,0 g de tiossulfato de sódio em 100 mL de água destilada. Esta solução é estável por 1 ano.
   2. Procedimento de coloração
      Nota: ver referência ⁹ para obter detalhes.
      1. Brevemente, hidratar as seções fixas de parafina a aorta colhida em água destilada por 10 min. Coloque a aorta em Verhoeff ' hematoxilina s de 25 min. Lave com água e mergulho 10 - 30 vezes em diferenciar a solução (2% FeCl ₃). Enxaguar em água. Coloque em 5% hipo por 1 min. lavar em água. Lugar na Van Gieson ' s solução 5 min.
      2. Desidratando no álcool, na seguinte ordem: 75%, 90%, 95%, 100% e 100% de álcool para 30 s cada. Em seguida, desmarque em xilol por 5 min, duas vezes. Lugar em uma lamela com meio de montagem resinoso.
         Nota: as fibras elásticas aparecem azul escuro a preto; núcleos: azul para blaCK; colágeno: vermelho; e outros elementos de tecido: amarelo.

Resultados

As técnicas operatórias descritas criar um novo modelo animal de um aneurisma da aorta de induzida por hipóxia crônica, usando uma combinação de inserção do cateter de poliuretano e ligadura da sutura da aorta abdominal infra-renal em ratos. Os ratos descritos na seção de protocolo foram sacrificados 28 dias após o procedimento. A aorta foram colhida e criação da imagem para visualizar a formação de aneurisma. A Figura 2 mostra o desenvolvimento de AAA a fusiforme. As extremidades superiores e inferiores da aorta em ex vivo tem um diâmetro normal sem dilatação. Diâmetros da aorta foram medidos usando a ultra-sonografia transabdominal (Figura 3). O diâmetro geralmente atinge seu tamanho máximo em cerca de 14 dias após o procedimento; Depois disso, ela permanece inalterada ou aumenta ligeiramente. A Figura 4 mostra a imagem histopatológica do aneurisma no seu diâmetro máximo depois da coloração da EVG. A imagem do tecido no dia 28 (aneurisma) mostrou proeminente degradação das fibras elásticas, comparado a isso no dia 0.

Figura 1: Os procedimentos cirúrgicos para induzir um aneurisma da aorta abdominal (AAA).
(A) a aorta infra-renal é esfoliada no tecido circundante. (B) um cateter de poliuretano cortar 10 mm de comprimento é inserido através de uma pequena incisão na aorta. (C) a incisão é reparada com uma sutura de monofilamento de 8-0 e o fluxo sanguíneo é restaurado. (D) a aorta é ligada com uma sutura de seda 5-0 sobre o cateter inserido. Barra de escala = 5 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resultados representativos no pós-operatório.
Visão macroscópica no desenvolvimento de apresentando dia pós-operatório 28 de aneurismas da aorta abdominais fusiformes. A elevada margem do retroperitônio corresponde à borda externa do aneurisma (linhas quebradas; esquerda). As extremidades superiores e inferiores da aorta em ex vivo são normais (à direita). Barra de escala = 3 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Aórtico diâmetros máximos medidos usando a ultra-sonografia transabdominal.
O diâmetro da aorta aumentou neste modelo do rato. Diâmetros da aorta são apresentados como média ± desvio padrão (n = 12). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagens representativas do tecido aneurismático com Elastica van Gieson coloração.
Avaliação histológica com EVG coloração mostrando a lâmina elástica degenerativa na mídia e formação de um trombo intraluminal 28 dias após o procedimento (à direita). Fragmentação de fibra elástica na mídia da aorta e fibra de colágeno esparsas no adventitia aórtica são observadas no dia 28. Dia 0 é antes do procedimento (à esquerda). Barra de escala = 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Sob condições fisiológicas, as camadas interiores da parede da aorta são nutridas por difusão do fluxo do sangue luminal, Considerando que as camadas exteriores e meio são nutridas pela VV, que penetram o medial VV¹de adventitia. Fluxo de sangue VV na parede da aorta abdominal pode originar-se das seguintes três direções/áreas: (1) a direção proximal através da parede da aorta, direção (2) distal através da parede da aorta e (3) perivascular tecidos¹⁰. Anteriormente, nossa análise histológica de tecidos humanos identificados significativa estenose ou oclusão da VV na parede AAA, sugerindo que o fluxo de sangue VV na parede da aorta abdominal pode ser reduzida de⁴. É um ponto extremamente importante neste protocolo que um infrarrenal AAA foi causado por uma combinação de inserção do cateter de poliuretano e ligadura da sutura da aorta abdominal infra-renal. Para cuidadosamente esfoliar a camada de tecido, cirurgiões devem inserir um cateter de poliuretano suavemente a aorta e ligate firmemente a aorta para causar hipóxia crônica devido a hipoperfusão do VV adventícia e formação de aneurisma. Usando estas técnicas, fluxo de sangue na parede da aorta consequentemente é diminuído, e um ambiente hipóxico local é induzido. A redução do fluxo de sangue e aneurisma induzido por hipóxia formação indica que o fluxo de sangue VV na parede da aorta abdominal desempenha um papel na patogênese da formação do AAA.

