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利用固态核磁共振波谱法对大分子组装体进行原子尺度结构研究

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DOI：

10.3791/55779

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2017年9月17日

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1Institute of Chemistry, Biology of Membranes, Nanoobjects, UMR5248 CNRS, Université de Bordeaux

本文内容

摘要

原子分辨率下的超分子蛋白质组装体结构因其在多种生物现象中发挥的关键作用而具有重要意义。本文介绍了一种利用魔角旋转固体核磁共振波谱技术（MAS SSNMR）对不溶性且非晶态的大分子蛋白质组装体进行高分辨率结构研究的实验方案。

摘要

超分子蛋白质组装体在从宿主-病原体相互作用、病毒感染到神经退行性疾病传播等多种生物学过程中发挥着基础性作用。这些组装体由多个蛋白质亚基通过非共价方式有序组织而成，形成能够执行多种细胞功能或导致有害后果的大分子结构。由于这类大分子组装体本身具有不溶性和非晶态特性，通常会显著降低结构生物学常用技术（如X射线晶体学和溶液核磁共振（NMR））所获得数据的质量，因此对其组装机制及功能的原子级认识往往十分有限。本文介绍魔角旋转固体核磁共振波谱技术（SSNMR）作为一种在原子分辨率下研究大分子组装体结构的有力方法。SSNMR能够在无尺寸和溶解度限制的情况下揭示组装复合物的原子细节。本文所述方案涵盖了从制备13C/15N同位素标记的大分子蛋白质组装体，到标准SSNMR谱图的采集及其分析与解释等关键步骤。作为示例，我们展示了对一种丝状蛋白质组装体进行SSNMR结构分析的完整流程。

引言

魔角旋转固体核磁共振波谱技术（SSNMR）的进步为在原子分辨率下表征大分子蛋白质组装体的结构提供了高效工具。这些蛋白质组装体是普遍存在的系统，在多种生物学过程中发挥着关键作用。通过SSNMR研究，可以获取其分子结构、相互作用及动力学信息，已有研究成功应用于病毒（衣壳1）和细菌感染机制（分泌系统2,3、菌毛4）、膜蛋白复合物5,6,7,8以及功能性淀粉样蛋白9,10,11。此类分子组装体也可能引发病理状态，例如在神经退行性疾病中，蛋白质错误折叠并组装成淀粉样状态，导致细胞功能异常或细胞死亡12,13。蛋白质组装体通常由多个相同亚基通过对称寡聚化形成具有各种形状的大型超分子结构，包括纤维、丝状体、孔道、管状结构或纳米颗粒。其四级结构由蛋白质亚基之间的弱相互作用所决定，以调控其空间和时间上的组装过程，并实现复杂的生物学功能。由于这些组装体本质上不溶，且通常不具备结晶性，限制了传统X射线晶体学或溶液核磁共振方法的应用，因此在原子尺度上对其进行结构研究对高分辨率技术而言仍具挑战性。魔角旋转（MAS）固体核磁共振是一种新兴技术，可在不溶性大分子组装体上获得原子分辨率数据，并已成功解析出越来越多复杂生物分子系统的三维原子模型，包括细菌丝状体、淀粉样组装体和病毒颗粒14,15,16,17,18,19,20,21,22。高磁场技术的进步、方法学的发展以及样品制备的优化，使MAS SSNMR成为研究各种环境下不溶性蛋白质的可靠方法，尤其是在具有生物学相关性的大分子组装状态或细胞膜环境中，该技术与冷冻电子显微镜高度互补。在许多情况下，这类蛋白质组装体表现出高度对称性。MAS SSNMR可利用这一特性，因为在同源分子组装体中，所有蛋白质亚基具有相同的局部结构，因而几乎呈现相同的SSNMR谱图特征，从而显著降低分析复杂度。

本视频介绍了一种利用中等魔角旋转（MAS，<25 kHz）固态核磁共振（SSNMR）对大分子蛋白复合物进行结构研究的高效方案，该方案可分为多个步骤（图1）。我们将以一种丝状蛋白复合物为例，展示SSNMR结构研究工作流程中的关键阶段（参见图1中高亮的步骤），但不包括每种蛋白复合物各不相同的蛋白亚基纯化步骤——该步骤对结构研究至关重要——同时也不深入介绍SSNMR波谱技术和结构计算方面的技术/方法细节，相关专题的在线教程已有详述。尽管本方案主要聚焦于在MAS条件下进行的固态核磁共振实验，但使用取向排列的生物环境（如取向双层磁小体）23,24,25,26,27，可在无需MAS技术的情况下研究膜类似介质中蛋白质的构象及其动态蛋白-蛋白相互作用。我们将展示蛋白质表达与组装步骤，以及关键SSNMR谱图的采集、分析与解读。我们的目标是使读者深入了解结构分析流程，从而能够利用SSNMR技术对大分子复合物开展原子分辨率的结构研究。

