Atomarer Skala strukturelle Studien der makromolekularen Versammlungen von Festkörper-NMR-Spektroskopie

Summary

Strukturen der supramolekularen Protein Baugruppen in atomarer Auflösung sind wegen ihre entscheidende Rolle in einer Vielzahl von biologischen Erscheinungen von hoher Relevanz. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um hochauflösende strukturelle Studien unlöslich und nichtkristalline makromolekularen Protein-Assemblys durch Magie-Winkel drehen Festkörper-Kernspinresonanz-Spektroskopie (MAS-NMR) durchführen.

Abstract

Supramolekulare Protein Baugruppen Rolle grundlegende in biologischen Prozessen von Wirt-Pathogen-Interaktion, virale Infektion, die Ausbreitung von neurodegenerativen Erkrankungen. Solche Baugruppen bestehen in mehreren Protein-Untereinheiten organisiert in einer nicht-kovalente Weise makromolekularen Großobjekte zu bilden, die eine Vielzahl von zellulären Funktionen ausführen oder nachteilige Folgen nach sich ziehen können. Atomare Einblicke in die Versammlung Mechanismen und das Funktionieren des makromolekularen Assemblys bleiben oft knappen seit ihrer inhärenten Unlöslichkeit und nicht Kristallinität oft drastisch reduziert die Qualität der von den meisten Techniken gewonnenen Daten in der Strukturbiologie, wie Röntgen-Kristallographie und Lösung Kernspinresonanz (NMR) verwendet. Wir präsentieren hier Magic-Angle-Spinning Festkörper-NMR-Spektroskopie (NMR) als eine leistungsfähige Methode, um Strukturen der makromolekularen Versammlungen in atomarer Auflösung zu untersuchen. NMR kann atomare Details auf der montierten Anlage Größe und Löslichkeit uneingeschränkt offenbaren. Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte aus der Produktion von ¹³C /¹⁵N Isotopen-Label makromolekularen Protein Baugruppen für den Erwerb von standard NMR-Spektren und deren Analyse und Interpretation. Als Beispiel zeigen wir die Pipeline eine NMR-Strukturanalyse einer faserigen Protein-Versammlung.

Introduction

Fortschritte in der Magie-Winkel drehen Festkörper-Kernspinresonanz-Spektroskopie (NMR) bieten ein effizientes Werkzeug für die strukturelle Charakterisierung von Proteinen makromolekularen Versammlungen in atomarer Auflösung. Diese Protein-Baugruppen sind ubiquitäre Systeme, die wesentliche Rollen in vielen biologischen Prozessen spielen. Ihre molekularen Strukturen, Interaktionen und Dynamik sind zugänglich durch NMR-Studien, wie für virale (Capsids¹) und bakterielle Infektionsmechanismen (Sekretion Systeme^2,3, Pili⁴), Membran Protein-komplexe^5,6,7,8 und funktionale amyloiden ^9,10,11. Diese molekularen Montageart kann auch Erkrankungen wie z. B. bei neurodegenerativen Erkrankungen provozieren, wo Proteine in fehlgefaltete, Amyloid Staaten montieren und dazu führen, dass aberrante Zelle Verhalten oder Zelle Tod ^12,13. Protein-Baugruppen werden oft durch die symmetrische Oligomerisierung von vielfachen Kopien von Protein-Untereinheiten in großen supramolekularen Objekte in verschiedenen Formen, einschließlich Fibrillen, Filamente, Poren, Röhren oder Nanopartikel gebaut. Die quartäre Architektur ist definiert durch schwachen Wechselwirkungen zwischen Protein-Untereinheiten, die räumliche und zeitliche Versammlung zu organisieren und für anspruchsvolle biologischen Funktionen ermöglichen. Strukturelle Untersuchungen auf atomarer Skala auf diese Assemblys sind eine Herausforderung für hochauflösenden Techniken seit ihrer intrinsischen Unlöslichkeit und sehr oft ihre nicht-Kristallinität schränkt die Verwendung von konventionellen Röntgen-Kristallographie oder NMR-Lösung Ansätze. Magie-Winkel dreht (MAS) NMR ist eine neue Technik, atomarer Auflösung Daten über unlösliche makromolekularen Versammlungen und beweist seine Leistungsfähigkeit, atomare 3D-Modelle für eine wachsende Zahl von komplexen biomolekularen Systemen einschließlich zu lösen bakterielle Filamente, Amyloid Baugruppen und Viruspartikel ^{14,15,16,17,18,19,20, 21,22}. Technischen Fortschritt auf hohen Magnetfeldern, methodischen Entwicklungen und Probenvorbereitung hat MAS-NMR in eine robuste Methode zu untersuchen, unlösliche Proteine in verschiedenen Umgebungen, insbesondere ihre biologisch relevante makromolekularen Staat oder in Zellmembranen, wodurch die Technik sehr komplementär zur Kryo-Elektronenmikroskopie montiert. In vielen Fällen kennzeichnet ein sehr hohes Maß an Symmetrie solche Protein-Baugruppen. MAS-NMR nutzt diese Funktion, wie alle Protein-Untereinheiten in einer Homomolecular Versammlung die gleiche lokale Struktur hätte und damit praktisch die gleiche NMR-Signatur, drastische Reduzierung der Komplexität der Analyse.

Ein effizientes Protokoll für strukturelle Studien von makromolekularen Protein Baugruppen durch moderate MAS (< 25 kHz) NMR wird in diesem Video präsentiert und können unterteilt werden in verschiedenen Stufen (Abbildung 1). Wir zeigen die kritischen Phasen des Workflows eine NMR strukturelle Studie am Beispiel einer faserigen Protein Baugruppe (siehe markierte Schritte in Abbildung 1), mit Ausnahme der Untereinheit Proteinreinigung, unterschiedlich für jedes protein Montage sind aber von entscheidender Bedeutung für strukturelle Studien und ohne auf die technischen/methodische Details der NMR-Spektroskopie und Struktur Berechnung für welche spezialisierten Tutorials online verfügbar. Während dieses Protokolls in erster Linie auf Festkörper-NMR-Experimente unter MAS Bedingungen durchgeführt wird, ausgerichtet die Verwendung von biologischen Umgebungen ^{23,24,25,26 , 27}, wie z. B. ausgerichteten Bicelles ermöglichen die Untersuchung von Protein-Konformation und dynamische Proteinprotein Interaktion in Membran-ähnliche Medien ohne MAS-Technologie. Wir zeigen die Proteinexpression und Montageschritte sowie die Aufnahme von entscheidenden NMR-Spektren und deren Analyse und Interpretation. Unser Ziel ist es, Einblicke in die strukturelle Analyse Pipeline ermöglicht den Leser, eine atomarer Auflösung strukturelle Studie einer makromolekularen Versammlung durch NMR-Techniken durchzuführen.

