Artigo de método

Ensaios de caracterização de romance endoteliais reguladores envolvidos na resposta inflamatória de triagem

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DOI:

10.3791/55824

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15 de setembro de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Pharmacological Therapies Unit, Research Institute for Rare Diseases, Institute of Health Carlos III

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Endotélio vascular controla firmemente o recrutamento de leucócitos. Extravasamento de leucócitos inadequado contribui para doenças inflamatórias humanas. Portanto, à procura de novos elementos reguladores de ativação endotelial é necessária projetar terapias melhoradas para desordens inflamatórias. Aqui, descrevemos uma metodologia abrangente para caracterizar o romance reguladores endoteliais que podem modificar leucócitos tráfico durante a inflamação.

Resumo

A camada endotelial é essencial para manter a homeostase do corpo, controlando muitas funções diferentes. Regulação da resposta inflamatória pela camada endotelial é crucial para lutar eficientemente contra entradas prejudiciais e ajuda na recuperação de áreas danificadas. Quando as células endoteliais são expostas a um ambiente inflamatório, tais como o componente exterior da membrana de bactérias Gram-negativas, lipopolissacarídeo (LPS), eles expressam solúveis citocinas pró-inflamatórias, como Ccl5, Cxcl1 e Cxcl10 e acionar o ativação de leucócitos em circulação. Além disso, a expressão de moléculas de adesão E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1 na superfície endotelial permite a interação e a adesão de leucócitos ativados para a camada endotelial e eventualmente o extravasamento para o tecido inflamado. Nesse cenário, a função endotelial deve ser fortemente regulamentada porque ativação excessiva ou com defeito no recrutamento de leucócitos pode levar a desordens inflamatórias-relacionadas. Desde que muitos destes transtornos não têm um tratamento eficaz, novas estratégias com foco na camada vascular devem ser investigadas. Propomos a ensaios abrangentes que são úteis para a busca de novos reguladores endoteliais que modificar a função dos leucócitos. Analisamos a ativação endotelial usando alvos específicos expressão envolvidos no recrutamento de leucócitos (por exemplo, citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão) com várias técnicas, incluindo: (reação em cadeia de polimerase quantitativo em tempo real RT-qPCR), western-blot, ensaios de aderência e citometria de fluxo. Essas abordagens determinar função endotelial no contexto inflamatório e são muito úteis para realizar ensaios de triagem para caracterizar o romance reguladores inflamatórios endoteliais que são potencialmente valiosos para a concepção de novas estratégias terapêuticas.

Introdução

A inflamação é uma resposta biológica benéfica contra agentes infecciosos, com o objectivo principal de eliminar o patógeno e reparar o tecido danificado. Sob certas condições, tais como infecções crônicas ou doenças auto-imunes, inflamação não resolve. Em vez disso, há uma reação anormal com a contínua infiltração de leucócitos, resultando em uma resposta imune prolongada que leva a danos nos tecidos, fibrose, perda de função e em geral, deficiência e em alguma morte de casos do paciente. Estes distúrbios humanos, catalogados como doenças inflamatórias, todos envolvem os vasos sanguíneos para o controle de extravasamento de leucócitos1,2.

As células endoteliais desempenham um papel fundamental na regulação da resposta inflamatória, controlando o tráfico de leucócitos. Quando a camada endotelial é exposta aos mediadores inflamatórios tais como LPS, o endotélio descanso ativa e expressa as citocinas pró-inflamatórias (Cxcl10 Cxcl5, Cxcl1, etc) e moléculas de adesão (E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) esse favor recrutamento de leucócitos para o local de infecção em circulação. Leucócitos aprontados pelas citocinas lançadas depois mediam rolando e interação com a camada endotelial através as contrapartes adesivas correspondentes: PSGL-1 e selectina α4β1 integrina a VCAM-1 e αLβ2 integrina a ICAM-1. Finalmente, os leucócitos migram da vasculatura para o foco da inflamação3.