Especificamente, um modelo de aneurisma da aorta deve satisfazer as seguintes condições: um 1.5-fold aumento do diâmetro vascular, em comparação com a linha de base, a degeneração da túnica média e inflamação da parede da aorta. Os mais populares modelos animais foram construídos através da indução de respostas inflamatórias usando substâncias, tais como CaCl₂¹¹, elastase¹²e angiotensina II¹³. Estes modelos podem ter uma grande reprodutibilidade e obviamente causar alteração patológica, e eles têm sido comumente utilizados em estudos de investigação. Em nosso modelo, avaliamos o diâmetro da aorta usando a ultra-sonografia a cada 7 dias de antes que o procedimento foi realizado até o dia 28, após o procedimento (Figura 3). Os resultados mostraram que o diâmetro da aorta moderadamente aumentado durante os 28 dias, indicando que esta mudança no diâmetro é semelhante ao que nos modelos anteriores de roedores. Observação bruta da forma vascular indicou uma forma fusiforme suave (Figura 2). No dia 28, nós sacrificou os ratos e realizada a análise histopatológica do tecido aórtico que foi recuperado. Rasgando e desaparecimento das fibras elásticas e colágeno da túnica média e adventícia foram observadas (Figura 4). Além disso, células inflamatórias, tais como macrófagos, estiveram presentes desde a adventícia túnica para a túnica média.

Atualmente, as opções de tratamento disponíveis para a AAAs limitam-se a reparação cirúrgica e endovascular stent enxertia, com taxas de mortalidade de 30-50% em pacientes com ruptura de AAA¹⁴. No entanto, nenhuma droga foi aprovada para uso clínico tratar AAAs. Não há debate que há discrepâncias nos resultados patológicos entre humanos e estabelecidos modelos animais utilizados na investigação de AAA. Semelhanças na patogênese entre AAA humano e modelos animais AAA são essenciais para o desenvolvimento de tratamentos farmacológicos. Sobre a eficácia dos modelos de roedores, nosso modelo de rato é morfologicamente semelhante aos seres humanos em termos de intraluminal trombo⁵ e adipogenesis⁸. Além disso, cerca de 20% dos ratos neste estudo teve ruptura de AAA e morreu dentro de 28 dias após o procedimento. Embora a ruptura de aneurisma da aorta é o evento mais importante para esta doença, ruptura é incomum com estabelecidos modelos experimentais de AAA, e o mecanismo ainda não foi elucidado. Portanto, este modelo é útil para a compreensão do mecanismo de dilatação do diâmetro da aorta e ruptura do aneurisma.

A criação deste modelo é necessária para alguns procedimentos cirúrgicos. Portanto, os investigadores devem praticar criando este modelo, que é uma limitação deste modelo. No futuro, gostaríamos de criar um modelo de roedor em que nós pode diminuir o fluxo sanguíneo por gradualmente espessamento das paredes do VV, resultando em aneurisma de aorta espontânea.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
rato	Japão SLC. Inc	Slc:SD rato	Sprague– Solução de
iodopovidona	Libatape Pharmaceutical Co., Ltd.
5-0 corda de seda	Akiyama Medical MFG. CO., LTD	JIS No.1
clipes vasculares	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	Cateter de poliuretano C-42-S-2
(agulha de demora de calibre 24	MEDIKIT	24G	Supercath Z4VTM, cateter de poliuretano de agulha de demora de calibre 24
(agulha de demora de calibre 18)	MEDIKIT	18G	Supercath Z3VTM, agulha de demora de calibre 18
8-0 corda de monofilamento	Sutura Ethicon	c-42-S-2	Sutura de polipropileno PROLENE, Repare a incisão com a sutura