该方案包含3个部分：

1. 固体核磁共振样品制备

在进行固态核磁共振分析之前，需要对大分子组装体中的蛋白质组分进行表达、同位素标记、纯化和组装 体外 进入类似天然的复合物状态（示例见 图2）。为了确保高核磁共振（NMR）灵敏度，需进行同位素富集 13C 和 15需通过使用添加了N标记的最小细菌表达培养基来实现标记 13C 和 15N 个来源，例如均匀的 13C标记的葡萄糖/甘油和 15NH4Cl 分别。在方案的后期阶段，选择性地 13选择性标记的C-标记样品 13C标记的来源，例如（1,3-13C）和（2-13C)-甘油（或(1-13C）和（2-13C)-葡萄糖）用于促进核磁共振（NMR）分析。混合标记样品对应于等摩尔混合物，其中含有50% 15N- 和 50% 13C标记的或50%（1,3-13C）和 50%（2-13C-葡萄糖用于描述分子间相互作用的检测。蛋白质的高纯度以及组装步骤中的严格条件是确保最终样品具有均一结构秩序的关键因素。

2. 基于一维（1D）固态核磁共振的初步结构表征

我们介绍了通过固态核磁共振（SSNMR）进行结构分析所需的关键实验。采用检测13C核的一维（1D）交叉极化（CP）实验和INEPT/RINEPT28实验，分别用于检测组装体中刚性与柔性蛋白质片段，并评估结构均一性及局部多态性的程度（示例见图3）。

3. 构象分析与三维结构测定

第1和第2小节涉及构象分析，该分析基于蛋白质组装中所有刚性残基的固态核磁共振（SSNMR）化学位移指认，因为化学位移对局部环境极为敏感，可用于预测φ/ψ二面角，从而确定二级结构。 图4 展示了蛋白质组装体刚性核心中连续共振指认的一个示例. 三维结构测定基于收集结构数据，例如编码近距离的空间距离限制<7 - 9 Å），包含分子内和分子间的信息。第3和第4小节描述长程距离限制的收集与解析。长程接触定义为分子内 13C-13由残基 i 到 j 且 |i-j| ≥ 4 所形成的近端相互作用，由此定义单体亚基的三级蛋白质折叠，或作为分子间作用 13C-13C 近端，定义了组装过程中蛋白质亚基之间的分子间界面。分子内和分子间界面如图所示。 图5. 通过SSNMR测得的约束条件 13C-13C 和 15N-13C再耦合实验通常用于编码核间距离 < 1 nm。第4小节解释了分子间距离限制的检测。在对称性蛋白质组装体中，使用均匀标记的样品（即 100% 均一或选择性标记）在鉴定分子间亚基-亚基相互作用方面存在局限性，因为分子内和分子间的接触均会产生可检测信号。通过使用混合标记样品可明确检测分子间接近性，该样品在聚集前混合等摩尔的两种不同标记样品。第5小节简要介绍结构建模。

标记的蛋白质表达、体外组装、固态核磁共振；蛋白质结构分析示意图。
图1： 通过固态核磁共振进行原子级分辨率结构研究的工作流程。13C、15N同位素标记的蛋白质制备，亚基纯化，亚基组装，组装体形成的控制，固态核磁共振（SSNMR）实验，SSNMR实验数据分析及距离约束的提取，以及结构建模均在图中展示。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 固体核磁共振样品制备a