O papel essencial do endotélio na regulação da resposta inflamatória tem sido demonstrado em ratos que foram geneticamente modificados para expressar o receptor de LPS, receptores do tipo toll 4 (TLR4), apenas sobre as células endoteliais. Estes animais endotelial-TLR4 foram capazes de responder a uma inflamação mediada por LPS e detectar a infecção gerada após a inoculação de bactérias e, consequentemente, alcançar a resolução de infecção e sobrevivência a níveis semelhantes, como o tipo selvagem ratos4 , 5.

Para o caminho de resposta inflamatória endotélio-regulado, foi postulado que a inibição em algumas fases da interação leucócito-endotélio resultaria na redução da migração trans-endotelial e um prognóstico melhor para doenças inflamatórias-relacionados. Na verdade, várias estratégias visando a interação de ativação e leucócito-endotélio endotelial foram projetadas para impedir o extravasamento de células do sistema imunológico como um tratamento para disorders inflammatory6,7.

Neste relatório, descrevemos um grupo completo de técnicas em vitro para caracterizar plenamente a atividade endotelial em resposta para os estímulo inflamatório LPS e seu papel na ativação de leucócitos e adesão à camada vascular. O modelo de célula endotelial usado neste manuscrito foi a linha de endothelial da pilha do pulmão de rato (MLEC-04), conforme descrito por Hortelano et al 8. o MLEC-04 linha de celular foi validada na literatura para ser um sistema adequado para estudar a ativação endotelial9,10. Com base em interesses de pesquisa, essas abordagens podem ser facilmente extrapoladas para qualquer endoteliais ou sistemas de leucócitos e perfil inflamatório. Uma vez que são definidos os parâmetros endoteliais nas condições selecionados, o sistema pode testar novos medicamentos sobre a experimentação proposto para avaliar a ativação vascular. Neste contexto inflamatório, as células do endotélio testadas com o composto de interesse podem ser comparadas com as condições de controle das células, e quaisquer diferenças resultantes podem informar resultado de prognóstico da droga no desenvolvimento e progressão da inflamação. Para concluir, propomos um sistema relevante para caracterizar novos alvos de drogas às células endoteliais, que podem influenciar a concepção de romance vasculares específicas terapias contra doenças inflamatórias relacionadas.

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Protocolo

1. cultura de células endoteliais

  1. cultura de tecido Tratado placas
    1. placas de cultura de tecido casaco 100 mm com gelatina de 2,5 mL de solução (autoclavados, 0,1% de gelatina em água destilada) por 30 min a 37 ° C; esse pode ser extrapolada para o formato exigido bem. Aspirar a solução de gelatina e deixe placas para secar ao ar livre do bairro de cultura de tecidos.
  2. As condições de cultura de tecido
    1. cultivar as MLEC-04 células dentro de uma incubadora biológica (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO 2). Crescem as células em mídia completa de Dulbecco ' s Modified Eagle Medium: mistura de nutrientes F-12 (DMEM/F-12) suplementado com 10% de soro Fetal bovino (FBS) e 100 unidades/mL penicilina e estreptomicina 100 µ g/mL (P/S).
    2. Contar as células pelo método padrão para a câmara de Neubauer e adicionar as MLEC-04 células para as placas de gelatina-Tratado de 100mm na mídia completa 10 mL, com uma densidade baixa de 2-11 x 10 4 células/cm 2. Dividir as células 1:3 quando eles alcançam a confluência.
      Nota: Normalmente, isso ocorre após dois ou três dias em cultura.
    3. Subcultura das células lavando os pratos com 10 mL de fosfato Buffered Saline (PBS estéril) seguido pela adição de 2 mL de solução de tripsina-EDTA (tripsina 0,25%, 5 mM EDTA) e incube por 3 min a 37 ° C.
    4. Parar a reação do trypsin-EDTA e recuperar as células suspensas adicionando mídia completa 10 mL. Gire para baixo as células (300 x g, 5 min), desprezar o sobrenadante, resuspenda o pellet celular na mídia completa e subcultura adequadamente.

