Monitorização da libertação de cálcio ER / SR com o Ca 2+ Captador

Resumo

Apresentamos protocolos para a aplicação de nosso indicador de cálcio codificado geneticamente codificado (GECI) CatchER ⁺ para monitorar transientes rápidos de cálcio no retículo endoplasmático / sarcoplasmático (ER / SR) de HEK293 e células C2C12 de músculo esquelético usando microscopia de fluorescência em tempo real. Um protocolo para a medição e calibração in situ K _d também é discutido.

Resumo

Os transientes intracelulares de cálcio (Ca2 ⁺ ) evocados por estímulos extracelulares iniciam uma multiplicidade de processos biológicos em organismos vivos. No centro da libertação de cálcio intracelular estão as principais organelas de armazenamento de cálcio intracelular, o retículo endoplasmático (RE) eo retículo sarcoplasmático (SR) mais especializado nas células musculares. A liberação dinâmica de cálcio a partir destas organelas é mediada pelo receptor de rianodina (RyR) e pelo receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) com reenchimento ocorrendo através da bomba sarco / retina de cálcio reticular ATPase (SERCA). Um sensor de cálcio geneticamente codificado (GECI) chamado CatchER foi criado para monitorar a rápida liberação de cálcio do ER / SR. Aqui, os protocolos detalhados para a transfecção e expressão do GECI CatchER ⁺ melhorado em células HEK293 e C2C12 direccionadas para ER / SR e a sua aplicação na monitorização de transiente de cálcio mediado por bomba IP3R, RyR e SERCAS em células HEK293 utilizando microscopia de fluorescência é delineada. O agonista ou inibidor de receptor de escolha está disperso na solução de câmara e as alterações de intensidade são registadas em tempo real. Com este método, observa-se uma diminuição do cálcio ER com a activação de RyR com 4-cloro-m-cresol (4 cmc), a activação indirecta de IP3R com adenosina trifosfato (ATP) ea inibição da bomba SERCA com ciclopiazónico Ácido (CPA). Também discutimos protocolos para determinar o in situ K _d e quantificação basal [Ca ^{2 +} ] em C2C12 células. Em resumo, estes protocolos, utilizados em conjunto com CatchER ⁺ , podem desencadear a libertação de cálcio mediada pelo receptor a partir da ER com aplicação futura no estudo de ER / SR relacionadas com cálcio patologias.

Introdução

Os atributos espaço-temporais dos transientes de cálcio intracelular (Ca ²⁺ ) ativam várias funções biológicas ¹ . Estes eventos de sinalização de Ca2 ⁺ são desencadeados extracelularmente através de diferentes estímulos e controlados intracelularmente pela maior organela de armazenamento de Ca2 ⁺ e por numerosas bombas de Ca2 ⁺ , canais e proteínas de ligação de Ca2 ⁺ . Os transientes de Ca ²⁺ podem ser significativamente alterados como resultado de defeitos com modulação do sinal, levando a diferentes doenças ² . Devido à velocidade e complexidade do sistema de sinalização Ca ²⁺ , com o retículo endo- (ER) e sarcoplasmático (SR) no centro, sondas de Ca ²⁺ geneticamente codificadas que foram otimizadas para expressão de mamíferos com cinética rápida são necessárias Para observar global e local Ca ^{2 +} mudanças em diferentes células ³ .

