Strukturer av supramolecular protein samlinger atomic oppløsningen er høy relevans sin avgjørende rolle i en rekke biologiske fenomener. Her presenterer vi en protokoll for å utføre høyoppløselig strukturelle studier uløselig og ikke-krystallinske macromolecular protein samlinger av magi-vinkel spinning SSD kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi (MAS SSNMR).
Supramolecular protein samlinger spille grunnleggende roller i biologiske prosesser fra verten-patogen interaksjon, virusinfeksjon til utbredelsen av nevrodegenerative lidelser. Slike samlinger består i flere protein underenheter organisert i en ikke-kovalente måte å danne store macromolecular objekter som kan utføre en rekke cellulære funksjoner eller forårsake ødeleggende konsekvenser. Atomic innsikt i samlingen mekanismer og funksjon av de macromolecular samlingene fortsatt ofte mangelvare siden deres iboende insolubility og ikke-crystallinity ofte drastisk reduserer kvaliteten på dataene innhentet fra de fleste teknikker brukt i strukturell biologi, som Røntgenkrystallografi og løsning kjernefysiske magnetisk resonans (NRM). Her presenterer vi magic-vinkel spinning SSD NMR spektroskopi (SSNMR) som en kraftfull metode å undersøke strukturer i macromolecular samlinger atomic oppløsning. SSNMR kan avsløre Atom detaljer om samlet komplekset uten størrelse og løselighet begrensninger. Protokollen presenteres her beskriver de grunnleggende trinnene produksjon av 13C /15N isotop-merket macromolecular protein samlinger til anskaffelsen av standard SSNMR spectra og analyse og fortolkning. Som et eksempel viser vi en SSNMR strukturell analyse av en trådformede protein forsamling pipeline.
Fremskritt innen magi-vinkel spinning SSD kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi (SSNMR) tilbyr et effektivt verktøy for strukturelle karakterisering av macromolecular protein samlinger på en atomic oppløsning. Disse protein samlinger er allestedsnærværende systemer som spiller viktige roller i mange biologiske prosesser. Deres molekylære strukturer og interaksjoner dynamics er tilgjengelige for SSNMR studier, som har vært vist viral (capsids1) og bakteriell infeksjon mekanismer (sekresjon systemer2,3, pili4), membran protein komplekser5,6,7,8 og funksjonelle amyloids 9,10,11. Denne typen molekylær forsamlingen kan også vil provosere patologi som i nevrodegenerative sykdommer der proteiner sammen i misfolded, amyloid stater og forårsake avvikende celle atferd eller celle død 12,13. Protein samlinger er ofte bygget av den symmetriske oligomerization multipler eksemplarer av protein underenheter i store supramolecular objekter av ulike figurer inkludert fibrils, filamenter, porer, rør eller nanopartikler. Kvartær arkitekturen er definert av svake interaksjoner mellom protein tenkes å organisere samlingen romlige og tidsmessige og tillate sofistikert biologiske funksjoner. Strukturelle undersøkelser på en atomic skala på disse forsamlinger er en utfordring for høyoppløselig teknikker siden deres iboende insolubility og svært ofte deres ikke-crystallinity begrenser bruken av konvensjonelle Røntgenkrystallografi eller løsning NMR tilnærminger. Magic-vinkel spinning (MAS) SSNMR er en ny teknikk å anskaffe atomic oppløsning på uløselig macromolecular samlinger og har bevist sin effektivitet å løse 3D atomic modeller for et økende antall komplekse biomolecular systemer inkludert bakteriell filamenter, amyloid samlinger og virus partikler 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Tekniske fremskritt på høy magnetfelt, metodisk utviklingen og prøve forberedelser har etablert MAS SSNMR i en robust metode å undersøke uløselig proteiner i ulike miljøer, spesielt i deres biologisk relevante macromolecular samlet stat eller i mobilnettet membraner, gjør teknikken svært utfyllende til cryo-elektronmikroskop. I mange tilfeller er karakteriserer en svært høy grad av symmetri slik protein samlinger. MAS SSNMR utnytter denne funksjonen, som alle protein underenheter i en homomolecular samling ville ha den samme lokale strukturen og derfor nesten samme SSNMR signatur, drastisk redusere kompleksiteten i analysen.