2. Tratamento de LPS e mediadores

  1. as MLEC-04 células na mídia completa sub confluência no seguinte formato bem da placa: 7 x 10 5 células/poço em placas 6 boas e 2,5 x 10 5 células/poço em placas de 96 poços.
  2. Incubar a cultura para 6 h em uma incubadora de célula (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO 2). Alterne as células para mídia incompleta (DMEM-F12, P/S) e deixar durante a noite (ON) para sincronizar e reduzir a atividade celular.
  3. Remover a mídia e testar novos compostos farmacológicos incubando as células endoteliais com (ou sem) a droga em questão (por exemplo, DT 10) diluído na mídia incompleta (30 min, a 37 ° C); adicionar 1,4 mL/bem para placa de 6 ou 0,14 mL/bem para placas de 96 poços).
  4. Desafiar as células adicionando LPS para a mídia de incubação (100 ng/mL, concentração final) para o período de tempo especificado em cada ensaio. Usar o PBS como um controle.

3. Avaliação do perfil transcricional no endotélio ativado por RT-qPCR

  1. células de semente o MLEC-04 sub confluência na cultura 6-poços chapas (7 x 10 5 células/poço). Incubar durante 6 h (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO 2) e depois proceder à fome de soro (incubar ON).
  2. Remover a mídia e trata (ou não tratar) a célula endotelial culturas com essa droga de interesse diluído na mídia incompleta (Incubar 30 min, a 37 ° C); adicionam 1,4 mL/bem para placa de 6 (30 min, a 37 ° C).
  3. Desafiar as células, adicionando 100 ng/mL LPS para a mídia incubada (conforme descrito na etapa 2.3) e incube por 6 h. parar a reacção por lavar duas vezes com PBS frio e manter as placas a-80 ° C até o processamento da amostra.
  4. Extração de RNA
    1. descongela as placas e adiciona 1 mL/poço RNA solução tampão (38% de fenol e 0,8 M guanidínio isotiocianato; ver tabela de materiais). Deixe por 30 min à temperatura ambiente (RT) sob agitação e coletar homogeneizado em tubos de 1,5 mL.
    2. Adicionar 200 clorofórmio µ l e agitar suavemente durante 15 s. Incubar por 3 min em RT e centrífuga (11.600 x g, 15 min, 4 ° C).
    3. Transferir a fase aquosa para um outro tubo de 1,5 mL. Precipitar o RNA adicionando 500 µ l isopropanol, seguido de uma incubação de 10 min a RT e, em seguida, centrifugação (11.600 x g, 4 ° C).
    4. Desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento com 75% de etanol pelo vórtice agitação e centrifugação em seguida (7.500 x g, 4 ° C).
    5. Secar ao ar livre a pelota e solubilizar RNA em 25 µ l pura H 2 O, incubando durante 10 minutos a 55 ° C. Mantenha RNA a-80 ° C até o processamento da amostra.
  5. Quantidade e pureza do RNA
    1. quantificar a concentração de RNA medindo-se a absorvância da amostra em 260 nm num espectrofotómetro (ver Tabela de materiais).
    2. Medida em 230 nm e 280 nm para determinar a pureza de RNA.
      Nota: A relação no 260/280 indica contaminação de proteína ou fenol. Uma relação de perto 2 é aceitável. A relação no 260/230 indica EDTA, hidratos de carbono ou contaminantes de fenol. Valores entre 2.0-2.2 são aceitáveis.
  6. RNA de verificação de integridade
    1. Run 2 µ g de RNA total e RNA um escada em um gel de agarose de desnaturação de 1,5%; Visualizar sobre um sistema de documentação do gel (ver Tabela de materiais).
      Nota: Uma proporção de 2:1 clara e nítida bandas de rRNA 28S e 18S indica um RNA intacto. Parcialmente degradadas RNA resolve como uma aparência borrada.
  7. RT-qPCR
    1. sintetizar o DNA complementar (cDNA) a partir de um único RNA encalhado, seguindo o padrão do protocolo (ver Tabela de materiais) 11.
  8. Avaliar expressão gênica por RT-qPCR
    1. preparar a mistura de reação para cada amostra: Misture 2 µ l do cDNA, composto fluorescente de 7 µ l, primeira demão para a frente de 300 nM e 300 nM inversa da primeira demão (tabela 1) em um volume final de 13 µ l e adicionar à placa de 96 poços de reação (ver Tabela de materiais).
    2. Selar a placa com uma capa de adesivo óptica, centrífuga (300 x g, 1 min) e executar a reação em um sistema de PCR em tempo real (começo quente 95 ° C por 20 s seguido de 40 ciclos: 95 ° C por 3 s e 60 ° C por 30 s) (ver Tabela de materiais).
    3. Analisar os resultados por quantificação relativa usando o método comparativo 2 -ΔΔCt com o housekeeping genes gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) ou ácido phosphoprotein ribosomal P0 (36B4) 12 .

