Summary
Denne protokol beskriver en noninvasiv teknik til prøveudtagning af uforstyrret slimhindebelægning væske fra de øvre luftveje. Det kan bruges til at udføre kvantificering af in vivo -niveauer af protein mæglere, såsom cytokiner og kemokiner, i emnerne i alle aldre.
Abstract
Denne protokol beskriver noninvasive prøveudtagning af uforstyrret øvre luftveje slimhindebelægning væske. Det beskriver også den ekstraktionsmetode, der anvendes før analysen af immun mæglere i væske eluater for studiet af luftvejene aktuel immun signatur, uden behov for stimulation procedurer (ofte bruges af andre teknikker). Slimhindebelægning væske er udtaget på en strimmel papir, filter placeret på den forreste del af ringere turbinate og venstre for 2 min af absorption. Analysander er elueret fra filter papirer, og de udpakkede proteinbaseret eluater analyseres af en electrochemiluminescence-baseret immunassay, giver mulighed for en høj følsomhed kvantificering af lav og høj niveau analysander i samme prøve. Vi målte in vivo -niveauer af 20 forudvalgt immun mæglere relateret til specifikke immun signalering veje i de øvre luftveje slimhinde, men teknikken er ikke begrænset til at bestemt panel eller prøvetagningsstedet. Teknikken blev først gennemført i 7-årige børn fra København Fremtidsstudier på astma i barndommen2000 (COPSAC2000) kohorte med allergisk rhinitis. Det blev derefter brugt i den langsgående COPSAC2010 fødsel kohorte, stikprøven på 1 måned, 2 år og 6 år, og i tilfælde af akut luftvejssymptomer. Vi med held fremstillet og analyseret prøver fra 620 (89%) af 700 1 måned gamle børn, et par prøver blev under analysen detektionsgrænse (rapporteret som median (inter kvartilen vifte (IQR)). Antallet af prøver under detektionsgrænsen (dvs. fra 0 til sætpunktet for den nedre grænse for opdagelse) for hver mægler blev 29 (7,25-119,5). Denne teknik giver mulighed for kvantificering af in vivo luftvejene slimhinde immun profil fra fødslen, kan anvendes på langs, og kan anvendes til undersøgelser af virkningen af genetik og opvækst miljømæssige eksponeringer, Patofysiologi, endotyping og overvågning af luftvejssygdomme, og udvikling og evaluering af roman therapeutics.
Introduction
Slimhindebelægning væske af næsen udgør den flydende del af øvre luftveje system. Det består af en kompleks matrix af mæglerne stammer fra samspillet mellem epitel og immunceller, der udgør den første linje i forsvaret mod invaderende mikroorganismer. Næseslimhinden er let tilgængeligt, og der er en stærk funktionel og immunologiske forhold mellem næsen og bronkier1. Dette rum er af særlig interesse i forhold til luftvejs-sygdomme, der er almindelige i barndommen, som astma og allergisk rhinitis, men også en række andre luftvejslidelser mere udbredt senere i livet.
Her, beskriver vi gennemførelsen af en metode til at prøve uforstyrret slimhinderne foring væske fra næsehulen ved hjælp af et filter papirbaserede, noninvasiv teknik, samt en efterfølgende ekstraktionsmetode, bruges til at eluere proteinbaseret analysander fra papirfiltre forud for deres kvantificering. Denne teknik kan eksempelvis bruges til at få i vivo immun underskrifter fra både raske personer og personer med forskellige luftvejssygdomme. Derudover er det muligt at undersøge engagementer af betydning for en bestemt immun signatur og at vurdere, om det er en prædiktor eller mægler for senere udvikling af sygdom.