En effektiv protokoll for strukturelle studier av macromolecular protein samlinger av moderate MAS (< 25 kHz) SSNMR presenteres i denne videoen og kan deles inn i ulike trinn (figur 1). Vi vil vise de kritiske stadiene av arbeidsflyten en SSNMR strukturelle studie eksemplifiseres på en trådformede protein forsamling (se uthevet meter i figur 1), med unntak av protein delenhet rensing, ulik for hver protein montering men av kritisk betydning for strukturelle studier, og uten å gå inn i tekniske/metodologiske detaljer om SSNMR spektroskopi og struktur beregning for hva spesialiserte guider er tilgjengelig online. Mens den nåværende protokollen primært fokusere på SSD NMR eksperimenter utført under MAS forhold, justert bruk av biologiske miljøer 23,24,25,26 , 27, som justerte bicelles, tillate etterforskningen av protein konformasjon og dynamisk protein-protein samhandling i membranen som media uten MAS teknologi. Vi vil vise protein uttrykk og montering trinn, samt opptak av de avgjørende SSNMR spectra og analyse og fortolkning. Vårt mål er å gi innsikt i rørledningen strukturelle analysen slik at leseren å utføre en atomic oppløsning strukturelle studie av en macromolecular samling av SSNMR teknikker.
Protokollen omfatter 3 deler:
1. SSD NMR eksempel produksjon
Som en forutsetning for en SSD NMR analyse, protein komponenter av macromolecular montering måtte uttrykkes, isotop-merket, renset og montert i vitro i native-lignende komplekse staten (for en eksempel se figur 2) . For å sikre høy NMR følsomhet, er isotop anriking i 13C og 15N merking nødvendig ved bruk av minimal bakteriell expression media med 13C og 15N kilder, for eksempel jevnt 13 C-merket glukose/glyserol og 15NH4Cl henholdsvis. Senere stadium av protokollen, selektivt 13C-merket prøver produsert med selektivt 13C-merket kilder som (1,3 –13C)- og (2 –13C)-glyserol (eller (1 –13C)- og (2 –13C)- glukose) brukes til å forenkle NMR analysen. Blandet merket sample tilsvarer en ekvimolare blanding av 50% 15N- og 50% 13C-merket eller 50% (1,3 –13C)- og 50% (2 –13C)-glukose er innført for å beskrive påvisning av intermolekylære interaksjoner. En høy grad av protein renhet samt strenge vilkår under montering trinn er viktige faktorer for å sikre en homogen strukturelle for siste prøven.
2. foreløpige strukturelle karakterisering basert på endimensjonal (1D) SSD NMR
Vi presenterer viktige eksperimenter for en strukturell analyse av SSNMR. Endimensjonal (1D) kryss-polarisering (CP) og INEPT / RINEPT28 eksperimenter, oppdaget på 13C kjerner brukes til å oppdage rigid og fleksibel protein segmenter i forsamlingen, henholdsvis, og til å beregne graden av strukturelle homogenitet og lokale polymorfisme (for en eksempel se Figur 3).