O ER eo SR, Sua contrapartida em células musculares, são os principais organelos de armazenamento intracelular de Ca ²⁺ e atuam como sumidouros de Ca ²⁺ que ajudam a amplificar o sinal de Ca ^{2+ 4} . O ER / SR é parte integrante da sinalização Ca ²⁺ com papéis duais como transmissor e receptor de sinais ⁵ . O receptor de rianodina (RyR) e o receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) são receptores de libertação de Ca2 ⁺ localizados nas membranas da ER / SR reguladas por Ca2 ^{+ 6} . Outros agentes estimulam directa ou indirectamente a função destes receptores. O 4-cloro-m-cresol (4 cmc) é um potente agonista do RyR, tendo uma sensibilidade 10 vezes maior do que a cafeína para induzir a libertação de SR Ca ²⁺ onde ambos são regularmente utilizados para estudar a libertação de Ca ²⁺ mediada por RyR Saudáveis ​​e doentes ⁷ . ATP aumenta Ca ^{2 +} mediado por IP ₃Locação através do IP ₃ R ⁸ . O ATP liga-se ao receptor purinérgico P2YR, um receptor acoplado à proteína G (GPCR), desencadeando a produção de IP ₃ que se liga ao IP ₃ R para libertar Ca ²⁺ do ER ^{9 , 10} . A bomba de ATPase de cálcio reticular sarco-endoplasmático (SERCA) é uma bomba ATPase de tipo P, também localizada na membrana ER / SR que reduz o Ca ²⁺ citosólico e reabastece o ER / SR ao bombear ativamente o íon no lúmen ER / SR ¹¹ . Inibidores específicos da bomba SERCA incluem tapsigargina, de Thapsia garganica e ácido ciclopiazónico (CPA), de Aspergillus e Penicillium . O CPA tem uma baixa afinidade para a bomba e bloqueia reversivelmente o ponto de acesso Ca ^{2 + 12} . A tapsigargina, por outro lado, liga-se irreversivelmente à bomba livre de Ca2 ⁺ no resíduo F256 na hélice M3 com nanomolAr afinidade ¹¹ . Analisar e quantificar as alterações envolvidas nos eventos estimulados com Ca2 ⁺ tem sido e continua a ser um desafio. Uma vez que o ER / SR é o maior subcelular Ca ^{2 +} contendo compartimento com uma função central na propagação do Ca ^{2 +} sinal, muito trabalho tem sido focada na compreensão ER / SR Ca ^{2 +} sinalização ⁵ .

A criação de corantes sintéticos de Ca ^{2 +} ajudou a avançar o campo ea prática de Ca ^{2 +} imagem. Embora corantes, como o Mag-Fura-2, tenham sido amplamente utilizados para medir o Ca ²⁺ compartimentado em diferentes células, 13,14,15 têm limitações tais como carga de corante desigual, fotodegradação ea incapacidade de ser direcionado para organelas específicas . A descoberta da proteína verde fluorescente (GFP) eo avanço da proteína fluorescente-Baseado Ca ^{2 +} propulsou o campo de Ca ^{2 +} imagem para a frente ¹⁶ . Alguns dos GECIs existentes são pares de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) envolvendo proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente ciana (CFP), calmodulina e o péptido de ligação a M13 ^{17 , 18} . Os GECI baseados em troponina C também estão disponíveis como pares FRET de CFP e Citrino e como sondas únicas de fluoróforo ^{19 , 20 , 21} . Outros, tais como GCaMP2 e R-GECO são sensores de fluoróforo único envolvendo calmodulina ^{22 , 23} . Para ultrapassar as limitações da afinação estreita de Kd e da ligação cooperativa associada a múltiplos locais de ligação de Ca2 ⁺ encontrados nos seus domínios de ligação a Ca2 ^{+ 24} , uma nova classe de cálcio senSors foi criado por projetar um local de ligação Ca ^{2 +} na superfície do barril beta em um local sensível ao cromóforo de proteína verde fluorescente reforçada (EGFP) ^{25 , 26} . Este altamente touted sensor, chamado CatchER, tem um K _d de ~ 0.18 mM, ak _em perto do limite de difusão, e ak _off de 700 s ^-1 . CatchER tem sido utilizado para monitorizar a libertação de cálcio ER / SR mediada por receptor em diferentes linhas de células de mamífero tais como HeLa, HEK293 e C2C12 ²⁵ . Devido à sua cinética rápida, o CatchER foi utilizado em fibras musculares flexor digitorum brevis (FDB) de jovens e velhos ratos Friend Friend B NIH Jackson (FVB) para revelar que mais Ca ^{2 +} permanece no SR após 2 s de despolarização no FDB De camundongos velhos em comparação com a de camundongos jovens ²⁷ . Para superar a sua baixa fluorescência a 37 ° C, o que dificulta as suas aplicações na imagiologia de cálcio de mamíferosCélulas, desenvolvemos uma versão melhorada do CatchER chamado CatchER ⁺ . CatchER ⁺ exibe fluorescência melhorada a 37 ° C para melhor aplicação em células de mamífero. Foram incorporadas mutações adicionais no CatchER para melhorar a termoestabilidade e fluorescência a 37 ° C ^{28 , 29} , para criar CatchER ⁺ . CatchER ⁺ exibe um aumento de seis vezes em sua relação sinal / ruído (SNR) sobre CatchER ³⁰ .