  1. 均匀制备 13C/ 15N标记的蛋白质亚基
    1. 使用新近转化的、含有 pET24-peptide-6his 质粒的 E. coli 从制备好的琼脂平板上挑取 BL21 (DE3) 菌株
    2. 接种一个菌落至15 mL预热的LB培养基中进行预培养。37 °C培养 37 °C 以200 rpm振荡过夜。
    3. 将预培养物转移至1 L预热的M9主培养基中（培养基成分见 表1)，包含所需的同位素标记的碳源和氮源。
      注意：这可以均匀地 13C标记的葡萄糖，选择性（1-13C）或（2-13C-标记的葡萄糖 29,30,31 或 (1,3-13C）或（2-13C-标记的甘油32,33.
    4. 在此条件下孵育 37 °C 并测定OD值600 培养液一旦变浑浊即刻进行。当OD600 当其值达到0.8时，用0.75 mM IPTG诱导蛋白表达4小时。
      注意：最佳诱导条件可能因蛋白质不同而有所差异。
    5. 通过离心回收细胞，6000 x g 离心 30 分钟 4 °C.
  2. 纯化示意图 （视频方案中未展示）
    1. 使用超声处理或溶菌酶处理等标准方法裂解细胞，并采用针对所研究蛋白质复合物已建立或优化的方法纯化蛋白亚基。
      注意：该蛋白可能以包涵体形式表达，可通过细胞裂解及后续离心检测蛋白定位。若在细胞碎片沉淀中检测到该蛋白，则表明其已在包涵体中聚集。
    2. 通过标准的12-15% Tris-Tricine SDS-PAGE检测蛋白质样品的表达与纯度，参见 图2A如果纯度足够，可进行蛋白质组装；否则需进行额外的纯化步骤。
  3. 体外 蛋白丝的组装
    1. 检测纯化溶液中的蛋白浓度。如果蛋白含有吸光性残基，则使用紫外分光光度计在280 nm处测定吸光度。以纯缓冲液作为空白对照放入分光光度计进行校准，然后测定蛋白的吸光度。
    2. 使用蛋白质亚基的吸收系数，结合修正后的比尔-朗伯定律计算蛋白质浓度：Aλ=ελ x l x c；其中 A 为在给定波长 λ 处的光密度；ε 为摩尔吸光系数；l 为光程长度，单位为 cm；c 为浓度，单位为 mol/L。
    3. 将蛋白浓缩至1 mM浓度，使用离心过滤装置。将样品加入离心过滤装置中，在4000 × g条件下离心30分钟，用移液器轻轻混匀滤膜内的溶液，避免蛋白在滤膜上沉积。重复该步骤直至达到目标浓度。
      注意：最佳组装浓度取决于具体体系，需进行优化（通常在 0.1 - 1 mM 之间）。若制备了两个不同标记蛋白批次的等摩尔混合标记样品（例如 (50/50) (U-15N)-/(U-13C-标记）的混合必须在浓缩步骤之前或紧随其后立即进行，以确保混合溶液的均一性。
    4. 将样品转移至离心管中，在室温下振荡孵育一周。
    5. 通常，亚基聚合形成纤维的过程会伴随溶液变浑浊。可通过电子显微镜（放大倍数6300X - 45000X）检查纤维的微观形态及均一性，参见 图2B.
    6. 将样品在 20000 x g 条件下离心 1 h 4 °C. 吸除大部分上清液，仅保留足以覆盖表面的液体以避免样品干燥。使用紫外分光光度计检测上清液中是否存在未组装的亚基。
    7. 加入 H 洗涤样品2O，并用移液器小心重悬内容物。切勿涡旋。在22000 × g下离心样品30分钟，并 4 °C重复洗涤步骤3次。每次洗涤步骤中，离心后检查沉淀是否保持其原有形态，并使用紫外分光光度计检测上清液中是否存在未组装的亚基。
    8. 加入0.02%（w/v）叠氮化钠（NaN₃）3以避免细菌污染，并将样本保存至测量前 4 °C.
  4. 固态核磁共振转子装填
    1. 以 22000 × g 离心两次，每次 30 分钟 4 °C尽可能移除上清液；所得样品的性状取决于蛋白质组装情况，通常为凝胶状沉淀。
    2. 使用毛细移液管将样品装入SSNMR转子中。
      注意：此处展示的是在直径为4 mm的转子上进行的操作步骤。
      1. 在台式离心机上离心转子，以轻柔地将样品加入转子中。重复该操作直至转子充满。保留最小必要空间以便用转子盖封闭转子。若样品量不足，可加入市售的填充插件以填满剩余空间，确保转子内样品分布的均匀性。
        注意：根据所制备样品的一致性，使用较细的刮刀可能更为合适，尤其适用于非常致密的样品。在中等魔角旋转（MAS）频率下，采用直径为2.5至4 mm的转子。
    3. 加入少量4,4-二甲基-4-硅代戊烷-1-磺酸（DSS）作为内标，用于化学位移和温度校准。
    4. 使用闭合装置盖紧盖子。
    5. 在放大镜下检查帽盖是否已正确插入并完全闭合。

SDS-PAGE 凝胶电泳、蛋白质条带、纤维的电镜图像，0.5 µm 比例尺。
图 2：蛋白质亚基纯化与组装的代表性结果。A) 蛋白质亚基（含 His6-标签）在不同纯化阶段的 15% Tris-三羟甲基氨基甲烷 SDS-PAGE 分析。第 1 泳道：蛋白质分子量标记物；第 2 泳道：E. coli BL21 (DE3) 细胞未诱导对照；第 3 泳道：E. coli BL21 (DE3) 细胞经 0.75 mM IPTG 诱导；第 4 泳道：溶解后的包涵体；第 5 泳道：细胞裂解液的上清组分；第 6 泳道：经镍固定化金属亲和层析（IMAC）FPLC 及脱盐后获得的纯化组分。B) 蛋白质纤维的负染透射电子显微镜（TEM）成像。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 基于一维（1D）固态核磁共振的初步结构表征