Das Protokoll umfasst 3 Bereiche:

(1) Festkörper-NMR-Musterfertigung

Als Voraussetzung für einen Festkörper-NMR-Analyse, die Proteinbestandteile des makromolekularen Montage müssen ausgedrückt werden, Isotopen-Label, gereinigt und montiert in Vitro in der Native-ähnlichen komplexen Zustand (für ein Beispiel siehe Abbildung 2) . Damit hohen Empfindlichkeit der NMR, ist Isotop Bereicherung in ¹³C und ¹⁵N Kennzeichnung erforderlich durch minimale bakterielle Ausdruck Medien ergänzt mit ¹³C und ¹⁵N Quellen, wie einheitlich ¹³ C-markierten Glukose/Glycerin und ¹⁵NH₄Cl bzw.. In der späteren Phase des Protokolls, selektiv ¹³C-markierten Proben produziert mit selektiv ¹³C-Label Quellen wie z. B. (1,3 -¹³C)- und (2 -¹³C)-Glycerin (oder (1 -¹³C)- und (2 -¹³C)- Glukose) werden verwendet, um die NMR-Analyse zu erleichtern. Beschriftete Mischprobe entspricht einer äquimolaren Mischung von entweder 50 % ¹⁵N- und 50 % ¹³C beschriftet oder 50 % (1,3 -¹³C)- und 50 % (2 -¹³C)-Glukose werden eingeführt, um die Erkennung von intermolekularen beschreiben Interaktionen. Ein hohes Maß an Protein Reinheit sowie strenge Bedingungen während der Montageschritt sind Schlüsselfaktoren, um eine homogene strukturelle Ordnung der Endprobe zu versichern.

2. vorläufige strukturelle Charakterisierung basierend auf eindimensionale (1D) Festkörper-NMR

Wir präsentieren Ihnen die wesentlichen Experimente für eine strukturelle Analyse von NMR. Eindimensionale (1D) Kreuz-Polarisation (CP) und WERTAUSPRÄGUNGEN / RINEPT²⁸ Experimente, auf ¹³C-Kerne erkannt werden verwendet, starre und flexible Protein Segmente bzw. in der Baugruppe zu erkennen und zur Schätzung der Struktur- Homogenität und lokalen Polymorphismus (für ein Beispiel siehe Abbildung 3).

Rong > 3. Conformational Analyse und 3D Struktur Bestimmung

Abs. 1 und 2 betreffen die conformational Analyse, die über die NMR-Resonanz-Zuordnung von alle starren Rückstände der Assemblée Protein basiert, wie die chemischen Verschiebungen sehr empfindlich-Sonden an die lokalen Gegebenheiten sind und verwendet werden, können um vorherzusagen, die Phi/psi Verschneidung Winkel und damit bestimmen die Sekundärstruktur. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für eine sequentielle Resonanz-Zuordnung in der starren Kern einer Protein-Versammlung. Die 3D-Struktur Bestimmung basiert auf der Sammlung von Strukturdaten, z. B. Abstand Beschränkungen Codierung Nähen schließen (< 7-9 Å), sowohl intra- und intermolekularen Informationen enthalten. Abs. 3 und 4 beschreiben Langstrecken entfernten Zurückhaltung Sammlung und Interpretation. Weitreichende Kontakte sind definiert als intramolekulare ¹³C -¹³C Nähe durch Rückstand ich j, mit | i-j | ≥4, definieren dabei die tertiären Protein-Falte der Monomere Untereinheit oder als intermolekulare ¹³C -¹³C nähen, die intermolekularen Schnittstellen zwischen Protein Untereinheiten in der Baugruppe zu definieren. Intra- und intermolekularen Schnittstellen sind in Abbildung 5dargestellt. NMR-Beschränkungen erkannt durch ¹³C -¹³C und ¹⁵N -¹³C Wiederankoppelung Experimente in der Regel kodieren für internuklearen Entfernungen < 1 nm. Abs. 4 erklärt die Erkennung von intermolekulare Abstand Beschränkungen. In symmetrischen Proteins Baugruppen, die Verwendung von homogen beschrifteten Proben (d. h. 100 % gleichmäßig oder selektiv beschriftet) Untereinheit-Untereinheit intermolekularen Wechselwirkungen identifizieren begrenzt sind, als beide Intra - und inter - molecular Kontakte führen zu nachweisbare Signale. Die eindeutige Erkennung der intermolekularen Nähen wird erreicht, indem beschrifteten Mischproben, mit einer äquimolaren Mischung aus zwei unterschiedlich beschriftete Proben vor der Aggregation kombiniert. Unterabschnitt 5 führt kurz Struktur Modellierung.

Abbildung 1 : Workflow ein atomarer Auflösung strukturelle Studie von Festkörper-NMR. ¹³ C, ¹⁵N Isotop mit der Bezeichnung Proteinproduktion, Untereinheit Reinigung, Untereinheit Montage, Kontrolle der Montage Bildung, NMR-Experimente, NMR-Experiment-Analyse und Gewinnung von Abstand Beschränkungen und Modellierung der Struktur werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