Aqui são apresentados os protocolos para a cultura e transfecção de células HEK293 e C2C12 com CatchER ⁺ e a sua aplicação para monitorizar transientes de cálcio mediados por receptores ER / SR. Apresentam-se resultados representativos para CatchER ⁺ expresso em células HEK293 tratadas com 4 cmc, CPA e ATP. Nós também fornecemos um protocolo para determinar o K _d in situ de CatchER ⁺ em células de mioblasto C2C12 e quaNação de Ca2 ⁺ ] basal.

Protocolo

1. Preparação do Slide

1. Coloque as lâminas de microscópio de vidro de 22 mm x 40 mm em placas de cultura celular de 6 cm, 1 lâmina por prato.
2. Exponha cada lado de cada lâmina, bem como o prato de 6 cm à luz ultravioleta (UV) por 15-20 min para esterilizar em uma capa estéril.
3. Cubra os pratos com lâminas dentro com parafilme e armazene a 4 ° C até pronto para usar.

2. Preparação de meios, tampões, soluções e reagentes

1. Preparar 1 L de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) em água desionizada e adicionar HEPES 10 mM, NaHCO3 5 mM e EGTA 1 mM. Ajustar para pH 7,2-7,3 com NaOH. Filtrar o tampão com um filtro de 0,22 μm num frasco autoclavado.
2. Preparar 900 mL de meio de Eagle modificado por Dulbecco de alta glicose (DMEM) h em água desionizada. Adicionar NaHCO3 44 mM e ajustar o pH a 7,2-7,3 com HCl. Filtrar o meio com um filtro de 0,22 μm num frasco autoclavado. Adicionar 100 mL de bovi fetal(FBS) ao meio para se obter uma concentração de FBS de 10%. Armazenar a 4 ° C.
3. Preparar 1 L de tampão intracelular (KCl 125 mM, NaCl 25 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 0,2 ​​mM, EGTA 0,5 mM, MgCl2 0,2 ​​mM) em água desionizada, e ajustar o pH a 7,25. O [Ca2 ⁺ ] final será ~ 100 nM. Antes da utilização, adicionar ATP 0,5 mM. Armazenar em temperatura ambiente.
4. Preparar 1 L de tampão Ringer (NaCl 121 mM, K2HPO4 2,4 mM, KH2PO4 0,4 ​​mM, HEPES 10 mM e MgCl2 1,2 mM) em água desionizada e ajustar o pH a 7,2. Armazenar em temperatura ambiente. Para usar, alíquota de 50 mL para um tubo de 50 mL e adicionar Ca ²⁺ 1,8 mM e glicose 10 mM.
5. Preparar 1 L de solução de enxágüe KCl (KCl 125 mM, NaCl 25 mM, HEPES 10 mM, MgCl2 0,2 ​​mM) em água desionizada e ajustar o pH a 7,25.
6. Dissolver 5 mg de ionomicina em 1 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Alíquota 30 μL em microtubos e armazenar a -206; C.
7. Preparar o estoque de ácido ciclopiazônico (CPA) por dissolução de CPA em DMSO. Certifique-se de que a percentagem final de DMSO é ≤ 1% para o CPA adicionado às células para evitar a apoptose. Preparar 4-cloro-m-cresol (4 cmc) 20 mM por dissolução em H2O filtrada e deixar dissolver durante a noite por agitação a 37 ° C. Preparar o estoque de ATP dissolvendo em H ₂ O filtrado até 100 mM.
8. Para determinar o K _d in situ , preparar 15 mL de cada um de EGTA 1 mM, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM e 100 mM de Ca2 ⁺ em tampão de KCl utilizando uma solução de 100 MM de EGTA e uma pasta de CaCl2 1 M dissolvida em água desionizada.

3. Cultura celular

1. Cultura de mioblastos C2C12 e células HEK293 de acordo com protocolos ATCC para cada utilização de placas de cultura celular de 10 cm numa cobertura de UV estéril.
   NOTA: As células C2C12 não devem ser deixadas crescer mais do que ~ 70% de confluência uma vez que os mioblastos começarão a diferenciarTe em myotubes. As células HEK293 e C2C12 crescem prontamente e não devem ser deixadas crescer após 100% de confluência para manter a integridade celular. Além disso, as células não devem ser passadas mais de 10 vezes antes de usá-los para uma experiência para preservar a saúde celular.