Rong > 3. Conformational analyse og 3D struktur besluttsomhet
Underpunktene 1 og 2 bekymring conformational analysen, som er basert på SSNMR resonans tildelingen av alle stive rester av protein forsamlingen, som kjemisk Skift er svært følsomme sonder til det lokale miljøet og kan brukes til å forutsi phi/psi dihedral vinkler og bestemme dermed sekundære strukturen. Figur 4 illustrerer et eksempel på en sekvensiell resonans tildeling i stive kjernen av en protein forsamling. Den 3D proteinstrukturer er basert på innsamling av strukturelle data som avstanden begrensninger koding lukke proximities (< 7-9 Å), som inneholder både intra- og intermolekylære informasjon. Avsnitt 3 og 4 beskriver langtrekkende fjernt tilbakeholdenhet innsamling og tolkning. Langtrekkende kontakter defineres som intramolekylære 13C –13C proximities som oppstår fra rester jeg til j, med | jeg-j | ≥4, definere dermed tertiær protein fold av den monomerisk delenhet eller intermolekylære 13C –13C proximities, definere de intermolekylære grensesnittene mellom protein underenheter i forsamlingen. Intra- og intermolekylære grensesnitt er illustrert i figur 5. SSNMR begrensninger oppdaget gjennom 13C –13C og 15N –13C recoupling eksperimenter vanligvis kode for internuclear avstander < 1 nm. Ledd 4 forklarer påvisning av intermolekylære avstanden begrensninger. I symmetrisk protein samlinger, bruk av homogent merket prøver (i.e. 100% jevnt eller selektivt merket) for identifisere intermolekylære delenhet-delenhet interaksjoner er begrenset, som begge intra – og inter – molecular kontakter føre til synlig signaler. Entydig påvisning av intermolekylære proximities oppnås ved å bruke blandet merket prøver, som inneholder en ekvimolare blanding av to annerledes merket prøver, kombinert før aggregering. Avsnittet 5 kort introduserer struktur modellering.
Figur 1 : Arbeidsflyten en atomic oppløsning strukturelle studie av solid-state NMR. 13 C, 15N isotop merket protein produksjon, delenhet rensing, delenhet samlingen, kontroll av montering formasjon, SSNMR eksperimenter, SSNMR eksperiment analyse og utvinning av avstanden begrensninger og struktur modellering vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
SSD NMR (SSNMR) er en metode for valg for å karakterisere macromolecular protein samlinger på en Atom-nivå. En av de sentrale spørsmålene i SSNMR-baserte proteinstrukturer er spectral kvaliteten på undersøkte systemet, som tillater å etablere 3D strukturelle modeller av ulike presisjon, vanligvis varierer fra lav oppløsning modeller (som inneholder sekundære strukturere elementer og litt 3D-informasjon) pseudo atomic 3D strukturer. Kvantitet og kvalitet av strukturell informasjon fra flerdimensjonal SSNMR eksperimenter er nøkkelen til å beregne en høyoppløselig NMR strukturen i forsamlingen.
Beskrevet protokollen er avhengig av gjenkjenning av 13C –13C og 15N –13C strukturelle begrensninger som krever innspillingen av flere 2D (og noen ganger 3D) spectra med høy signal-til-støy. På moderat MAS frekvenser (< 25 kHz), prøven er introdusert i rotorer med størrelser med 3.2-4 mm diameter slik at protein mengder opp til ~ 50 mg, avhengig av prøven hydrering. Mengden sample inne rotoren er direkte proporsjonal med signal-til-støy forholdet i SSNMR spectra, en avgjørende faktor for påvisning av langtrekkende avstanden begrensninger og entydig oppdrag.
Spectral oppløsningen er en viktig parameter under sekvensiell resonans tildelingen og samlingen begrensninger. For å oppnå optimale resultater, må prøve forberedelse parametrene være optimalisert, spesielt i rensing av delenhet og montering forhold (pH, buffer, riste, temperatur, etc.). For eksempel optimalisering anbefales det å forberede umerkede prøver for flere forskjellige forhold som forsamlingen har blitt observert og registrere en 1D 1H13C CP spektrum (beskrevet i trinn 2.1) på hver forberedt utvalg. Til spectra tjene til å sammenligne spectral oppløsning og spredning mellom de forskjellige preparater, basert på optimale forhold kan bestemmes.
Kvaliteten på SSNMR data avhenger sterkt valg av NMR oppkjøpet parametrene spesielt for polarisering overføring trinnene. Bruk av høy magnetisk feltstyrken (≥600 MHz 1H frekvens) er avgjørende for høy følsomhet og spectral oppløsning, når overfor komplekse mål som macromolecular protein samlinger.