1. Solid-State-NMR Probe Productiona

1. Herstellung von einheitlich ¹³ C / ¹⁵ N-markierten Protein Untereinheiten
   1. Verwendung frisch verwandelt, pET24-Peptid-6Sein Plasmid-haltigen E. Coli BL21 (DE3) Zellen, ernten sie aus vorbereiteten Nährbodenplatte.
   2. Impfen eine 15 mL Vorkultur der vorgewärmten LB-Medium mit einer Kolonie. Bei 37 ° C mit 200 u/min schütteln über Nacht inkubieren.
   3. Übertragen die Vorkultur in 1 L der wichtigsten Kultur des vorgewärmten M9 Medium (siehe Zusammensetzung in Tabelle 1), enthält die erforderlichen Isotopen-markierte Kohlenstoff und Stickstoff.
      Hinweis: Dies ist einheitlich ¹³ C-markierten Glukose, selektiv (1 - ¹³ C)- oder (2 - ¹³ C)-mit der Bezeichnung Glukose ^{29 , 30 , 31} oder () 1,3 - ¹³ C)- oder (2 - ¹³ C)-mit der Bezeichnung Glycerin ^{32 , 33}.
   4. Dies bei 37 ° C inkubieren und messen die OD ₆₀₀, sobald die Kultur trübe wird. Wenn die OD ₆₀₀ einen Wert von 0,8 erreicht hat, induzieren Proteinexpression mit 0,75 mM IPTG für 4 Std.
      Hinweis: Die optimale Induktion Bedingungen variieren von einem Protein zum anderen.
   5. Wiederherstellung der Zellen durch Zentrifugation für 30 min bei 6000 x g und 4 ° c
2. Reinigung skizzieren (nicht im video Protokoll dargestellt)
   1. Lyse der Zellen mit standard-Techniken wie Ultraschall oder Lysozym Behandlung und Reinigen der Protein-Untereinheit mit Techniken hergestellt oder angepasst für die Protein-Montage untersucht.
      Hinweis: Das Protein kann in Einschlusskörperchen, überprüfen Sie für die Protein-Lokalisierung durch Lyse der Zelle und anschließende Zentrifugierung ausgedrückt werden. Wenn das Protein im Sediment mit den Trümmern der Zelle gefunden wird, es in Einschlusskörperchen gesammelt worden.
   2. Test-Ausdruck und Reinheit der Protein-Probe zum Beispiel von einem standard 12-15 % Tris-Tricine SDS-PAGE, siehe Abbildung 2A. Wenn die Reinheit ausreichend ist, das Protein kann zusammengebaut werden, sonst führen Sie eine zusätzliche Reinigungsstufe.
3. In-vitro- Montage der Protein Filamente
   1. Proteinkonzentration in der gereinigte Lösung zu überprüfen. Wenn das Protein absorbierende Rückstände enthält, Messen Sie die Absorption in einem UV-Spektralphotometer bei 280 nm. Legen Sie den reinen Puffer in Spektralphotometer Kalibrierung und messen dann die Protein-Absorption.
   2. Berechnen Sie die Konzentration des Proteins mit der Absorptionskoeffizient von Protein-Untereinheit mit dem angepassten Bier-Lambert Gesetz: ein _λ = ε _λ x l X C; hier A ist die optische Dichte bei einer bestimmten Wellenlänge λ; ε ist die spezifische Absorptionskoeffizient; l ist die Länge der optischen Bahn in cm; c ist die Konzentration in Mol/L.
   3. Konzentrieren, das Protein zu einer Konzentration von 1 mM in eine zentrifugale Filter-Einheit. Führen Sie die Probe in die zentrifugale Filtereinheit ein und bei 4000 X g für 30 min Zentrifugieren Sie, mischen Sie die Lösung in der Filtereinheit sanft mit einem pipettieren, Protein Ablagerung am Filter zu vermeiden. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist.
      Hinweis: Die optimale Montage-Konzentration hängt vom System und muss (in der Regel zwischen 0,1 - 1 mM) optimiert werden. Wenn einer äquimolaren beschrifteten gemischt Probe von zwei verschiedenen beschrifteten Eiweiß Chargen ist bereit (z.B. (50/50) (U - ¹⁵ N)-/ (U - ¹³ C)-mit der Bezeichnung), mischen erfolgen entweder vor oder direkt nach der Konzentration Schritt zu gewährleisten Homogenisierung der gemischten Lösung.
   4. Übertragen die Probe in ein Rohr und unter Agitation für eine Woche bei Raumtemperatur inkubieren.
   5. In der Regel die Polymerisation der Untereinheiten in Filamente begleitet die Lösung immer trübe. Überprüfen Sie die mikroskopischen Fibrille Morphologie und Homogenität zum Beispiel mittels Elektronenmikroskopie (6300 X - 45000 X Vergrößerung), siehe Abb. 2 b.
   6. Zentrifuge der Probe für 1 h bei 20000 x g und 4 ° C. Entfernen Sie den Großteil der Überstand lassen nur genügend Flüssigkeit auf der Oberfläche zur Vermeidung von Probentrocknung zu decken. Überprüfen den Überstand für nicht zusammengebauten Untereinheiten auf die UV-Spektrophotometer.
   7. Der Probe durch das Hinzufügen von H ₂ O und vorsichtig waschen Aufschwemmen den Inhalt mit einer Pipette. Tun Sie nicht Wirbel. Drehen Sie die Probe für 30 min bei 22000 x g und 4 ° c Waschschritt 3 Mal wiederholen. Während alle Waschschritte wenn das Pellet bewahrt seinen Aspekt nach Zentrifugation und überprüfen den Überstand für nicht zusammengebauten Untereinheiten auf die UV-Spektrophotometer.
   8. Fügen Sie 0,02 % (w/V) Natriumazid (NaN ₃) bakterielle Kontamination zu vermeiden und Speichern der Probenmaterials bis zur Messung bei 4 ° c
4. Solid-State-NMR Rotor füllen
   1. zweimal für 30 min bei 22000 x g und 4 ° c entfernen Höchstbetrag des Überstands Zentrifugieren; die resultierende Probe Konsistenz hängt von der Protein-Versammlung, und ist in der Regel eine Gel-artige Kaution.
   2. Verwenden eine Kapillare pipettieren die Probe in der NMR-Rotor einfügen.
      Hinweis: Hier präsentieren wir Ihnen das Verfahren auf eine 4 mm Durchmesser Rotor.
      1. Zentrifuge des Rotors auf einem Tisch Zentrifuge, sanft die Probe in den Rotor einzuführen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis der Rotor gefüllt ist. Halten Sie minimalen Platzbedarf um den Rotor mit dem Rotor-Deckel zu schließen. Wenn die Probenmenge nicht ausreicht, stellen eine handelsübliche einfügen zu füllen die Restflächen, die Probe Verteilung Homogenität in den Rotor zu gewährleisten.
         Hinweis: Abhängige auf die montierten Probe Konsistenz, es könnte sein, eine angemessenere zu einem dünnen Spatel, vor allem für sehr dichte Proben verwenden. Rotoren mit einem Durchmesser von 2,5 bis 4 mm bei moderaten MAS Frequenzen verwendet werden.
   3. Fügen Sie Spuren von 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic Säure (DSS) für interne chemische Verschiebung und Temperatur-Kalibrierung.
   4. Schließen die Kappe mit einer Schließvorrichtung.
   5. Unter einer Lupe überprüfen, ob die Kappe gut eingefügt und komplett geschlossen.

Abbildung 2: Vertreter ergibt sich für Protein-Untereinheit Reinigung und Montage. (A) 15 % Tris-Tricine SDS-PAGE von Protein-Untereinheit (einschließlich seiner ₆-Tag) in den verschiedenen Phasen der Reinigung. Spur 1 - Protein Molekulargewicht Marker; Bahn 2 - E. Coli BL21 (DE3) Zellen uninduced Kontrolle; Bahn 3 - E. Coli BL21 (DE3) Zellen induziert mit 0,75 mM IPTG; Bahn 4 - solubilisiert Einschlusskörperchen Bahn 5 - überstand Bruchteile von Zelle lysate; Bahn 6 - gereinigt Bruchteil nach Nickel Metall Affinitätschromatographie (IMAC) FPLC und Entsalzung immobilisiert. (B) negativ gefärbt Protein Fibrillen durch TEM Bildgebung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

2. vorläufige strukturelle Charakterisierung basierend auf eindimensionale (1D) Festkörper-NMR