4. Transfecção de células HEK293

1. Semear as células HEK293 em lâminas de microscópio de vidro 22 mm x 40 mm esterilizadas em placas de 6 cm de modo que elas são ~ 70% confluentes no dia da transfecção.
2. No dia seguinte, siga o protocolo do fabricante para o reagente de transfecção para transfectar células utilizando 2 ug de ADNc de CatchER ⁺ e uma proporção de ADN: transfecção de 1: 3 (peso / volume) nos meios de soro reduzidos ( eg Opti-MEM).
3. Esvazie a mídia DMEM do prato e adicione 3 mL de meio soro reduzido. Adicionar ADN: mistura de reagente de transfecção à placa e incubar durante 4-6 h a 37 ° C.
4. Após incubação, lavar as células com 5-6 mL de HBSS. Descarte o HBSS fRom o prato e substituir por 3 mL de DMEM fresco e incuba-los a 37 ° C durante 48 h para permitir a expressão do GECI.
5. Transfecção de células mioblásticas C2C12
   1. Para as células de mioblasto C2C12, trypsinize células através da adição de tripsina suficiente para cobrir o fundo do prato (1-2 mL). Coloque o prato em uma incubadora a 37 ° C por 2-6 min para permitir que a tripsina para afrouxar as células do fundo do prato.
   2. Uma vez completada a incubação, remover a tripsina e aspirar as células em 8 mL de DMEM. Pipetar bem as células com o DMEM para dispersar uniformemente e re-suspender as células te e semeá-las em lamínulas estéreis em placas de cultura de células de 6 cm contendo 3 mL de DMEM de modo que a confluência final seja de 60%.
   3. Transfectar as células no mesmo dia descrito no passo 4.2-4.3. Incubar durante 24 h a 37 ° C.
   4. Repita o passo 4.4.

5. Preparação do microscópio de diapositivas e fluorescência

1. Ative mIcroscope e fonte de luz, abra o programa Simple PCI. Permitir que o microscópio para aquecer por 15-20 minutos ou até que o dispositivo de carga acoplada (CCD) câmera esfria a -65 ° C. Prepare a câmara e deslize com as células enquanto espera.
2. Cubra o fundo da câmara de imagem de banho de diamante aberto de baixo perfil com uma fina camada de vedante, usando um cotonete.
3. Retire a lâmina contendo as células transfectadas da incubadora e enxágüe suavemente três vezes com 1 mL de tampão de Ringer com glucose 10 mM e Ca ²⁺ 1,8 mM pré-aquecido a 37 ° C.
4. Deixe 1 mL de tampão Ringer no prato, para evitar que as células de secagem, e use fórceps para tirar o slide fora do prato. Permitir que a solução em excesso absorva em um tecido de laboratório, tocando a borda da lâmina para um tecido de laboratório. Em seguida, coloque no lado da câmara que contém a graxa com as células voltadas para cima em direção a graxa e segura a câmara sobre o palco de montagem usando uma chave de fenda.
5. Adicionar 1ML de tamp� de Ringer � c�ara para impedir que as c�ulas sequem ao montar a c�ara no andar e completar o resto da configura�o do microsc�io. Uma vez que a mangueira de sucção de vácuo está ligada à câmara, o volume final da câmara é ~ 450 μL.
6. Mude o objetivo do microscópio para o objetivo de imersão de óleo 40X.
7. Use papel de lentes e solução de limpeza de lentes para limpar e secar o objetivo. Não esfregue o objetivo. Dab suavemente até que a superfície está limpa.
8. Adicione uma gota do óleo de imersão ao objetivo.
9. Coloque o suporte no microscópio e adicione a ponta do vácuo à câmara. Uma vez que a mangueira de sucção de vácuo está ligada à câmara e ligada, o volume final da câmara é de ~ 450 μL. Este volume final está nivelado com os lados da câmara. É imperativo que a solução da câmara seja nivelada, durante o experimento, para evitar que a solução derrame para baixo no objetivo devido ao enchimento excessivo.
10. Levante o objetivo e use o ajuste grosso até que o óleo no objetivo toque no fundo do slide.
11. Usando o modo de campo brilhante, ajuste o ganho para 175 eo tempo de exposição para 0,03 s para focalizar as células.
12. Uma vez que as células estão focadas, mude para o modo de fluorescência usando excitação de 488 nm. Alterar o tempo de exposição para 0.07 s. Localize um campo de visão que tenha células suficientes que sejam saudáveis ​​com fluorescência adequada à imagem.
13. Uma vez que um campo de visão foi escolhido, tirar fotos em fluorescência e campo brilhante modo.
14. Círculo de uma região de interesse (ROI) nas células ou círculo a célula inteira para gravar a intensidade da área escolhida.