  1. 初始设置与一维交叉极化（CP）
    1. 将转子插入核磁共振磁体中
    2. 以5 kHz的频率启动转子旋转，待频率稳定在±10 Hz范围内后，逐步加速至7 kHz。调节并匹配 1H, 13C 和 15N 通道。将温度设置为 2-10 °C （275–283 K）；在7 kHz魔角旋转（MAS）条件下，样品加热效应较弱，通常无需在此MAS频率下进行温度调节。
    3. 记录单脉冲一维 1使用16次扫描获取氢谱。
      注意：必须事先在参考化合物（例如 13C/15N组氨酸或甘氨酸），用于为目标样品实验中的功率优化提供初始值；该步骤属于常规操作，因此不在本方案的范围内。
    4. 所有实验过程中温度保持在2-10 °C在水合样品中，温度反映为体相水的相对位移 1相对于DSS信号的氢核磁共振34. 根据关系式 δ(H2O) = 7.83 - T/96.9，精度为 1 - 2 °C35.
    5. 设定所需的 MAS 频率，并等待其稳定在 ±10 Hz 范围内。
      注意：此处以 11 kHz 的频率为例进行演示。
    6. 调节与匹配 1H 和 13C通道，再次借助1D调节温度 1H 实验。
    7. 建立一维模型 1H-13C CP36.
      注意：交叉极化（CP）实验显示的是处于刚性构象中的残基所产生的信号。当灵敏度足够高，使得在少于约32次扫描后即可观察到信号时，可在样品上直接优化脉冲校准和去耦参数。初始优化参数值来源于对参考化合物进行标准优化所得的结果。交叉极化接触时间与功率水平的选择依据为信号强度最大化。在蛋白质样品中，最佳交叉极化接触时间通常介于 200 µs 以及2毫秒。去耦参数还应根据参考化合物的校准结果重新调整。
      1. 仔细观察在给定魔角旋转（MAS）频率下旋转边带的化学位移位置。
    8. 记录参考一维谱 13C CP 谱图，可作为一维光谱指纹。典型参数为：128 次扫描，1 ms CP 接触时间，100 kHz 去耦强度，3 s 重循环延迟，以及 25 ms 采集时间。
    9. 校准 1H 和 13遵循IUPAC建议的碳化学位移37. 确定系统的共振频率 1氢DSS信号（化学位移为0 ppm）； 13C 化学位移以...为参照 1H化学位移（通常约为0.25144，由以下比值推导得出） 13C 到 1氢共振频率37).
    10. 处理一维 1H-13C CP实验未使用窗函数（参见 图3A 和 B 用于检测高度有序且均一的蛋白质组装体。选择一个孤立的峰来估算样品中的线宽，该参数可反映结构的有序性和均一性。典型的 13在高磁场下，具有良好有序结构的生物蛋白质组装体在魔角旋转（MAS）条件下的碳-13谱线宽度范围为20至150 Hz（以半高全宽（FWHH）测量）。
    11. 估算交叉极化（CP）谱中的信噪比（S/N）。
      注意：信噪比（S/N）受多种因素影响，主要包括转子中样品的量、蛋白质结构的刚性程度以及是否存在单一分子构象。经验上，若在优化的1D谱中能够观察到信号，则该样品通常适用于多维固态核磁共振（SSNMR）波谱分析。 1H-13C CP谱图，使用64次扫描记录。
    12. 放大蛋白质骨架羰基共振信号的谱图区域（主要位于 165–180 ppm 之间）。通过蛋白质骨架羰基共振峰的位置来估算组装体中的二级结构含量，其中处于 α-螺旋或 β-折叠构象的残基共振峰分别发生去屏蔽（向低场位移）或屏蔽（向高场位移）（参见 图3B 对于主要呈α-螺旋结构的亚基）38.
  2. 1D INEPT实验
    1. 建立一维实验装置 1H-13C INEPT 实验用于探测高度流动的部分（亚-µs蛋白质组装的）
      注意：采集期间 GARP 去耦频率为几千赫兹39 常用于实现较短的扫描间延迟（通常为1 s），且不会损坏探头。
    2. 记录一个作为可移动蛋白片段指纹的参考INEPT谱；典型参数为128次扫描和25 ms的采样时间。
    3. 处理 1H-13C INEPT 实验。信号的强度和位置分别反映了流动残基的数量和氨基酸组成。
      注意：还需记录一个二维图像 1H-13C INEPT 实验，如果在 1D INEPT 谱中存在信号（参见 图3C 例如，可进行更特异的氨基酸鉴定。在指认结果不明确的情况下，建议通过溶液核磁共振检测缓冲液组分的信号位置。
    4. 使用 BMRB 数据库40 以及已发表的数据38 将共振峰指派给接近无规卷曲构象的相应氨基酸；若无残基处于高度流动状态，则谱图中仅包含可移动的缓冲液组分。

显示碳-13分析时域和频域数据的核磁共振波谱图。
图3：结构良好蛋白质组装体的固体核磁共振（SSNMR）谱图采集代表性结果。A) 13C检测的1H-13C交叉极化实验自由感应衰减（FID）信号。B) 1H-13C交叉极化实验。C) 刚性蛋白质组装体的1H-13C INEPT实验；仅缓冲液组分可见。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 构象分析与三维结构测定