1. Initial Setup und 1D Kreuz-Polarisation (CP)
   1. legen Sie den Rotor in der NMR-Magneten
   2. beginnen, Drehen Sie den Rotor mit einer Frequenz von 5 kHz und warten auf eine Stabilisierung der ± 10 Hz, dann beschleunigen bis 7 kHz. Tune und entsprechen ¹ H, ¹³ C und ¹⁵ N-TV. Stellen Sie die Temperatur um 2 bis 10 ° C (275-283 K); Probenerwärmung bei 7 kHz MAS ist gering und Temperatureinstellung ist in der Regel nicht erforderlich bei dieser Frequenz MAS.
   3. Aufzeichnen ein Single-gepulste 1D ¹ H Spektrum mit 16 Scans.
      Hinweis: Leistungsstufen müssen zuvor wurden optimiert auf eine Referenz-Verbindung (z. B. ein ¹³ C / < Sup > 15 N Histidin oder Glycin), um Ausgangswerte bieten für die Optimierung der Leistungsstufen in den Experimenten auf der Zielstichprobe; Dieses Verfahren ist eine Routine-Aufgabe und deshalb Out-of-Bereich in diesem Protokoll.
   4. Halten die Temperatur bei allen Experimenten zwischen 2 bis 10 ° C, in hydratisierte Proben, die die Temperatur in die relative Verschiebung der Masse Wasser ¹ H Resonanz in Bezug auf die DSS Signal ³⁴ niederschlägt. Messen Sie die Temperatur nach der Beziehung δ (H ₂ O) = 7.83-T/96,9 mit einer Genauigkeit von 1 bis 2 ° C ³⁵.
   5. Satz oben die gewünschte MAS Frequenz und warten Sie, bis die Stabilisierung von ±10 Hz.
      Hinweis: Hier wird aufgezeigt, für eine Frequenz von 11 kHz.
   6. Melodie und Spiel ¹ H und ¹³ C Kanäle wieder und stellen Sie die Temperatur mit Hilfe eines Experiments 1D ¹ H.
   7. Richten Sie eine 1D ¹ H - ¹³ C CP ³⁶.
      Hinweis: CP Experimente zeigen die Signale aus Rückständen in eine starre Konformation. Puls-Kalibrierung und Entkopplung Parameter können direkt auf der Probe optimiert werden, wenn die Empfindlichkeit hoch genug, um Signale nach weniger als ~ 32 Scans zu beobachten ist. Die erste Optimierung-Werte werden von der standard-Optimierung auf eine Referenz-Verbindung übernommen. CP-Kontaktzeit und Leistungsstufen werden auf maximale Signalstärke ausgewählt. In Proteinproben ist in der Regel die optimale CP Kontaktzeit zwischen 200 µs und 2 ms, die die Entkopplung Parameter auch von der Kalibrierung auf eine Referenz-Verbindung neu eingestellt werden sollte.
      1. Sorgfältig beobachten die Lokalisierung der Spinnerei Seitenbänder bei bestimmten MAS Frequenz.
   8. Aufzeichnen eine 1D ¹³ C CP Referenzspektrum, die als 1D spektralen Fingerabdruck dient. Typische Kennwerte sind 128 Scans, 1 ms CP Kontaktzeit, 100 kHz Entkopplung Kraft, eine Recycling-Verzögerung von 3 s und 25 ms des Erwerbs.
   9. Kalibrieren ¹ H und ¹³ C chemische Verschiebungen nach der IUPAC-Empfehlungen- ³⁷. Bestimmen Sie die Resonanzfrequenz des ¹ H DSS Signals (chemische Verschiebung von 0 ppm); ¹³ C chemische Verschiebungen sind bezogen auf ¹ H Schichten (in der Regel ~ 0.25144, abgeleitet aus dem Verhältnis von ¹³ C, ¹ H Resonanz Frequenz ³⁷).
   10. Prozess der 1D ¹ H - ¹³ C CP zu experimentieren, ohne Apodisierung funktionieren (siehe Abb. 3A und B für den Nachweis einer homogen wohlgeordneten Protein-Baugruppe). Wählen Sie eine isolierte Spitze um die Linienbreite in der Probe, bezeichnend für strukturelle Ordnung und Homogenität zu schätzen. Typische ¹³ C Linewidths für geordnete biologische Protein Baugruppen unter MAS bei hohen Magnetfeldern im Bereich zwischen 20-150 Hz (gemessen als die gesamte Breite bei halber Höhe (FWHH)).
   11. Schätzen das Signal-Rausch-(S/N) Verhältnis im Spektrum CP.
       Hinweis: Das S/N-Verhältnis hängt von vielen Faktoren ab, darunter vor allem die Menge der Probe in den Rotor, der Grad der Starrheit des Protein-Struktur und das Vorhandensein von einem einzigen molekularen Konformation. Als Faustregel gilt, sollte ein Beispiel für mehrdimensionale NMR-Spektroskopie geeignet sein, wenn ein Signal in eine optimierte 1D ¹ H - ¹³ C CP Spektrum aufgenommen mit 64 Scans beobachtet wird.
   12. Zoom in den Spektralbereich von Protein Rückgrat Carbonyl Resonanzen zwischen 165-180 ppm (hauptsächlich) lokalisiert. Schätzung des Sekundärstruktur Inhalts in der Versammlung durch die Position der Protein Rückgrat Carbonyl Resonanzen mit Resonanzen von Rückständen im α-helikale oder β-Strang Konformation verschoben downfield oder Upfield, bzw. (siehe Abbildung 3 b für eine meist α-helikale Untereinheit) ³⁸.
2. 1D WERTAUSPRÄGUNGEN experimentieren
   1. a 1 D ¹ H - ¹³ C UNFÄHIGEN Experiment für hochmobile Teile (Sub-µs) die Protein-Baugruppe Sonde eingerichtet.
      Hinweis: GARP Entkopplung von ein paar kHz bei Erwerb ³⁹ ist allgemein verwendet, interscan Wartenzeiten zu ermöglichen (in der Regel 1 s) ohne Beschädigung der Sonde.
   2. Aufzeichnen einer UNFÄHIGEN Referenzspektrum, wie Fingerabdruck für die Segmente mobile Protein dient; typische Kennwerte sind 128 Scans und einer Erfassungszeit von 25 ms.
   3. Prozess der ¹ H - ¹³ C UNGESCHICKT experimentieren. Die Menge und die Positionen der Signale sind bezeichnend für die Menge an mobilen Rückstände und die Aminosäure-Zusammensetzung bzw..
      Hinweis: Auch ein 2D ¹ H - ¹³ C UNFÄHIGEN Experiment aufzeichnen, wenn Signale im 1D UNFÄHIGEN Spektrum vorhanden sind (siehe Abbildung 3 für ein Beispiel), eine spezifische Aminosäure-Identifizierung zulassen. In mehrdeutige Zuordnung Fällen empfehlen wir, Überprüfung der Puffer Komponentenpositionen Signal durch Lösung NMR.
   4. Verwenden die BMRB Datenbank ⁴⁰ und veröffentlichten Daten ³⁸ um ihre entsprechenden Aminosäure in in der Nähe von zufälligen Spule Konformation der Resonanzen zuzuweisen; das Spektrum enthält nur mobile Puffer Komponenten, wenn keine Rückstände sind in einem hochmobilen Regime.

Abbildung 3: repräsentative Ergebnisse der NMR-Spektren Erwerb für eine gut strukturierte Protein-Baugruppe. (A) ¹³ C erkannt FID einer ¹ H - ¹³ C-Kreuz-Polarisation-Experiment. (B) ¹ H - ¹³ C Kreuz-Polarisation Experiment. C) ¹ H - ¹³ C UNFÄHIGEN Experiment einer starren Protein-Versammlung; nur Puffer Komponenten sind sichtbar. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