6. Transtornos Ca ²⁺ induzidos por imagem e Calibração In Situ K _d

1. Inicie a medição de intensidade com a taxa de quadros ajustada em uma cada 5 s.
2. Permita que a intensidade da linha de base se estabilize durante 20 a 30 fotogramas (100-150 s). Se necessário, diminua o frAmes / s durante esta etapa para impedir o fotoblanqueamento.
3. Calcular a quantidade de 4 cmc necessária a partir de uma reserva de 20 mM com base no volume da câmara final de ~ 450 μL para se obter uma concentração final de 200 μM. Fazer diluições do estoque, se necessário.
4. Tomar cuidadosamente 60 μL de tampão Ringer da câmara e colocar num tubo de microcentrífuga. Diluir a quantidade calculada de 4 cmc com esta solução e adicionar novamente à câmara para evocar a resposta pretendida a partir das células que estão a ser formadas imagens.
5. Adicionar a quantidade calculada de 4 cmc ao tubo de microcentrífuga e misturar por pipetagem.
6. Adicione suavemente a solução sobre o campo de visão enquanto simultaneamente adiciona o marcador de evento na medição de intensidade.
7. Deixar tempo para que o fármaco se ligue ao receptor e subsequente diminuição do sinal, depois lavar com 3-6 mL de tampão de Ringer com Ca2 ⁺ 1,8 mM e glucose 10 mM enquanto adiciona simultaneamente o marcador de evento. Uma vez que o volume da câmara é 450 &# 181; L e está ligado a um vácuo, a adição de 3-6 mL de tampão assegura que a primeira solução contendo o fármaco tenha sido removida por lavagem e substituída com a solução adicionada recentemente.
8. Repetir 6,1-6,7 para ATP 100 μM e CPA 15 μM, utilizando uma nova lâmina de células transfectadas para cada ensaio.
9. Quando a medição estiver concluída, termine a coleta de dados na janela de medição de intensidade no programa Simple PCI.
10. Tome fotos fluorescência e brightfield das células.
11. Abra o arquivo de dados para a experiência. Aqui, recriar as células ou regiões de interesse para recalcular os valores de intensidade, se necessário.
12. Para determinar o K _d in situ em células de mioblasto C2C12, siga o protocolo como delineado na secção 4.2 e secção 5 e colocar 1 mL de tampão Ca ²⁺ Ringer 0 mM na câmara.
    1. Permeabilizar as células com 0,002-0,005% de saponina em tampão intracelular durante 15-30 s para esvaziar as células de qualquerCatchER ⁺ que pode estar no citosol. Lavar as células com 3-6 mL de 1 mL de EGTA em tampão KCl com ionomicina 10 μM. Permitir que a intensidade de diminuir até um platô é atingido.
    2. Enxaguar com 3-6 mL de tampão KCl com ionomicina 10 μM e deixar a intensidade estabilizar, depois adicionar cada solução de Ca2 ⁺ detalhada no passo 2.7. Permitir que a intensidade de atingir um platô entre cada adição.
13. Para calibrar o sensor para a quantificação basal [Ca2 ⁺ ], siga o passo 6.12. Utilizar o EGTA eo tampão Ca2 ⁺ 100 mM do passo 2.7 para obter a intensidade de fluorescência mínima e máxima.

7. Processamento de dados

1. Faça o download do arquivo de planilha dos dados de medição de intensidade.
2. Normalize os dados para cada célula para a intensidade da linha de base (F / F ₀ ). Trace os dados normalizados em função do tempo em qualquer programa gráfico.
3. Para calcular a% de alteração, subtraia o pico normalizado valUe de 1 e multiplicar por 100. Calcular a média eo desvio padrão se várias células foram visualizadas.
4. Para calcular a relação sinal / ruído, SNR, abrir o arquivo de imagem salva da experiência em um software de processamento de imagem, como ImageJ, e depois medir o sinal, células transfectadas e ruído de fundo. Calcule o SNR usando a equação SNR = sinal / ruído.
5. Para calcular o K j in situ a partir dos dados de imagem de fluorescência recolhidos, mede-se os dados de intensidade, compreendendo os platôs, após adição de cada concentração de Ca2 ⁺ e EGTA (0 mM Ca2 ⁺ ). Calcular a saturação fracionária (intensidade relativa) usando θ = (F - F _min ) / (Fmax - F _min ), onde θ é a intensidade relativa, F é a fluorescência em qualquer ponto, F _min é a intensidade de fluorescência mínima e F _max é a intensidade de fluorescência máxima, para ver a mudança na intensidade de tEle sonda com a adição de Ca ^{2 +} em comparação com a intensidade mínima. Trace os dados de intensidade relativa contra o [Ca2 ⁺ ] em qualquer programa gráfico e de ajuste de curvas. Utilize a equação de ligação 1: 1 θ = [M _T ] / (K _d + [M _T ]) traduzida para qualquer programa gráfico e de ajuste de curva para calcular o K _d . M _T é a concentração total de metal.
6. Para quantificar o cálcio basal a partir da calibração delineada em 6.13, a média dos dados de intensidade, compreendendo os platôs, após a adição de EGTA 1 mM (F _min ) e 100 mM Ca ²⁺ (F _max ). Utilizar a equação de calibração [Ca2 ⁺ ] = Kd ([F - Fmin) / (Fmax - F)] para calcular o cálcio basal.