  1. 顺序共振指派
    1. 建立二维模型 13C-13C质子驱动的自旋扩散（PDSD）41 检测残基内相互作用的实验 13C-13C相关性，包括侧链。继承初始值的参数 1H-13C交叉极化步骤，来自1D 1H-13C CP 实验。
      1. 将混合时间设置为 50 ms，以实现均匀混合。 13C标记的样品以及选择性地延长至100毫秒 13C标记样品。根据固有光谱分辨率设置间接采集时间为5 - 25 ms，直接采集时间为15 - 25 ms，该分辨率可通过自由感应衰减（FID）长度中可见信号进行估计（示例如下） 图3A).
      2. 测试多个处理参数，以在谱图的信噪比和分辨率之间找到最优值。通常，使用 qsine 窗函数并设置正弦钟形偏移（SSB）为 2.5–4 时，可获得较为理想的处理效果。
    2. 设置、采集和处理二维数据 13C-13C PDSD 采用中间混合时间实验以检测序列 13C-13C 相关峰主要连接 i - i±1 残基，根据蛋白质主链的刚性和二级结构元件的不同，也可能连接 i±2 和 i±3 残基。对于均匀标记的样品，混合时间应设置在 100–200 ms 之间。其余参数可沿用短混合时间 2D 实验中的设置。 13C-13C PDSD
    3. 设置、采集和处理二维 15N-13C NiCAi 和 NiCOi 使用CP的实验 1H-15N 和一种特定的 CP 15N-13碳转移42. 优化 15N-13基于CA或羰基区域的最大信号强度，以一维方式直接在目标样品上实现碳的极化转移。典型的交叉极化（CP）接触时间通常在2-6毫秒之间。
    4. 设置、记录并处理一系列二维实验 15N-(13C-)13用于分配目的的 C 实验。
      注意：第一个 15N-13C 极化转移参数值可从 N 继承iCAi / NiCOi 实验。残基内相关性由 N 建立i（CAi)CBi 和 Ni（CAi)COi，分别使用 DREAM43 和PDSD 13C-13C 极化转移。残基 (i) 到残基 (i-1) 的序列连接性由 N 获得i(COi-1)CAi-1 和 Ni(COi-1)CXi-1 实验，均使用PDSD 13C-13C极化转移
    5. 选择一个核磁共振（NMR）分析程序，例如 CcpNmr analysis44 或 SPARKY45
    6. 将二维谱图载入软件（以 CcpNmr analysis 为例），并载入蛋白质的一级序列。
    7. 从短时间混合中可见的氨基酸类型开始鉴定 13C-13C PDSD 谱。连接自旋系统的碳原子，以实现“残基类型”特异性归属；参见 图 4A 用于苏氨酸残基的指认。尽可能多地鉴定出残基；鉴定数量将取决于蛋白质亚基的大小、谱图的分辨率和分散度。
    8. 将短时混合物覆盖在中间混合物上 13C-13C PDSD 谱
      注意：中间混合PDSD中可见的额外峰主要来源于连续残基（残基i - 残基i±1）之间的相互作用。一个两残基连续归属的示例如下所示 图4B.
      1. 标记自旋系统的共振峰，并在中等混合的PDSD中寻找与其他自旋系统的共振频率之间的相关性。在小蛋白质或肽中，有可能仅基于二维 13C-13C PDSD 实验。
        注意：在β-折叠二级结构基序中，残基i与残基i±2之间存在相互作用。 13C-13C接触由于在空间上更接近，其信号强度可能高于顺序接触；在α-螺旋二级结构基序中，表现为残基i与残基i±3之间的接触 13C-13C接触也可能导致强烈的信号。
    9. 若对选择性标记的样品进行中间混合的PDSD实验 13C标记的样品可获取时，将其叠加到选择性短混合谱图上（如果该谱图可获取） 13C标记样品）并指派辅助峰，同时考虑选择性 13C标记模式（1,3-13C 和 2-13C 甘油32,33 或 1-13C 和 213C葡萄糖29,30,31.
      注意：例如，在一个2-13C标记的甘油样品中，多种氨基酸类型在Cα位置被标记，而相邻的碳原子（Cβ和C'）未被标记，因此有利于相邻残基之间的Cα-Cα转移。在选择性标记的样品中，长距离 13C-13C 相关性可能在中等混合阶段就已经开始形成 13C-13C PDSD 实验。如果某个峰无法通过连续相关性来解释，则可能源于远程相互作用。对于大分子组装体中高度有序且均一的亚基结构，谱图中预期仅能看到一组共振信号。若观察到成对（或进一步倍增）的共振信号，则 13存在原子或主链序列区段的两种（或多种）构象。
    10. 使用包含残基内信息的二维NCA谱 15N-13Cα相关性用于鉴定 15每个残基的N共振频率。如果在 13C 维度信息不足，需利用 2D NCACB 中 Cβ 共振的辅助信息来确定残基内的连接 15N共振频率
    11. 使用包含残基内信息的二维 NCACB 和 NCACO 谱 15N-13C-13C 相关性分析以（i）识别残基内相关性 15N 频率和 (ii) 解决在 13C-13C PDSD 在额外帮助下 15N 维。由于 DREAM 转移导致信号发生反转，因而可观测到典型的 Cα-Cβ 相关信号，其中 Cα 信号为正，Cβ 信号为负。进一步的侧链 13C，若在谱图中可见，则再次呈现正值。