3. Conformational Analyse und 3D Struktur Bestimmung

1. sequentielle Resonanz Zuordnung
   1. eingerichtet, ein 2D ¹³ C - ¹³ C Proton angetriebene Spin Diffusion (PDSD) ⁴¹ zu experimentieren, um Intra-Rückstände ¹³ C - ¹³ C Korrelationen, einschließlich Seitenketten zu erkennen. Übernehmen Sie die Werte für die ersten ¹ H - ¹³ C Kreuz-Polarisation Schritt 1D ¹ H - ¹³ C CP Experiment.
      1. Die Mischzeit eingestellt bis 50 ms für einheitlich ¹³ C-markierten Proben und 100 ms für selektiv ¹³ C-markierten Proben. Stellen Sie die indirekten Erwerb Zeit zwischen 5-25 ms und dem direkten Erwerb zwischen 15-25 ms abhängig von der intrinsischen spektrale Auflösung, die durch das sichtbare Signal in der Free Induction Decay (FID) Länge (beispielhaft in geschätzt werden kann Abbildung 3A).
      2. Test mehrere Verarbeitungsparameter um optimale Werte in Bezug auf Signal-Rausch- und Auflösung des Spektrums zu finden, in der Regel ausreichende Verarbeitung erreicht werden mit einer Fensterfunktion Qsine mit einer Sinus-Glocke-Verschiebung (SSB) von 2,5-4.
   2. Einrichten, Datensatz und Prozess ein 2D ¹³ C - ¹³ C PDSD mit einem mittleren mischen Zeit Experiment sequentielle ¹³ C - ¹³ C Korrelationen verbinden meist i - i±1, erkennen aber auch i±2 und i±3 Rückstände, je nach Protein Rückgrat Steifigkeit und Sekundärstruktur Elemente. Die Mischzeit sollte zwischen 100-200 ms für einheitlich beschrifteten Proben eingestellt werden. Alle anderen Werte aus den kurzen mischen Zeit 2D ¹³ C - ¹³ C PDSD übernommen werden können.
   3. Einrichten, Datensatz und ein 2D ¹⁵ N - ¹³ C N _ich CA _ich und N _ich CO _ich experimentieren mit einem CP ¹ H - ¹⁵ N und einen bestimmten CP ¹⁵ N - ¹³ C-Transfer-Prozess ⁴². ¹⁵ N - ¹³ C Polarisation Transfer in eine 1D Mode direkt auf das Beispiel von Interesse, basierend auf maximale Intensität im Großraum CA oder Carbonyl bzw. zu optimieren. EiterungCal-Werte für die spezifische CP Kontaktzeit sind zwischen 2 und 6 Ms.
   4. eingerichtet, aufnehmen und Verfahren eine Reihe von 2D ¹⁵ N-(¹³) C - ¹³ C zwecks Zuordnung Experimente.
      Hinweis: Die ersten ¹⁵ N - ¹³ C Polarisation Transfer Parameterwert kann übernommen werden von den N _ich CA _ich / N _ich CO _ich Experimente. Intra-Rückstände Korrelationen sind aus N _ich etablierte Träumen (CA _ich) CB _ich und N _ich (CA _ich) CO _ich, bzw. ⁴³ und PDSD ¹³ C - ¹³ C Polarisation überträgt. Die Rückstände (i) Rückstände (i-1) sequentielle Vernetzung ergibt sich aus N _ich (CO _i-1) CA _i-1 und N _ich (CO _i-1) CX _i-1 Experimente, beide mit einem PDSD ¹³ C - ¹³ C Polarisation Transfer.
   5. Wählen Sie ein NMR-Analyse-Programm wie CcpNmr Analyse ⁴⁴ oder SPARKY ⁴⁵
   6. Laden die 2D Spektren in der Software (Beispiel mit CcpNmr Analyse) und laden Sie die primäre Proteinsequenz.
   7. Beginnen mit der Identifizierung der Aminosäure Arten sichtbar in der kurzen mischen ¹³ C - ¹³ C PDSD Spektrum. Verbinden Sie die Kohlenstoffatome der Spin-Systeme ermöglichen die " Rückstände-Typ " bestimmte Zuordnung; siehe Abbildung 4A für die Zuordnung von Threonin Rückstände. Wie viele Rückstände wie möglich zu identifizieren; Dies hängt von der Proteingröße Untereinheit, die spektrale Auflösung und Verteilung.
   8. Überlagern die kurzen Vermischung mit dem Zwischenprodukt mischen ¹³ C - ¹³ C PDSD Spektrum.
      Hinweis: Die zusätzlichen Gipfel sichtbar in der Mittelstufe-mischen PDSD ergeben sich meist aus sequenziellen (Rückstand ich - Rückstände i±1) Kontakte. Ein Beispiel für eine zwei-Rückstände sequentielle Zuordnung wird in Abbildung 4 b dargestellt.
      1. Markieren die Resonanz Gipfel eines Spin-Systems und Korrelationen in der Mittelstufe-mischen PDSD mit Resonanzfrequenzen von anderen Spin-Systemen zu finden. In kleine Proteine oder Peptide, es kann möglich sein, die gesamte sequentielle Resonanz Zuordnung basierend auf 2D ¹³ C - ¹³ C PDSD Experimente zu erreichen.
         Hinweis: In β-Strang Sekundärstruktur Motive Rückstände könnte i - Rückstände i±2 ¹³ C - ¹³ C Kontakte intensiver Signale als sequentielle Kontakte aufgrund ihrer Nähe im Raum zeigen; im α-helikale Sekundärstruktur Motive Rückstand i - Rückstände i±3 ¹³ C - ¹³ C Kontakte führen auch zu intensive Signale.
   9. Wenn Intermediate-mischen PDSD Experimente an selektiv ¹³ C-markierten Proben zur Verfügung stehen, überlagern sie auf das Mischen von kurzen Spektrum (falls vorhanden auf die selektiv ¹³ C beschriftet Probe) und weisen Sie die ergänzenden Gipfel, unter Berücksichtigung der selektiven ¹³ C Kennzeichnung Muster (1,3 - ¹³ C und 2 - ¹³ C Glycerin ^{32 , 33} oder 1 - ¹³ C und 2 ¹³ C Glukose ^{29 , 30 , 31}.
      Hinweis: Z. B. in einem 2 - ¹³ C Glycerin beschriftet Probe mehrere Aminosäure-Arten sind auf die Cα-Position ohne die angrenzenden Kohlebürsten markiert (Cβ und C ') gekennzeichnet, daher bevorzugt die Cα-Cα Transfer zwischen benachbarten Rückstände. In selektiv beschrifteten Proben könnte Langstrecken ¹³ C - ¹³ C Korrelationen bereits im zwischen-mischen ¹³ C - ¹³ C PDSD Experimente aufgebaut werden. Wenn ein Peak durch eine sequenzielle Korrelation erklärt werden kann, könnte es von einem langfristigen Kontakt entstehen. Sehr homogene Untereinheit Strukturen in der makromolekularen Versammlung bestellt, soll nur ein Satz von Resonanzen in den Spektren sichtbar. Wenn verdoppelt (oder weiter multipliziert) Resonanzen sind für ¹³ C-Atome sichtbar oder Protein Rückgrat Strecken, zwei (oder mehr) Konformationen für das Atom oder die primäre Sequenz-Strecke in der Baugruppe bzw. vorhanden.
   10. Nutzen das 2D NCA-Spektrum mit Intra-Rückstand ¹⁵ N - ¹³ Cα Korrelationen, um die ¹⁵ N Resonanzfrequenzen für jede Rückstände zu identifizieren. Wenn die Auflösung in der Dimension ¹³ C nicht ausreicht, verwenden die Zusatzinformationen über die Cβ Resonanz in 2D NCACB Ermittlung die Resonanzfrequenz der Intra-Rückstand ¹⁵ N.
   11. Verwenden Sie die 2D NCACB und NCACO Spektren mit Intra-Rückstand ¹⁵ N - ¹³ C - ¹³ C Korrelationen zu identifizieren (i) die Intra-Rückstände-¹⁵ N-Frequenz und (Ii) Mehrdeutigkeiten in der ¹³ C - ¹³ C zu beheben PDSD mit Hilfe der zusätzlichen ¹⁵ N Dimension. Die Umkehrung des Signals durch die Traum-Abgabe führt zu die Beobachtung von typischen Cα-Cβ Korrelationen für die Cα-Signal positiv ist und negativ Cβ Signal. Weitere Sidechain-¹³ C, wenn in das Spektrum sichtbar sind positive wieder.

Abbildung 4: 2-dimensionale ¹³ C - ¹³ C-NMR-PDSD Experimente auf eine geordnete, einheitlich ¹³ C, ¹⁵ N-markierten Protein Montage. (A) kurze Mischzeit PDSD (50 ms mischen). (B) Zuordnung der 2-Rückstand-Strecke Ile32 - Thr33 mit Überlagerung der kurzen Mischzeit PDSD mit einer lange Mischzeit PDSD (200 ms mischen). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