Slimhindebelægning væske har tidligere opnået ved nasal lavage2, som ofte indledes med en nasal udfordring test, hvor et allergen er indført i høj grad til at stimulere en inflammatorisk respons3,4. Men nasal lavage teknik er ikke muligt i småbørn og introducerer en ukendt fortyndingsfaktoren, som tilintetgør resultaterne, som den fortyndede mægler niveauer kan falde til under detektionsgraensen for assay5. Desuden, på grund af ukendte fortyndingsfaktoren, målte analysand svar fra nasal udfordring test er ikke sammenlignelige mellem individer, dermed begrænse nytten af nasal lavage teknik i en kohorte indstilling. Endelig allergen udfordring er kun gældende i overfølsomme over fag, og andre udfordringer, såsom histamin udfordring, er ikke fysiologisk relevante, hvilket potentielt medfører en loft virkning på mediator release. Disse problemer er omgået i præsenteres filtrerpapir-baseret teknik for slimhindebelægning væske samling, hvor den enkelte sekretion af væsker og analysanden niveauer er de eneste faktorer, der påvirker mellem individuelle afvigelse.
Under ekstraktionsmetode, er analysander elueret fra papirfiltre efter tilsætning af identiske diskenheder buffer til alle prøver. Det favoriserer lignende ex vivo fortynding af alle prøver. En ekstraktionsbuffer af albumin-baserede isotonisk saltopløsning bruges til ekstraktionstrinet; Det gør det muligt for udvinding af protein-baserede mæglere og stabiliserer proteiner for at begrænse denaturering under den efterfølgende nedfrysning af elueret proteiner inden kvantificering. For at undgå protein nedbrydning under ekstraktionen fase, er en cocktail for proteasehæmmere tilføjes ekstraktionsbuffer.
Gennemførelsen af teknikker, der giver mulighed for kvantificering af uforstyrret, i vivo-genererede immun mæglere på slimhinden steder er af allerstørste betydning. Først, den slimhinde site gør op den største immunologiske organ i kroppen. For det andet den nasale placering er den primære lokalitet af luftbårne eksponering og er tæt forbundet med den respiratoriske immunologiske rum i lungerne1. For det tredje åbner muligheden for landmåling dette vigtige organ med en noninvasiv teknik mulighed for at give et væld af oplysninger om den vigtige mikrobe-immune interaktion akse i forhold til sundhed og sygdom i luftvejene. For det fjerde er der mange andre mulige anvendelser af denne teknik, som studerer lokale immunologiske forandringer i randomiserede, kontrollerede forsøg hos narkotika og mikronæringsstoffer.
Vi gennemført i første omgang teknikken i København Fremtidsstudier på astma i barndommen2000 (COPSAC2000) kohorte, hvor vi bestemt immun profilen af slimhindebelægning væske i 7-årige børn med allergisk rhinitis versus raske kontrolpersoner13. Efterfølgende, anvendt vi med succes denne teknik til langsgående COPSAC2010 kohorte og vurderet luftvejene immun profiler på 1 måned, 2 år og 6 år, og i tilfælde af akut luftvejssymptomer. Resultater fra 1-måned-forhenværende nyfødte har vist vigtige tilknytninger mellem immun signatur og opvækst miljøeksponering7,8,9,10,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelserne blev gennemført i overensstemmelse med hovedprincipperne i Helsinki-erklæringen. Godkendelser fra den etiske komité for København (KF 01-289/96 til COPSAC2000 ) og H-B-2008-093 for COPSAC2010og Dansk Data Protection Agency blev indhentet, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra begge forældre for hvert emne før tilmelding.
1. eksperimentel opsætning
- Brug ark filtrerpapir (fibrøst hydroxyleret-polyester ark, se Tabel af materialer)6,7.
- Skære strimler 3 x 15 mm i størrelse for et 1 måneder gammelt barn og i en L-form for ældre børn og voksne (5 x 20 x 10 mm (korte arm af L)).
- Indsætte et stykke filtrerpapir ind i hvert næsebor et spædbarn med pincet. Placer filtrerpapir på den forreste del af ringere turbinate (ca. 1 cm inde i næsebor for nyfødte og 1,5 cm for alle andre aldre).
- Placer nyfødte på en seng og give dem sukker vand for komfort.
Bemærk: For børn i alle andre aldre, prøveudtagning udføres nemmest med emnet siddende på en stol. - For ældre børn, skal du indsætte den lange arm af filtrerpapir L-formet i hvert næsebor.