En begrensende faktor i mange tilfeller er spectrometer tilgjengeligheten. Derfor bør en forstandig valg av prøvene å være forberedt før spectrometer økten. I alle fall, jevnt 13C, 15N-merket prøven er en forutsetning for å utføre sekvensielle og intra gjenværende resonans tildelingen. Se71proteiner av solid-state NMR teknikker. Proteinstrukturer i macromolecular samlinger på moderat MAS frekvenser krever selektivt 13C-merket prøver; for deteksjon av langtrekkende 13C –13C og 13C –15N kontakter eksempler basert på 1,3 –13C- og 2 –13C-gylcerol og/eller 1 –13C- og 2 –13C-glukose merking er brukte, som beskrevet ovenfor. Valget mellom to merking ordninger er basert på spectral signal-til-støy-forhold og oppløsning. Du kan skille mellom intra- og intermolekylære langtrekkende kontakter, har blandet med og fortynnede prøver avdekket effektiv.
Kort sagt, kritisk fremgangsmåten for en Atom SSNMR strukturelle studie er: (i) utarbeidelsen av underenheter og montering måtte være optimalisert å få utmerket eksempel kvantitet og kvalitet, (ii) spectrometer feltet styrke og oppkjøp parametere må være valgt nøye. (iii) selektiv merking strategier er nødvendig for en 3D-struktur besluttsomhet og mengden data som kreves, avhenger av datakvaliteten og tilgjengeligheten av utfyllende data.
Til tross for dens anvendelighet til et bredt spekter av supramolecular mellom membran proteiner homomultimeric nano-objekter, er SSNMR ofte begrenset av behovet for mg-mengder isotopically merket materiale. Den siste teknologiske utviklingen i ultra-rask MAS (≥100 kHz) SSNMR åpne avenyen til 1H-oppdaget NMR, og presse grensen på antall minimal prøve å sub-mg 72,73,74. Likevel for detaljert strukturelle studier er 13C-merket prøver uunnværlig, som begrenser anvendelsen av SSNMR prøver samlet i vitro eller systemer i organismer som overlever på minimal medium der i celler SSNMR er en ny metode (for anmeldelser se 75,76,77,78).
En viktig faktor i SSNMR program å få høyoppløselig 3D strukturer er spectral oppløsning: iboende conformational heterogenitet i en samling kan begrense spektral oppløsning og spectra analyse. Rester bestemt 13C merking kan i noen tilfeller gir en alternativ for å få bestemt avstandsinformasjon om strategiske rester for å få strukturelle modeller (for en nyere eksempler se 79,80).
SSNMR for 3D proteinstrukturer krever fortsatt samlingen av flere datasett med ofte lenge data samling ganger på sofistikerte instrumenter, avhengig av tilnærming og systemet flere dager til uker på en 600-1000 MHz (1H frekvens) Spectrometer. Tilgang til spectrometer tid kan derfor være en begrensende faktor i en fordypning i SSNMR.
I homomultimeric protein samlinger, fører til SSNMR data av tilstrekkelig kvalitet å identifisere et høyt antall strukturelle begrensninger som i 3,57,64,70, SSNMR likevel gir ikke tilgang til mikroskopiske dimensjoner. Derfor, i en de novo SSNMR struktur bestemmelse av en homomultimeric forsamling, EM eller masse-per-lengde (MPL) data ideelt utfyller SSNMR data for å utlede parameterne symmetri. SSNMR data alene gi atomic intra- og intermolekylære grensesnitt
SSNMR er svært utfyllende med strukturelle teknikker som EM eller MPL målinger, men dataene kan også kombineres med Atom strukturer innhentet av Røntgenkrystallografi eller løsning NMR på mutert eller avkortet underenheter. Et økende antall studier finner i litteratur der sammen med ulike strukturelle data har tillatt for å bestemme atomic 3D-modeller av macromolecular samlinger (se figur 6 for representative eksempler).