2. Sekundärstruktur Entschlossenheit
   1. Verwendung ¹³ Cα, ¹³ Cβ chemische Verschiebungswerte zu berechnen, die sekundäre chemische Verschiebung ⁴⁶ ΔδCα-ΔδCβ , bezeichnend für die Sekundärstruktur. ¹³ Cα(assigned) - ¹³ Cα (random Coil) und ¹³ Cβ(assigned) - ¹³ Cβ (random Coil) zu berechnen.
      Hinweis: Chemische Verschiebungswerte für Rückstände in zufälligen Spule Konformation erhalten Sie bei ³⁸.
      1. Grundstück ΔδCα-ΔδCβ, negativen oder positiven Werte für > 3 Rückstände in Folge zeigen bzw. β-Strang oder α-helikale Konformation; Glycin und Prolin Rückstände könnten als ungewöhnlichen chemischen Verschiebungswerte zeigen Sie wirken oft wie " Sekundärstruktur Leistungsschalter ".
   2. Vorhersagen, die Protein Verschneidung Winkel aus den zugewiesenen chemische Verschiebungen mit TALOS + ^{47 , 48} oder PREDITOR ^{49 , 50}. Die vorhergesagten Phi/Psi Verschneidung Winkeln reflektieren die Sekundärstruktur des Proteins subuNit und dienen als strukturelle Beschränkungen im gesamten Modellierungsprozess.
3. Sammlung von strukturellen Beschränkungen
   1. Set oben und ein 2D ¹³ C - ¹³ C PDSD Experiment mit einer lange Mischzeit, weiträumige ¹³ C zu erkennen - ¹³ C Korrelationen aufzeichnen. Typische mischen Mal reichen von 400 ms bis 1 s. verwenden Sie selektiv ¹³ C beschriftet Beispiele wie die Spin-Verdünnung verbessert die Polarisation Transfer unter fernen Kohlebürsten.
   2. Überlagerung der lange mischen 2D ¹³ C - ¹³ C PDSD aufgenommen am selektiv beschriftet Probe auf der Mittelstufe mischen ¹³ C - ¹³ C PDSD, wenn möglich an derselben selektiv beschriftet Probe aufgenommen. Zusätzliche Spitzen ergeben sich aus Korrelationen zwischen weiter entfernten ¹³ C-Atomen. Bei Resonanz Zuordnung, selektive Kennzeichnung System berücksichtigen.
   3. Sorgfältig bewerten die Auflösung des Spektrums eine Zuordnung Toleranzfenster, d.h. abhängig von der spektralen Auflösung Resonanzen in einem bestimmten ppm-Bereich definieren, wie dies mit dem Signal beitragen kann. Die Standardabweichung der Zuordnung Präzision errechnet sich automatisch im NMR Zuordnungsprogramme wie CcpNmr Analyse oder SPARKY.
   4. Wenn ein Signal von einem sequentiellen erklärt werden kann (Rückstand ich - Rückstände i±1) oder einen Mittelstrecken-¹³ C - ¹³ C Kontakt (Rückstände i - Rückstände ich ± 2, 3 oder 4), pflegen diese Zuordnung seit weitergeleitete Polarisation Transfer kann erklären, die Korrelation sogar bei ¹³ C - ¹³ C Abstand oberhalb der erwarteten Kontakt Sichtweite.
   5. Klassifizieren die Zuordnungen von Langstrecken-¹³ C - ¹³ C Kontakte in eindeutige und mehrdeutige Frequenzsignale. Bei eindeutigen Frequenzzuteilungen, nur eine Resonanz Zuordnung ist möglich in Bezug auf die Zuordnung Toleranzfenster.
      Hinweis: Mehrdeutige Zuordnungen enthalten alle möglichen Resonanz Zuweisungen innerhalb der Toleranz. Die Mehrdeutigkeiten können gleichzeitig bei der Berechnung der Struktur durch iterative Runden der Disambiguierung auf Basis vorläufiger Strukturen berechnet nur die eindeutige Beschränkungen, wie in computational Routinen wie ARIA aufgehoben werden ⁵¹ oder UNIO ⁵². Darüber hinaus können Strukturdaten aus verschiedenen biophysikalischen Quellen (z.B. mutiert oder Untereinheit Struktur durch Lösung NMR oder Röntgen-Kristallographie, Masse-pro-Längenmessungen, Cryo-EM-Karte abgeschnitten) auch verwendet werden, für die Verringerung der Mehrdeutigkeit, Beispiele siehe ^{1 , 3 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58}.
4. Erkennung von intermolekulare Abstand Beschränkungen in einer symmetrischen Protein-Baugruppe
   1. ein 2D ¹⁵ N - ¹³ C Schmerz-CP ⁵⁹ Experiment auf einrichten eine gemischte (50/50) U - ¹⁵ N - / U - ¹³ C-Label Probe. Signale auf die Schmerz-CP-Spektrum erkannt sollte Inter molekulare ¹⁵ N - ¹³ C Nähe entstehen. Verwenden Sie die zuvor zugewiesenen Resonanzen um die Zuweisung der intermolekulare Kontakte durchzuführen.
   2. Richten Sie ein 2D ¹³ C - ¹³ C PDSD mit einer lange Mischzeit (> 600 ms) auf ein (50/50) gemischt (1,3 - ¹³ C)-/ (2 - ¹³ C)-Glycerin oder (1 - ¹³ C)-/ (2 - ¹³ C)-Glukose Probe.
      Hinweis: Signale erkannt in diesem ¹³ C - ¹³ C Spektrum ergeben sich aus intramolekularer und Inter molekularen ¹³ C - ¹³ C nähen. Die hohen Komplementarität der beiden Kennzeichnung Regelungen kann jedoch besondere Resonanz Paare eindeutig entstehen zwischen molekularen Kontakte, z. B. Serin CA in der (2 - ¹³ C)-Glukose Untereinheiten, die ein Serin-CB in korrelieren mit der Bezeichnung der (1 - ¹³ C)-Glukose Untereinheiten beschriftet.
      1. Overlay, das Spektrum der Mischprobe zu 2D ¹³ C - ¹³ C Spektren aufgenommen auf homogen beschriftet, Proben ((1,3-¹³C) - und (2 - ¹³ C)-Glycerin oder (1 - ¹³ C)- und (2 - ¹³ C)-Glukose mit der Bezeichnung Proben). Zusätzliche Signale im Spektrum auf der Mischprobe aufgenommen sollte zwischen molekularen Wechselwirkungen entspringen.
5. Struktur Modellierung von NMR-Daten
   1. Vorbereitung der NMR-Zurückhaltung-Listen für die Berechnung der Struktur benötigt: (1) Proteinsequenz; (2) intramolekularer eindeutig Abstand Beschränkungen; (3) intramolekularer mehrdeutige Abstand Beschränkungen; (4) TALOS-basierte Verschneidung Winkel Fesseln; (5) zwischen molekularen eindeutig Abstand Beschränkungen; (6) zwischen molekularen mehrdeutige Abstand Beschränkungen; (7) zusätzliche Daten von anderen biophysikalischen Techniken (z.B. Masse pro Länge, Symmetrie Parameter).
   2. Mehrere Bewertungen geben Einblicke in Struktur Modellierung basierend auf NMR-Daten und in Verbindung mit ergänzenden Strukturdaten ^{14 , 60 , 15 , 19 , 61 , 62} beachten Sie, dass mehrdeutige Abstand Beschränkungen bei der Berechnung der Struktur in Bezug auf die vorläufige geklärt werden können strukturelle Modelle basieren auf eindeutigen Abstand Beschränkungen. Um Struktur Genauigkeit zu gewährleisten, sorgfältig zu beobachten, wenn die Struktur zu einem einzigen Falte konvergiert.