二维核磁共振谱图、化学位移相关性分析、碳-13、相互作用定位
图 4：对高度有序、均匀标记13C和15N的蛋白质组装体进行的二维13C-13C固态核磁共振PDSD实验。A) 短混合时间PDSD（混合时间为50 ms）。B) 通过叠加短混合时间PDSD（50 ms）与长混合时间PDSD（混合时间为200 ms）谱图，完成对Ile32-Thr33二残基片段的化学位移归属。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 二级结构测定
    1. 使用 13Cα, 13Cβ化学位移值用于计算二级化学位移 46ΔδCα-ΔδCβ，用于指示二级结构。计算 13Cα（已指派）-13Cα（无规卷曲）和 13Cβ（已指定）-13Cβ（无规卷曲）
      注意：随机线圈构象中残基的化学位移值可从38.
      1. 绘制 ΔδCα-ΔδCβ，负值或正值 > 连续三个残基分别指示β-链或α-螺旋构象；甘氨酸和脯氨酸残基可能表现出异常的化学位移值，因为它们通常作为“二级结构破坏者”。
    2. 使用 TALOS+ 从指定的化学位移预测蛋白质二面角47,48 或 PREDITOR49,50预测的Phi/Psi二面角反映了蛋白质亚基的二级结构，并在建模过程中作为结构约束使用。
  2. 结构约束的收集
    1. 建立并记录一个二维图像 13C-13C PDSD实验，采用长混合时间以检测远程相互作用 13C-13C 相关性。典型的混合时间范围为 400 ms 至 1 s。选择性使用 13C标记的样品，因为自旋稀释能显著改善远距离碳原子之间的极化转移。
    2. 叠加长时混合二维谱 13C-13C PDSD 在选择性标记的样品上记录，用于中间混合 13C-13C PDSD，如果可能，应记录在同一选择性标记的样品上。补充峰来源于较远距离核之间的相关性 13碳原子。在进行共振归属时，需考虑选择性标记方案。
    3. 仔细评估谱图的分辨率，以确定化学位移归属的容差范围。 即 依赖于特定ppm范围内的谱图分辨率，共振信号可能对检测信号产生贡献。在CcpNmr Analysis或SPARKY等核磁共振归属分析程序中，化学位移归属精度的标准偏差可被自动计算。
    4. 如果一个信号可以由序贯（残基 i - 残基 i±1）或中程 13C-13C接触（残基i - 残基i ± 2、3或4），保留此指认，因为即使存在远程极化转移，也能解释该相关性 13C-13C 距离超过预期的可见接触范围。
    5. 分类长距离分配 13C-13C接触区分为频率无歧义和有歧义的信号。在频率无歧义归属的情况下，相对于归属容差窗口，仅可能存在一种共振归属。
      注意：模糊指认包含容差窗口内所有可能的共振指认。这些模糊性可通过基于初步结构的迭代去模糊化过程在结构计算中同时消除，初步结构是仅使用非模糊约束计算得到的，此过程类似于计算程序 ARIA 中的操作。51 或 UNIO52此外，来自不同生物物理来源的结构数据（例如 通过溶液核磁共振或X射线晶体学、质量-长度测量、冷冻电镜图谱等方法获得的突变或截短亚基结构也可用于降低不确定性水平，示例参见 1,3,53,54,55,56,57,58.
  3. 对称性蛋白质组装中分子间距离限制的检测
    1. 建立二维模型 15N-13慢性疼痛-CP59 50/50混合的U-实验15N- / U-13C标记样品。在PAIN-CP谱图中检测到的信号应来源于分子间 15N-13C 近端。利用先前指定的共振峰来完成分子间接触的归属。
    2. 建立二维模型 13C-13C 长混合时间的PDSD>600 毫秒）在（50/50）混合（1,3-13C)- / (2-13C)-甘油或(1-13C)- / (2-13C)-葡萄糖样品。
      注意：在此检测到的信号 13C-13C谱源于分子内和分子间 13C-13C近端。然而，由于两种标记方案具有高度互补性，某些共振峰对可明确地源自分子间接触，例如丝氨酸CA在（2-13C)-葡萄糖标记的亚基，与（1-中的丝氨酸CB相关13C-葡萄糖标记的亚基
      1. 将混合样品的谱图叠加到二维谱图上 13C-13在均匀标记的样品（(1,3-13C）和（2-13C)-甘油或(1-13C）和（2-13C)-葡萄糖标记样品）。在混合样品的谱图中出现的额外信号应源于分子间相互作用。
  4. 基于固态核磁共振数据的结构建模
    1. 准备进行结构计算所需的固体核磁共振（SSNMR）限制条件列表：（1）蛋白质序列；（2）分子内明确的距离限制；（3）分子内模糊的距离限制；（4）基于TALOS的二面角限制；（5）分子间明确的距离限制；（6）分子间模糊的距离限制；（7）来自其他生物物理技术的附加数据例如 单位长度质量、对称性参数
    2. 多篇综述阐述了基于固态核磁共振（SSNMR）数据并结合其他互补性结构数据进行结构建模的研究进展 14,60,15,19,61,62 请注意，模糊的距离限制可以在结构计算过程中，基于明确的距离限制所得的初步结构模型进行解析。为确保结构的准确性，需仔细观察结构是否收敛于单一构象。

碳扩散图；同位素标记；13C；动力学途径；过程可视化；实验
图5对称蛋白质组装中的分子内与分子间相互作用 体内示意图 与 分子间 13C-13螺旋大分子组装体中的长程C接触。亚基以白色和红色着色，以展示亚基的混合标记； 即 在组装前，进行了两种不同标记方案的1:1混合（例如 1-13C 葡萄糖和 1-13C 葡萄糖 A分子内 13C-13C 长程相互作用（蓝色虚线箭头）； B分子间 13C-13C 长程相互作用（红色虚线箭头）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

结果

典型的固态核磁共振（SSNMR）工作流程包括以下几个步骤，如图所示 图1通常，蛋白质亚基由 体外 异源表达于 E. coli，纯化并在振荡条件下组装，但有时也在静态条件下进行。蛋白亚基的表达与纯化随后通过SDS凝胶色谱法进行图2A）。然后可通过电子显微镜（EM）分析确认大分子复合物的形成（参见 图2B 以丝状组装为例）。