I feltet av strukturell biologi fremstår SSNMR som lovende teknikk for å studereuløselig og ikke-krystallinske samlinger på atomic nivå, dvs gir strukturelle data på atomic skalaen. I denne forbindelse er SSNMR anheng løsning NMR og Røntgenkrystallografi for molekylær samlinger, inkludert membran proteiner i deres eget miljø og protein samlinger som viral konvolutter, bakteriell filamenter eller amyloids, samt RNA og RNA-protein komplekser (se for eksempel81). Den allsidige programmer i vitro og i mobilnettet sammenheng, for eksempel sekundær, tertiær og kvartær strukturelle endringer, identifisere samhandling overflater med partner molekyler på atomic skala (for eksempel 82) og kartlegging molekylære dynamikk i sammenheng med sammensatte komplekser, vise viktig potensialet av SSNMR i fremtidige strukturelle studier på komplekse biomolecular samlinger.
Komponent | M9 medium |
NaCl | 0,5 g/L |
KH2PO4 | 3 g/L |
Na2HPO4 | 6,7 finans |
MgSO4 | 1 mM |
ZnCl2 | 10 ΜM |
FeCl3 | 1 ΜM |
CaCl2 | 100 ΜM |
MEM vitamin mix 100 X | 10 mL/L |
13 C-glukose | 2 g/L |
15 NH4Cl | 1 g/L |
Tabell 1: Sammensetningen av minimal uttrykk medium for rekombinante proteiner produksjon i E. coli BL21 celler.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er finansiert av ANR (13-PDOC-0017-01 B.H. og ANR-14-CE09-0020-01 til Al), “Investeringer for fremtiden” program IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 til B.H.) referanse ANR-10-IDEX-03-02 til B.H., Fondation pour la Recherche () Médicale FRM-AJE20140630090 til Al), FP7 programmet (FP7-folk-2013-CIG til Al) og europeiske Research Council (ERC) under EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet (ERC starter Grant til Al, avtalen ingen 639020) og ” WEAKINTERACT.”
Instruments | |||
NMR Spectrometer (> 11.7 Tesla) | Bruker | – | |
triple resonance MAS SSNMR probehead | Bruker | – | |
SSNMR rotors 4mm | Bruker | K1910 | |
Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5805000629 | |
GeneQuant 1300 spectrometer | Dutscher | 28-9182-13 | |
IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L | Dutscher | 228001 | |
MaxQ 4450 bench top orbital shaker | Dutscher | 78376 | |
Tube Revolver Agitator | Dutscher | 79547 | |
sonopuls HD 3100 | Bandelin | 3680 | |
MicroPulser electroporator | Biorad | 165-2100 | |
mini-PROTEAN tetra cell system | Biorad | 165-8000 | |
AKTA pure system | GE Healthcare | 29-0182-24 | |
capillary microman M25 pipet | Gilson | F148502 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
amiconR ultra-15 | sigma | Z740199-8EA | |
capillaries and pistons | Gilson | F148112 | |
spatula | Fisher | 13263799 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
D-glucose 13C6 | Sigma | 389374 | |
Ammonium-15N-chloride | Sigma | 299251 | |
1,3 13C2 glycerol | Sigma | 492639 | |
2 13C glycerol | Sigma | 489484 | |
Kanamycin | Sigma | K1876 | |
Carbenicillin | Sigma | C3416 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S7907 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | |
Sodium chloride | Sigma | 71380 | |
calcium chloride | Sigma | C1016 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 208094 | |
Iron Chloride | Sigma | 157740 | |
Zinc chloride | Sigma | 793523 | |
MEM Vitamin Solution (100×) | Sigma | M68954 | |
IPTG | Fisher | BP1755 | |
Trizma base | Sigma | T1503 | |
Tricine | Sigma | T0377 | |
SDS | Sigma | 436143 | |
sodium azide | sigma | 71289 | |
4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid | Sigma | 178837 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Softwares | |||
Unicorn 6.3 | GE Healthcare | Akta systems | |
ccpNMR | CCPN | spectrometer systems |