- Placer nyfødte på en seng og give dem sukker vand for komfort.
- Anvende en næse klip omkring næseborene at minimere ubehag og undgå utilsigtet tab af filtrerpapir.
- Fjerne papirfiltre efter 2 min af absorption.
- Læg papirfiltre i mærket rør og fryse dem straks ved-80 ° C.
- Noter eventuelle symptomer på luftvejene infektion vist af barnet på dagen for prøveudtagning.
- Registrere eventuelle nysen, vedvarende gråd, eller epistaxis, der opstår under 2 min efter prøveudtagningen.
2. kvantificering af luftvejene immun-mæglere
- Tage op til 10 hapsprøver fra fryseren. Optage identifikationsnumre. Holde prøver på is under hele arbejdsprocessen.
- Efter optøning på is, fordybe papirfiltre (per emne) fra begge næsebor i 300 µL af frisklavede buffer (Se Tabel af materialer) indeholdende en komplet protease hæmmer tablet (Se Tabel af materialer) per 25 mL af buffer.
- Justering af lydstyrken for buffer pr størrelsen på papiret, filter.
- Bruge 300 µL af buffer til papirfiltre 3 x 15 mm i størrelse.
- Hvis kun én filtrerpapir er tilgængelig, brug halv buffer volumen (150 µL).
- Justering af lydstyrken for buffer pr størrelsen på papiret, filter.
- Overføre prøverne til en plade shaker (400 rpm) i 5 min. Brug en timer.
- Overføre fugtig papirfiltre og analysebuffer til en celluloseacetat tube filter (0,22 µm porestørrelse) placeret i en microcentrifuge kop tube (Se Tabel af materialer).
- Der centrifugeres ved 16.000 x g i 5 min i en kølet centrifuge (ved 4 ° C) til at hente filtrerede nasal ekstrakt i røret.
- Fjerne kop og holde rør på is mens aliquoting den nasale ekstrakt i wells af lav-protein bindende opbevaring plader (Se Tabel af materialer).
- Opbevares ved-80 ° C indtil analyse.
- Bestemme koncentrationen af cytokiner og kemokiner i de nasale ekstrakter ved hjælp af en høj følsomhed, electrochemiluminesce-baserede multipleksede array system (Se Tabel af materialer).
Bemærk: En menneskelig 10-plex TH1/TH2 cytokin assay, 9-plex chemokine assay, og single-plex IL-17A, TGF-B1, og TSLP blev udført her.- For assays, Inkuber de nasale ekstrakter natten over ved 4 ° C. Foretage målinger som per standard fabrikanten protokol (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Immunassays (Se Tabel af materialer) typisk har et højt dynamikområde til målingen svinger mellem 1 & 10.000 pg/mL, men for nogle assays, kan det være 100.000 pg/mL. Det betyder, at alle prøver kan køre på den samme fortynding, hvilket vil begrænse indflydelsen af forskellige fortyndinger i raske og syge emner, som er tilfældet i andre lignende immunassays. Den nedre grænse for registrering af alle cytokiner var 1 pg/mL eller derunder, og for kemokiner, det varierede mellem 1 & 50 pg/mL. TSLP var ikke påviselig i 98% af prøverne på 1 måned gammel.
- For assays, Inkuber de nasale ekstrakter natten over ved 4 ° C. Foretage målinger som per standard fabrikanten protokol (Se Tabel af materialer).
3. statistik
- Log-transform data, før analyse at få normalt distribuerede residualer af cytokin og chemokine niveauet.
- Hvis prøverne er analyseret i mere end én batch, rette cytokin og chemokine data for batch-wise centrering på den log-transformeret data.
- Indarbejde den samlede middelværdi og anti-log transformation til at indhente data i de oprindelige måleenheder.
Bemærk: For hvert sæt af analyser udført, Overvej at justere variabler, der påvirker niveauet af cytokiner og kemokiner. Dette kunne være maternel påvirkninger (f.eks. indtagelse af alkohol og rygning under graviditeten), amning, utilsigtede hændelser under prøvetagning, søskende, kæledyr i de hjem, osv.