将蛋白质组装体装入SSNMR转子后，将转子插入谱仪，调节MAS频率和温度，并采集谱图。通过一维SSNMR技术可获得初步信息。图3展示了一个结构均一的蛋白质样品在13C通道上检测到的典型SSNMR自由感应衰减（FID）信号，一个1H-13C交叉极化（CP）谱图，揭示了组装体中蛋白质亚基刚性核心所含的13C共振信号，以及一个二维1H-13C INEPT谱图，反映的是柔性残基的信号。为了获得组装体刚性核心结构的原子级解析信息，需要在均匀标记和选择性标记的样品上采集多维SSNMR实验数据，以首先完成SSNMR共振信号的归属，继而检测远程邻近关系（见图4）。

所有谱图均使用适当的软件进行处理和分析，以指定固态核磁共振（SSNMR）共振峰并提取分子内和分子间距离约束图5）。SSNMR 距离限制可单独使用，或与来自互补技术的数据结合使用，并可整合到建模程序中。

对于通过固态核磁共振（SSNMR）技术解析的大分子组装体的代表性原子结构，图6 展示了来自细菌附属结构和淀粉样纤维的几种丝状组装体。

蛋白质三维结构、带状模型、示意图、结构生物学、分子构象分析。
图6：通过固态核磁共振方法解析的丝状大分子结构：细菌丝状结构与淀粉样蛋白纤维。A) 尿路致病性E. coli的I型菌毛，PDB编号2N7H 4；B) ASC丝状结构，PDB编号2N1F 63；C) III型分泌系统针状结构，PDB编号2MME、2LPZ和2MEX 2,3,64；D) 淀粉样蛋白β AB42纤维，PDB编号2NAO、5KK3、2MXU 65,66,67，以及大阪突变体PDB编号2MVX 57、艾奥瓦突变体PDB编号2MPZ 58；E) α-突触核蛋白纤维，PDB编号2N0A 68；F) HET-s朊病毒结构域，PDB编号2RNM、2KJ3 69,70。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

固态核磁共振（SSNMR）是用于在原子水平上表征大分子蛋白质组装体的首选方法。基于SSNMR进行结构测定的核心问题之一是所研究体系的谱图质量，这决定了能否构建出不同精度的三维结构模型，通常从低分辨率模型（包含二级结构元件但三维信息较少）到准原子级分辨率的三维结构。从多维SSNMR实验中提取的结构信息的数量与质量，是计算获得该组装体高分辨率NMR结构的关键。

本方案依赖于检测13C-13C和15N-13C结构约束，需要采集多个具有高信噪比的二维（有时为三维）谱图。在中等魔角旋转（MAS）频率（<25 kHz）下，将样品装入直径为3.2–4 mm的转子中，可容纳的蛋白样品量最高约为50 mg，具体取决于样品的含水量。转子内样品的量与固体核磁共振（SSNMR）谱图中的信噪比成正比，这是实现长程距离约束检测及其明确归属的关键因素。

光谱分辨率在逐步共振归属和约束条件收集过程中是一个关键参数。为了获得最佳结果，需要优化样品制备参数，特别是亚基的纯化以及组装条件（pH、缓冲液、振荡、温度） 等等。）。对于样品优化，建议为已观察到组装现象的多个不同条件分别制备未标记样品，并记录相应的1D 1H-13在每个制备好的样品上采集CP谱（见步骤2.1）。这些谱图用于比较不同样品制备条件下的谱图分辨率和分散性，并据此确定最佳实验条件。

固态核磁共振（SSNMR）数据的质量在很大程度上取决于核磁共振采集参数的选择，尤其是极化转移步骤的参数。使用高磁场强度（≥600 MHz 1H 频率）对于实现高灵敏度和高谱分辨率至关重要，这在面对大分子蛋白质组装体等复杂研究目标时尤为必要。

在许多情况下，限制因素是波谱仪的可用性。因此，在进行波谱仪实验之前，应审慎选择需要制备的样品。无论如何，均匀标记13C和15N的样品是完成逐残基及残基内共振归属的前提条件。通过固态核磁共振技术完成归属的蛋白质，参见71。在中等魔角旋转（MAS）频率下进行大分子组装体结构测定时，需要使用选择性13C标记的样品；为检测长程13C-13C和13C-15N相互作用，通常采用基于1,3-13C-甘油和/或2-13C-甘油，以及1-13C-葡萄糖和2-13C-葡萄糖标记的样品，如上所述。两种标记策略的选择取决于谱图的信噪比和分辨率。为区分分子内与分子间长程相互作用，混合标记并稀释的样品已被证明是有效的方法。

简而言之，原子级固态核磁共振结构研究的关键步骤包括：（i）亚基的制备与组装需经过优化，以获得优良的样品数量和质量；（ii）必须谨慎选择波谱仪磁场强度和采集参数；（iii）三维结构测定需要采用选择性同位素标记策略，所需数据量取决于数据质量以及是否有互补数据可供使用。

尽管固态核磁共振（SSNMR）可广泛应用于从膜蛋白到同源多聚体纳米结构等多种超分子体系，但其通常受限于需要毫克量级的同位素标记样品。近年来超快魔角旋转（≥100 kHz）SSNMR技术的发展，为该领域开辟了新的前景 1H检测核磁共振，并将样品最低用量的极限推进至亚毫克级 72,73,74然而，对于详细的结构研究 13C标记的样品是不可或缺的，这限制了固体核磁共振技术在组装样品中的应用 体外 或在仅含最低限度培养基的生物体中表达的系统，其中细胞内固态核磁共振（SSNMR）是一种新兴方法（综述见 75,76,77,78).