Resultados

Esta secção irá ilustrar os resultados que foram alcançados utilizando os métodos descritos anteriormente utilizando o optimizado ER / SR-alvo GECI CatchER ⁺ para monitorar mudanças em ER / SR Ca ^{2 +} através de diferentes vias mediadas pelo receptor.

A Figura 1 ilustra o esvaziamento de ER através do RyR estimulado com 200 μM de 4 cmc. 4-cmc é um agonista do RyR. A adição do ...

Discussão

A imagiologia com células vivas de sondas fluorescentes, tal como CatchER ⁺ , é uma técnica eficaz para analisar processos de sinalização intrínsecos de ER / SR Ca2 ⁺ em cada célula em resposta a agonistas ou antagonistas de receptores. Esta técnica também é útil para imagens usando múltiplos comprimentos de onda simultaneamente, como necessário para Fura-2 ou para a imagem CatchER ⁺ e Rhod-2 em conjunto para monitorar ER e citosólicas alterações de cálcio, respectivamente. Existem vária...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4-Cloro-3-metilfenol (4-CmC)	Sigma-Aldrich	C55402
515DCXR espelho dicróico	Chroma Technology Corp.
Adenosina 5′-trifosfato dissódico sal hidratado	Sigma-Aldrich	A26209
Cloreto de cálcio di-hidratado	EMD Millipore	102382
Placas de cultura tratadas com cultura de tecidos Corning (100 mm)	Placas de cultura tratadas com cultura de tecidos Sigma-Aldrich	CLS430167
Corning (60 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430166
Ácido ciclopiazônico (CPA)	EMD Millipore	239805
D (+) -glicose	ACROS Organics	41095-0010
Dow Corning 111 Lubrificante de válvula e Selante	Warner Instruments	64-0275
Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D7777
Ácido Etilenobis(oxietilenoenitrilo) tetracético (EGTA)	ACROS Organics	409911000
Soro Fetal Bovino (FBS)	ThermoFisher	26140087
Fisherbrand Óculos de Cobertura 22x40 mm	Fisher Scientific	12-544B
Hanks ' Sais Balanceados (HBSS)	Sigma-Aldrich	H4891
HEPES, Ácido Livre, Grau de Biologia Molecular	EMD Millipore	391340
Óleo de Imersão sem autofluorescência	Leica	11513859
Ionomicina, Ácido Livre	Fisher Scientific	50-230-5804
Leica DM6100B microscópio invertido com uma câmera EM-CCD resfriada	Hamamatsu	C9100-13
Reagente de Transfecção de Lipofectamina 2000	ThermoFisher	11668019
Reagente de Transfecção de Lipofectamina 3000	ThermoFisher	L3000015
Banho de Diamante Aberto de Perfil Baixo Warner	Instruments	RC-26GLP
Cloreto de Magnésio Hexahidratado	Fisher Scientific	M33-500
Opti-MEM	ThermoFisher	51985034
Cloreto de Potássio	EMD Millipore	PX1405
Fosfato de Potássio, Dibásico	EMD Millipore	PX1570
Fosfato de Potássio, Monobásico	EMD Millipore	PX1565
Saponina	Sigma-Aldrich	47036
SimplePCI Software de Análise de Imagem	Hamamatsu	N/A
Bicarbonato de Sódio	Fisher Scientific	S233-3
Cloreto de Sódio	Fisher Scientific	S271-500
Sterivex-GV 0.22 µ Filtro EMD	Millipore	SVGVB1010
Till Policromado V Lâmpada de xenônio	Till Photonics	N/A
Tripsina (2,5%), sem vermelho de fenol (10x)	ThermoFisher	15090046