- Indarbejde den samlede middelværdi og anti-log transformation til at indhente data i de oprindelige måleenheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den teknik, der præsenteres her, var vi i stand til at bestemme den i vivo øvre luftvejs slimhinde immun profil hos børn fra så tidligt som 1 måned af alder, som ikke er blevet gjort tidligere. Vi observeret, at tilstedeværelsen af specifikke luftvejs bakterier og picornaviruses7,11, samt andre præ- og perinatal engagementer, var spejlet i luftvejene immun profil af nyfødte. Desuden, vi brugte disse luftvejene immun profildata til undersøgelse af virkningsmekanismen af en randomiseret mikronæringsstoffer prøveversion af høj-dosis vitamin D. Disse resultater understreger gyldighed og nytte af slimhindebelægning væske teknik som en noninvasiv Samplingteknik for efterfølgende i vivo kvantificering af luftvejene immun mæglere.
Følgende punkter er værd at overveje før metodeimplementering: for at måle cytokiner i matrixen slimhindebelægning væske, er det vigtigt at bruge høj-følsomhed-baseret immunassay metoder, der leveres af electrochemiluminescence protokoller. Brug af enzym-forbundet immunassays kan føre til inferens i absorbans udlæsning. Desuden, selv om der er en stærk sammenhæng mellem næsen og bronkier, måling af den immun profil i de øvre luftveje er stadig en begrænsning. Prøveudtagning blev udført på den øverste del af det slimhinde lag; Vi forventer således, at væsken hovedsagelig repræsenterer sammensætningen af gel lag, ikke sol lag. Vi ikke måle mukøse lag markører for at bekræfte det, som er en begrænsning. Individuelle variationer i nasal væske udskillelse kan i teorien påvirke de fundne niveauer af cytokiner og kemokiner. Men vi har kunnet identificere klar og varierende immunologiske fænotyper som svar på forskellige eksponeringer7,8,9,10,11,12, der angiver, at Inter individuelle variationer i nasal sekretion dynamics ikke kan være en stor hindring for denne teknik. Mens de udfører teknikken, er det vigtigt at udføre alle procedurer ved lave temperaturer (is-kølet) at undgå protein nedbrydning under behandlingen. Protein nedbrydning kan reduceres yderligere ved at tilføje proteasehæmmere anbefalede protein til protein ekstraktionsbuffer.
Ikke desto mindre er styrken af denne teknik, at det er noninvasive og nem at udføre aktivering langsgående vurderinger af slimhinde luftvejene immun underskrift fra den neonatale periode og fremefter. Sådanne oplysninger kan potentielt give viden om hvordan det lokale luftvejene immunsystemet modnes og udvikler hele barndommen og ind i voksenalderen. Derudover prøveudtagning teknik udføres uforstyrret og i en in vivo -relevante, ufortyndet måde, som aktiveret påvisning af immun mæglere, der ville have været målbart med nasal lavage teknik, hvor en ukendt fortyndingsfaktoren reducerer gyldigheden af resultaterne13. Vi brugte en syntetisk, fibrøst, hydroxyleret-polyester medium, der er kommercielt tilgængelige (Se Tabel af materialer) og er designet til prøven indsamling, opbevaring og konjugat frigivelse. Materialet er hydrofile, med lav Biomolekylær bindende, og protein-holdige prøver er stabile ved opbevaring ved-80 ° C. Materialet er meget absorberende, og fiber overflader er blevet ændret for at forbedre vand befugtningen.
I COPSAC2010 undersøgelse, har vi valgt et panel af 21 cytokiner og kemokiner der blev valgt en på forhånd til at repræsentere store phenotypical veje af immunsystemet handle lokalt i luftvejene. Kun én af disse mediatorer, TSLP, var ikke kan spores på én måned efter alder.