Abbildung 5 : Intra - und intermolekularen Kontakte in symmetrischen Proteins Baugruppen. Schematische Darstellung der Intra - und intermolekularen ¹³ C - ¹³ C weitreichende Kontakte in einer spiralförmigen makromolekularen Assembly. Die Untereinheiten sind farbig in weiß und rot zur Veranschaulichung der gemischten Kennzeichnung der Untereinheiten; d. h. vor der Montage eine 1:1 Mischung aus zwei unterschiedlichen Kennzeichnung Regelungen erfolgte (z.B. 1 - ¹³ C Glukose und 1 - ¹³ C Glukose). A) intramolekulare ¹³ C - ¹³ C langfristige Kontakte (blau gestrichelte Pfeil); B) intermolekulare ¹³ C - ¹³ C langfristige Kontakte (rot gestrichelte Pfeile). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Results

Der typische NMR-Workflow umfasst mehrere Schritte, die in Abbildung 1dargestellt. In der Regel sind die Protein-Untereinheiten von in-vitro- heterologen Expression in E. Coliproduziert, gereinigt und montiert unter schütteln, aber manchmal auch unter statischen Bedingungen. Ausdruck und Reinigung des Protein-Untereinheit folgen SDS-Gel-Chromatographie (Abbildung 2A). Die Bildung von makromolekularen Versammlungen kann dann durch Elektronenmikroskopie (EM) Analyse bestätigt werden (siehe Abb. 2 b für ein Beispiel einer faserigen Versammlung).

Nach Einführung der Protein-Versammlung in der NMR-Rotor der Rotor wird eingefügt in das Spektrometer, MAS Frequenz und Temperatur geregelt und die Spektren aufgezeichnet. Erste Einblicke erhalten Sie von 1D NMR-Techniken. Abbildung 3 zeigt eine typische NMR FID erkannt auf dem ¹³C-Kanal auf einer Stichprobe von strukturell homogenen Protein, ein ¹H -¹³C CP Spektrum, enthüllt die¹³C Resonanzen im starren Kern der Protein-Untereinheit in der Montage und ein 2D ¹H -¹³C UNFÄHIGEN Spektrum, repräsentieren die mobile Rückstände. Für atomare Einblicke in den starren Kern der Baugruppenstruktur müssen multidimensional NMR-Experimente auf aufgezeichnet werden einheitlich und selektiv beschriftet Proben weisen Sie zuerst die NMR-Resonanzen und dann erkennen Langstrecke Nähen (siehe Abb. 4 ).

Alle Spektren werden verarbeitet und analysiert mit entsprechender Software zuweisen die NMR-Resonanzen und Extrahieren von Intra- und intermolekularen Abstand Beschränkungen (Abbildung 5). Die NMR Abstand Beschränkungen dienen entweder allein oder in Verbindung mit Daten aus komplementären Techniken, die in dem Modellierungsprogramm integriert werden können.

Abbildung 6 veranschaulicht für repräsentative Atomstrukturen makromolekularen Versammlungen durch NMR-Techniken gelöst mehrere filamentöse Baugruppen aus bakteriellen Anhängsel und Amyloid-Fibrillen.

Abbildung 6:filamentösen makromolekulare Strukturen bestimmt durch einen Festkörper-NMR-Ansatz: bakterielle Filamente und Amyloid-Protein Fibrillen. A) Typ1 Pilus von adhärent E. Coli, PDB Code 2N7H ⁴; B) ASC Filament, PDB Code 2N1F ⁶³; ( C) Typ-III-Sekretion System Nadeln, PDB-Codes 2MME, 2LPZ und 2MEX zu ^2,3,64; D) PDB Code 2NAO, 5KK3, 2MXU ^65,66,67 , Amyloid-Beta-AB42-Fibrillen und Osaka mutierten PDB Code 2MVX ⁵⁷, Iowa mutierten PDB Code 2MPZ ⁵⁸; E) Alpha-Synuclein Fibrillen, PDB Code 2N0A ⁶⁸; F) HET-s Prion Domain, PDB Code 2RNM, 2KJ3 ^69,70. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Festkörper-NMR (NMR) ist eine Methode der Wahl für die Charakterisierung von Proteinen makromolekularen Versammlungen auf atomarer Ebene. Eines der zentralen Themen in NMR-basierte Strukturaufklärung ist die spektrale Qualität des untersuchten Systems, das ermöglicht die Schaffung struktureller 3D-Modelle von verschiedenen Präzision, in der Regel reichen von niedrig aufgelöste Modelle (mit den sekundären Elemente und wenig 3D Informationen strukturieren), Pseudo-3D Atomstrukturen. Die Quantität und Qualität von strukturellen Informationen aus mehrdimensionale NMR-Experimente ist der Schlüssel um eine hochauflösende NMR-Struktur der Versammlung zu berechnen.

Das beschriebene Protokoll stützt sich auf die Erkennung von ¹³C -¹³C und ¹⁵N -¹³C strukturelle Beschränkungen, erfordern die Aufnahme von mehreren 2D (und manchmal 3D) Spektren mit hohen Signal-Rausch. Bei moderaten MAS Frequenzen (< 25 kHz), die Probe wird in Rotoren mit Größen von 3,2-4 mm Durchmesser ermöglicht Proteinmengen von bis zu ~ 50 mg, abhängig von der Probe Hydratation eingeführt. Die Menge der Probe in der Rotor ist direkt proportional zu den Signal-Rausch-Verhältnis in NMR-Spektren, ein entscheidender Faktor für die Erkennung von weiträumigen Entfernung Fesseln und ihre eindeutige Zuordnung.

Die spektrale Auflösung ist ein entscheidender Parameter bei der sequentiellen Resonanz-Zuordnung und die Fesseln-Sammlung. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, müssen die Probe Vorbereitung Parameter optimiert werden, besonders bei der Reinigung der Untereinheit und Montagebedingungen (pH-Wert, Puffer, Zittern, Temperatur, etc.). Für Probe-Optimierung empfiehlt es sich, unbeschriftete Proben vorzubereiten für mehrere unterschiedliche, die Bedingungen für die Montage beobachtet wurde, und ein 1D ¹H -¹³C CP Spektrum (in Schritt 2.1 beschrieben) auf jede vorbereitete Probe aufzeichnen. Die Spektren dienen zu vergleichen, spektrale Auflösung und Streuung zwischen den verschiedenen Zubereitungen, basierend auf deren optimalen Bedingungen ermittelt werden können.

Die Qualität der NMR-Daten hängt stark von der Wahl der NMR-Aufnahmeparameter, vor allem für die Polarisation Transfer Schritte. Die Verwendung von hohen Magnetfeldstärken ( ¹H-Frequenz ≥600 MHz) ist Voraussetzung für hohe Empfindlichkeit und spektrale Auflösung erforderlich, wenn komplexe Ziele wie makromolekularen Protein Baugruppen vor.

Ein limitierender Faktor in vielen Fällen ist die Spektrometer-Verfügbarkeit. Daher sollte eine vernünftige Auswahl der Proben vorbereitet werden die Spektrometer-Sitzung vorausgehen. In jedem Fall, eine einheitlich ¹³C, ¹⁵N beschriftet Probe ist eine Voraussetzung für die sequentielle und Intra residual Resonanz Zuweisung durchzuführen. Proteine vom Festkörper-NMR-Techniken finden Sie unter⁷¹. Strukturaufklärung von makromolekularen Versammlungen auf moderate MAS Frequenzen erfordert selektiv ¹³C-markierten Proben; für die Erkennung von Langstrecken- ¹³C -¹³C und ¹³C -¹⁵N Proben basierend auf 1,3 - Kontakte¹³C- und 2 -¹³C-Gylcerol und/oder 1 -¹³C- und 2 -¹³C-Glukose Kennzeichnung sind häufig verwendet, wie oben beschrieben. Die Wahl zwischen zwei Kennzeichnung Systeme basiert auf der spektralen Signal-Rausch-Verhältnis und der Auflösung. Zur Unterscheidung zwischen Intra- und intermolekularen weitreichende Kontakte ergaben beschriftete und verdünnte Mischproben effizient.