在固态核磁共振（SSNMR）应用于获得高分辨率三维结构时，一个重要的因素是谱图分辨率：组装体中固有的构象异质性可能会限制谱图分辨率及谱图分析。在某些情况下，残基特异性的13C标记可作为替代方法，用于获取关键残基的特定距离信息，从而构建结构模型（近期示例参见79,80）。

采用固态核磁共振（SSNMR）进行三维结构测定仍需采集多个数据集，通常在精密仪器上耗时较长，具体时间取决于研究方法和体系，在600–1000 MHz（1H频率）谱仪上可能需要数天至数周。因此，谱仪机时的获取可能成为深入SSNMR研究的限制因素。

对于同源多聚体蛋白质组装体，可获得质量足够高的固体核磁共振数据，以识别大量结构限制，例如在 3,57,64,70，SSNMR 仍无法提供微观尺寸信息。因此，在一个 从头合成 SSNMR结构测定同源多聚体组装体时，电镜（EM）或单位长度质量（MPL）数据可与SSNMR数据理想互补，以确定其对称参数。仅SSNMR数据即可提供原子级的分子内和分子间相互作用界面信息

固态核磁共振（SSNMR）与电子显微镜（EM）或MPL测量等结构技术具有高度互补性，其数据也可与通过X射线晶体学或溶液核磁共振获得的突变或截短亚基的原子结构完美结合。文献中越来越多的研究表明，多种结构数据的联合应用已成功实现了大分子组装体原子级三维模型的构建（代表性示例如图6所示）。

在结构生物学领域，固态核磁共振（SSNMR）作为一种有前景的技术，可用于在原子水平上研究不溶性及非晶态聚集体。 即 提供原子尺度的结构数据。在这方面，固体核磁共振（SSNMR）与溶液核磁共振及X射线晶体学相辅相成，适用于研究包括膜蛋白在其天然环境中的分子组装，以及病毒包膜、细菌纤维、淀粉样蛋白、RNA及RNA-蛋白质复合物等（例如参见81）。其高度多样的应用 体外 在细胞环境中，例如追踪二级、三级和四级结构的变化，以及在原子尺度上鉴定与相互作用分子的结合表面（例如 82以及在组装复合物背景下描绘分子动力学，表明了固体核磁共振在未来复杂生物大分子组装体结构研究中的重要意义。

组分M9 培养基
NaCl0.5 g/L
KH2PO43 g/L
Na2HPO46.7 g/L
MgSO41 mM
ZnCl210 μM
FeCl31 μM
CaCl2100 μM
MEM 维生素混合液 100X10 mL/L
13C-葡萄糖2 g/L
15NH4Cl1 g/L

表1：在E. coli BL21细胞中用于重组蛋白 表达的最小培养基成分。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由法国国家研究局（ANR）（项目编号13-PDOC-0017-01资助B.H.，项目编号ANR-14-CE09-0020-01资助A.L.）、"未来投资计划"波尔多大学/法国国家科学研究中心（CNRS）（PEPS 2016项目资助B.H.，参考编号ANR-10-IDEX-03-02资助B.H.）、法国医学研究基金会（FRM-AJE20140630090资助A.L.）、欧盟第七框架计划（FP7-PEOPLE-2013-CIG资助A.L.）以及欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的资助（A.L.获得ERC启动资助，协议编号639020）和项目"WEAKINTERACT."

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器
NMR 波谱仪（> 11.7 特斯拉）Bruker-
三共振魔角旋转固态核磁探头 Bruker-
4 mm 固态核磁转子BrukerK1910
Centrifuge 5804 R Eppendorf5805000629
GeneQuant 1300 分光光度计Dutscher28-9182-13
IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 LDutscher228001
MaxQ 4450 台式轨道摇床Dutscher78376
Tube Revolver 混匀仪Dutscher79547
sonopuls HD 3100Bandelin3680
MicroPulser 电穿孔仪Biorad165-2100 
mini-PROTEAN tetra 电泳系统Biorad165-8000
AKTA pure 系统GE Healthcare29-0182-24
capillary microman M25 移液器Gilson F148502
名称公司货号备注
材料
AmiconR ultra-15SigmaZ740199-8EA
毛细管和活塞Gilson F148112
药匙Fisher13263799
名称公司货号备注
试剂
D-葡萄糖 13C6Sigma389374
氯化铵-15NSigma299251
1,3 13C2 甘油Sigma492639
2 13C 甘油Sigma489484
卡那霉素SigmaK1876
羧苄青霉素SigmaC3416
磷酸氢二钠SigmaS7907
磷酸二氢钾SigmaP5655
氯化钠Sigma71380
氯化钙SigmaC1016
硫酸镁Sigma208094
氯化铁Sigma157740
氯化锌Sigma793523
MEM 维生素溶液（100×）SigmaM68954
IPTGFisherBP1755
Trizma 碱 SigmaT1503
TricineSigmaT0377
SDSSigma436143
叠氮化钠Sigma71289
4,4-二甲基-4-硅杂戊烷-1-磺酸 Sigma178837
名称公司货号备注
软件
Unicorn 6.3GE HealthcareAkta 系统
ccpNMRCCPN 波谱仪系统

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利用固态核磁共振波谱法对大分子组装体进行原子尺度结构研究
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