En vigtig fremtidig anvendelse ville være at indsamle slimhindebelægning væske fra de nedre luftveje (f.eks. ved hjælp af bronchoscopic microsampling teknikken) at vurdere nedre luftveje immunologi. Bronchoscopic microsampling er en ny procedure for bronchoscopic diagnose, i stand til at samle lokale bronchiale epitel foring væske; Det udnytter en beklædt polyester fiber sonde14. Når de distale airways er nået, er sonden skubbet ud af kappe-tip til at absorbere den bronchiale epitel væske til stede i de bronchiale lumen. Bronchoscopic microsampling har været anvendt i akut respiratorisk distress syndrom14,15,16 og kronisk obstruktiv lungesygdom17. Men i astma, et eksisterende problem er, at sonden kan forårsage blødning på grund af sygdom-induceret epitelial skrøbelighed og øget vascularization. Anvende slimhindebelægning væske teknikken til bronchoscopic microsampling procedure kunne har vigtige kliniske implikationer i forbindelse med vores forståelse af patofysiologien samt overvågning, behandling af og forudsige resultatet af flere akutte og kroniske lungesygdomme hos både børn og voksne.
Alle typer af mæglere kan teoretisk måles ved hjælp af multiplex immunassay platform af kommercielle systemet bruges her (Se Tabel af materialer). Platformen giver mulighed for høj følsomhed og nøjagtig kvantificering af en mægler som et par af monoklonale antistoffer gælder for udviklingen af et immunoassay kan opnås. Denne platform også bringer med det høje præcision og mindre følsomhed over for pH, temperatur og viskositet variationer i væsker der skal analyseres.
I fremtidige undersøgelser, det ville være af stor værdi at udvide panelet nuværende af immunsystemet mæglere til måling af, for eksempel: antimikrobielle peptider; samlede og specifikke IgA; akut-fase reaktanter, såsom C - reaktivt protein; lipid mæglere, såsom prostaglandiner; og neurologiske mæglere, såsom hjerne-afledte neurotrope faktor (BDNF). Dette kunne give en mere detaljeret visning af naturen af slimhinde response system på et websted for kroppen med omfattende luftbårne eksponering. De foreslåede mæglere kan enten måles ved hjælp af målrettede kvantitative Højfølsom immunassays, som i den aktuelle opsætning eller ved målrettede eller ikke-målrettede Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi- eller Liquid Chromatography-massespektrometri (LC-MS)-baseret metabolomics teknikker. Den sidstnævnte metode er allerede blevet gennemført til en vis grad med metoden udåndede ånde kondensat, som har nogle metodologiske ulemper med hensyn til prøveudtagning af biofluid18 , ikke der er synlige for slimhindebelægning væske teknik.
Langsgående prøveudtagning fra perioden neonatal ind i voksenalderen, som udføres i COPSAC2010 kohorte, vil i høj grad øge vores forståelse af underliggende immunologiske faktorer forud eller optræder samtidig med luftvejene sygdomme som astma og allergi. Sådanne resultater kan være vigtigt at udviklingen af roman therapeutics målretning specifikt sygdomme endotypes og undersøgelsen af mikronæringsstoffer og narkotika virkningsmekanismer i randomiserede kliniske forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklære nogen potentielle, opfattede eller reel interessekonflikt med hensyn til indholdet af dette manuskript. De finansielle organer har ikke nogen rolle i design og udførelse af undersøgelsen; indsamling, forvaltning og fortolkning af data; eller forberedelse, gennemgang og godkendelse af manuskriptet. Ingen farmaceutisk virksomhed var involveret i undersøgelsen.
Acknowledgments
Vi udtrykker vores taknemmelighed over for børn og familier af COPSAC2010 kohorteundersøgelse for al deres støtte og engagement. Vi anerkender og værdsætter COPSAC forskning team og den tekniske hjælp fra tekniker Lisbeth Buus Rosholm, Danmarks Tekniske Universitet, til måling af cytokiner og kemokiner unikke indsats.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| Low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
References
- Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), Supplement 147-334 (2001).
- Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), Supplement 414-441 (2005).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
- Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
- Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
- Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
- Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
- Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).