Kurz gesagt, die entscheidenden Schritte für eine atomare NMR strukturelle Studie sind: (i) die Vorbereitung der Untereinheiten und Montage müssen optimiert werden, ausgezeichnete Probenmenge und Qualität zu erhalten, (Ii) Spektrometer-Parameter für Feld Stärke "und" Erwerb müssen sein sorgfältig ausgewählt; (Iii) selektive Strategien zur Kennzeichnung sind erforderlich für eine 3D-Struktur und die erforderliche Datenmenge hängt die Qualität der Daten und der Verfügbarkeit von ergänzenden Daten.

Trotz seiner Anwendbarkeit auf eine Vielzahl von supramolekularen Systemen von Membranproteinen bis hin zu Homomultimeric Nano-Objekte ist NMR oft durch die Notwendigkeit der mg-Mengen isotopisch beschriftete Material begrenzt. Die jüngsten technologischen Entwicklungen in Ultra-schnelle MAS (≥100 kHz) NMR eröffnen die Allee ¹H erkannt NMR, und schieben die Grenze der geringe Probenmenge zu Sub-mg ^72,73,74. ¹³C-markierten Proben sind für strukturelle Detailstudien jedoch unverzichtbar, die schränkt die Anwendung der NMR Proben montiert in Vitro oder Systeme ausgedrückt in Organismen, die auf minimaler Medium zu, wo überleben in der Zelle NMR ist eine neue Methode (für Bewertungen ^75,76,77,78siehe).

Ein wichtiger Faktor im NMR Anwendung, hochauflösende 3D Strukturen zu erhalten ist die spektrale Auflösung: intrinsische Konformationsänderungen Heterogenität in einer Baugruppe kann Auflösung und Spektren Spektralanalyse einschränken. Rückstände spezifische ¹³C Kennzeichnung können in manchen Fällen eine Alternative zu bestimmten Abstand über strategische Rückstände zu informieren um strukturelle Modelle (für eine aktuelle Beispiele siehe ^79,80) zu erhalten.

NMR für 3D Strukturbestimmung erfordert noch die Sammlung von mehreren Datensätzen mit oft langen Daten Abholzeiten auf ausgefeilte Instrumente, je nach der Ansatz und das System mehrere Tage bis Wochen auf einem 600-1000 MHz (¹H-Frequenz) Spektrometer. Daher kann der Zugang zum Spektrometer Zeit ein limitierender Faktor in einer eingehenden Studie NMR.

Bei Homomultimeric Protein Baugruppen zur NMR-Daten von ausreichender Qualität, eine hohe Anzahl von strukturellen Beschränkungen wie in ^3,57,64,70, NMR zu identifizieren gibt immer noch keinen Zugang zu den mikroskopischen Dimensionen. Daher ergänzen eine de Novo NMR Strukturaufklärung einer Homomultimeric Versammlung, EM oder Masse pro Länge (MPL) Daten im Idealfall NMR-Daten, um die Symmetrie Parameter ableiten. NMR-Daten allein bieten die atomare Intra- und intermolekularen Schnittstellen

NMR ist höchst komplementär mit strukturellen Techniken wie EM oder MPL Messungen, sondern die Daten ist auch perfekt kombinierbar mit atomaren Strukturen durch Röntgen-Kristallographie oder Lösung NMR auf mutierte oder abgeschnittene Untereinheiten erhalten. Eine wachsende Zahl von Studien kann in Literatur gefunden werden, wo die Verbindung von verschiedenen Strukturdaten zur Bestimmung atomarer 3D-Modelle von makromolekularen Versammlungen (siehe Abbildung 6 für repräsentative Beispiele) erlaubt hat.

Im Bereich der Strukturbiologie entpuppt sich NMR als vielversprechende Technik studierenunlösliche und nichtkristalline Assemblys auf atomarer Ebene, d. h. die Strukturdaten auf atomarer Skala. In dieser Hinsicht NMR ist das Gegenstück zur Lösung NMR und Röntgen-Kristallographie für molekulare Baugruppen, einschließlich Membranproteine in ihren nativen Umgebung und Protein Versammlungen wie virale Umschläge, bakterielle Filamente oder amyloiden sowie RNA und RNA-Protein-komplexe (siehe zum Beispiel⁸¹). Die äußerst vielseitige Anwendungen in-vitro- und in der zellulären Kontext, z. B. verfolgen von sekundären, tertiären und quartären strukturelle Änderungen, Interaktion Oberflächen mit Partner Moleküle auf atomarer Skala (z. B. ⁸²) zu identifizieren und Mapping Molekulardynamik im Zusammenhang mit der montierten Anlagen zeigen das wichtige Potenzial der NMR in zukünftige strukturelle Studien bei komplexen biomolekularen Baugruppen.

Komponente	M9 medium
NaCl	0,5 g/L
KH2PO4	3 g/L
Na2HPO4	6,7 g/L
MgSO4	1 mM
ZnCl2	10 ΜM
FeCl3	1 ΜM
CaCl2	100 ΜM
MEM-Vitamin-Mix 100 X	10 mL/L
13 C-Glukose	2 g/L
15 NH4Cl	1 g/L

Tabelle 1: Zusammensetzung des Mediums minimale Ausdruck für rekombinante protein Produktion in E. Coli BL21 Zellen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
NMR Spektrometer (> 11,7 Tesla)	Bruker-Dreifachresonanz
MAS SSNMR Sondenkopf	Bruker-SSNMR
Bremsscheiben 4mm	Bruker	K1910
Zentrifuge 5804 R	Eppendorf	5805000629
GeneQuant 1300 Spektrometer	Dutscher	28-9182-13
IGS60 INKUBATEUR HERATHERM 75 L	Dutscher	228001
MaxQ 4450 Tisch-Orbitalschüttler	Dutscher	78376
Rohrrevolver Rührwerk	Dutscher	79547
sonopuls HD 3100	Bandelin	3680
MicroPulser Elektroporator	Biorad	165-2100
mini-PROTEAN Tetrazellsystem	Biorad	165-8000
AKTA reines System	GE Healthcare	29-0182-24
Kapillar-Microman M25 Pipette	Gilson	F148502
Name	Company	<>Katalognummer	Kommentare
Materials
amiconR ultra-15	sigma	Z740199-8EA
Kapillaren und Kolben	Gilson
Spachtel	Fisher	13263799
Name	<>Unternehmen	Katalognummer<	>Kommentare
>Reagenzien
D-Glucose 13C6	Sigma	389374
Ammonium-15N-chlorid	Sigma	299251
1,3 13C2 Glycerin	Sigma	492639
2 13C Glycerin	Sigma	489484
Kanamycin	Sigma	K1876
Carbenicillin	Sigma	C3416
Natriumphosphat zweibasisch	Sigma	S7907
Kaliumphosphat monobasisch	Sigma	P5655
Natriumchlorid	Sigma	71380
Calciumchlorid	Sigma	C1016
Magnesiumsulfat	Sigma	208094
Eisenchlorid	Sigma	157740
Zinkchlorid	Sigma	793523
MEM Vitaminlösung (100&mal;)	Sigma	M68954
IPTG	Fisher	BP1755
Trizma Sockel	Sigma	T1503
Tricin	Sigma	T0377
SDS	Sigma	436143
Natriumazid	Sigma	71289
4,4-Dimethyl-4-silapentan-1-sulfonsäure	Sigma	178837
Name	<>Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Softwares
Unicorn 6.3	GE Healthcare		Akta systems
ccpNMR	CCPN		Spektrometer-Systeme