Artigo de método
Neste protocolo, enjaulado proteína quinase A (PKA), um bioeffector de transdução de sinal de celular, foi imobilizada em uma superfície de nanopartículas, injetada no citosol e ativada pelo upconverted UV luz de irradiação de infravermelho próximo (NIR), induzindo desintegração de fibra de stress a jusante no citosol.
Nanopartículas de upconversion (UCNP)-mediada photoactivation é uma nova abordagem para remotamente controle bioeffectors com muito menos fototoxicidade e com penetração mais profunda do tecido. No entanto, a instrumentação existente no mercado não é prontamente compatível com aplicação de upconversion. Portanto, modificar o instrumento comercialmente disponível é essencial para esta pesquisa. Neste trabalho, nós primeiro ilustram as modificações de um fluorímetro convencional e o microscópio de fluorescência para torná-los compatíveis para experimentos de upconversion de fóton. Em seguida, descrevemos a síntese de um infravermelho próximo (NIR)-desencadeada enjaulado proteína quinase A catalítica subunidade (PKA) imobilizada em um complexo UCNP. Parâmetros para microinjeção e NIR photoactivation procedimentos também são relatados. Depois que o PKA-UCNP enjaulado é injetada em células de fibroblastos REF52, a irradiação de NIR, que é significativamente superior ao convencional irradiação UV, dispara eficientemente via PKA de transdução de sinal em células vivas. Além disso, experimentos de controle positivos e negativos confirmar que o pathway induzida por PKA levando à desintegração de fibras de estresse especificamente é desencadeado por irradiação de NIR. Assim, o uso de proteínas modificadas UCNP fornece uma abordagem inovadora para controlar remotamente a luz modulada experimentos celulares, no qual deve-se evitar a exposição directa à luz UV.
Proteínas quimicamente modificadas que podem ser fotoativados (por exemplo, as proteínas PKA enjaulado) foram desenvolvidas como um campo emergente na biologia química de forma não-invasiva, manipular processos bioquímicos intercelulares1,2 ,3. Usando a luz como um estímulo oferece excelente resolução spatiotemporal quando activar estas enjaulado proteínas. No entanto, a luz UV pode causar alterações morfológicas indesejáveis, apoptose e dano ao DNA de células4,5. Daí, desenvolvimentos recentes na concepção ....
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Nota: O protocolo descreve uma modificação de instrumentação detalhada para photoactivation upconversion assistida, um procedimento sintético para gerar enjaulado PKA-UCNP, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) do UCNP de sílica-revestido e enjaulado amostras de PKA-UCNP, UV e NIR instalação de fotólise, preparação da pilha, microinjeção de PKA-UCNP, um estudo de fotoativação e a coloração de fibra de stress das células REF52.
1. fluorímetro instalação para medição do espectro Upconversion
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O projeto de construção de gaiolas enzima-UCNP é ilustrado na Figura 1. A enzima PKA foi primeiro reagiu com brometo de 2-nitrobenzil para gerar um PKA enjaulado inativo, e então estava eletrostaticamente imobilizado na superfície de UCNP. UCNPs emitem a luz de upconverted e consequentemente photolytically cleave os grupos ó-nitrobenzil em 199 Cys e 343 Cys, gerando o PKA registrado. TEM imagens e ensaio de Bradford confirmaram que o PKA e enjaulado PKA foram.......
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Anteriormente, Hofmann e colegas de trabalho encontraram que dramáticas mudanças morfológicas foram observadas em células REF52 após a microinjeção da enciclopédia PKA19. Em outro estudo, o grupo de Lawrence demonstrou que PKA enjaulado pode ser registrados na vivo, levando a alterações morfológicas e a desintegração de fibras de estresse quando submetido a UV fotólise20. Anteriores relatórios sobre explorando upconverted UV luz para photoactivation mostrou a ativa.......
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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecemos a Nano ciência e tecnologia programa de Academia Sinica e o Ministério da ciência e tecnologia de Taiwan de financiamento (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente | |||
| Tris(hidroximetil)aminometano | Sigma | 154563 | |
| Cloreto de magnésio hexahidratado | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Cloreto de sódio | Sigma | 31434 | |
| Cloreto de potássio | Sigma | 12636 | |
| Acetato de ítrio hidrato | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Acetato de túlio(III) hidrato | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Acetato de itérbio(III) tetrahidratado | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadeceno | Sigma | O806 | |
| Ácido oleico | Sigma | 364525 | |
| Metanol | macron | 304168 | |
| Hidróxido de sódio | Sigma | 30620 | |
| Fluoreto de amônio | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Ciclohexano | J.T.Baker | 920601 | |
| Hidróxido de amônio (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | |
| Amônia Tetraetil ortosilicato (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Ditiotreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hidroximaleimida (NHM) | Sigma | 226351 | PKA reagente bloqueador |
| de atividade Solução estabilizadora de proteína Prionex de colágeno de porco | Sigma | 81662 | Solução estabilizadora |
| de proteína brometo de 2-nitrobenzila (NBB) | Sigma | 107794 | PKA reagente de enjaulamento |
| 8-(4-clorofeniltio)adenosina 3′,5′-sal de sódio monofosfato cíclico | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Piruvato Quinase / Desidrogenase Láctica enzimas do músculo de coelho | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosina 5'-trifosfato dissódico | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduzido de dipotássico | Sigma | N4505 | |
| Fosfoenolpiruvato | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Reagente de ensaio de proteína, 950 mL | Reagente de ensaio Thermo Scientific | 23200 | Bradford |
| Proteína quinase dependente de cAMP | Promega | V5161 | Controle de atividade PKA |
| plasmídeo pET15b-PKACAT | Addgene | #14921 | |
| plasmídeo pKaede-MC1 | CoralHue | AM-V0012 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, glicose alta, piruvato | Célula Gibco | 12800-017 | meio de cultura |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Meio de cultura |
| Fetal Bovine Serum Biological | Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldeído | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Corante de coloração de núcleo |
| Alexa 594-faloidina | Invitrogen | A12381 | Corante para coloração de F-actina |
| 5(6)-Carboxitetrametilrodamina | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Kit de Ensaio | de Proteína Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubulações/Classificação nominal do filtro MWCO 12.000 - 14.000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 Unidade de | |
| Filtro de Seringa Millex-HV de Membrana de Diálise, 0.45 µ m, PVDF, 13 mm, esterilizado por gama | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Microscópio Eletrônico de Transmissão | JEOL | JEM-1400 | |
| Espectrofotômetro de Fluorescência | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| Espectrofotômetro UV-Vis | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Microscópio de Fluorescência | Olympus | IX-71 | |
| Filtro longpass de 950 nm | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm espelho dicróico shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 sistema CCD colorido | SPOT | RT2520 | |
| Iluminação de fluorescência | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Laser de diodo infravermelho | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Fonte de luz | UVATA | UVATA-UPS412 | Com um LED UPH-056-365 nm a 200 mW/cm2 |
| Sensor térmico de pilha | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Sistemas de Distribuição de Microinjeção |
| Intracelular PC-10 Extrator de agulhas | Narishige | PC-10 | |
| MANÔMETRO MANÔMETRO digital | Lutron | PM-9100 | |
| Um eixo Centrifugador hidráulico do fresco | Narishige | MMO-220A | |
| , refrigerado | Thermo científico | 75002421 |
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