4. Avaliar a ativação endotelial por citometria de fluxo

  1. tratar as células MLEC-04 seguindo as condições descritas na seção 2 e avaliar as alterações das proteínas de superfície endoteliais por citometria de fluxo.
  2. Detach as células após 6 h de estimulação de LPS com o método do trypsin-EDTA descrito no passo 1.2.3 e lavagem com os meios de comunicação incompletos em 4 ° C.
  3. Contar as células usando o método de câmara de Neubauer e coloque 10 x 10 4 células em placas de 96 poços de fundo-u. Centrífuga (300 x g, 5 min) e descartar o sobrenadante por um 180° snap do pulso de cima para baixo e recuperação rápida para a posição original.
  4. Adicionar 50 μl do anticorpo selecionado diluído na mídia incompleta (10 µ g/mL, concentração final) para as células e incubar (30 min, 4 ° C).
  5. Lavar as células w duas vezesIth a mídia incompleta, seguindo o procedimento descrito no passo 4.3 e incuba com 50 µ l de 10 µ g/ml de anticorpo secundário correspondente acoplado ao FITC ou um conjugado semelhante (30 min, 4 ° C, em um espaço escuro).
  6. Lavar as células de uma vez com a mídia incompleta, seguida por uma lavagem de PBS. Recuperar as células com 300 µ l PBS usando pontas de pipetas de 1 mL e colocar em tubos de citometria.
  7. Avaliar as amostras no sistema de citometria de fluxo (ver Tabela de materiais). Ajuste a população celular pela frente e parâmetros de dispersão de lado. Portão da população de interesse. Ajuste o gates baseados no controle negativo de células incubadas do isotipo controle. Analisar os resultados em percentagem de células positivas ou dizer a intensidade de fluorescência 8.

5. Avaliar a ativação endotelial por Western Blot

  1. semente do endotélio na confluência sub em placas de cultura 6-poços (7 x 10 5 células/poço) e tratar com LPS, conforme descrito na seção 2. Analisar a expressão da proteína inflamatória pelo seguinte protocolo de borrão ocidental.
  2. Pare a estimulação de LPS em pontos de tempo diferente para elucidar aspectos diferentes da resposta endotelial:
    1. determinar o perfil de proteínas inflamatórias após 6 h de estimulação de LPS.
    2. Determinar a célula sinalizando a cada 15 min por um período de 60 min.
  3. Em ambos os casos, parar a reacção por lavar duas vezes com PBS frio e armazenar as amostras a-80 ° C até o processamento da amostra.
    4. Buffer de
  4. Lyse pilhas e extração da proteína
    1. lise de adicionar 200 µ l de cada poço (1% não iónico, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM de cloreto de sódio, pirofosfato de sódio de 30mm, fluoreto de sódio a 50 milímetros ortovanadato de sódio 2,1 mM no pH 7,6, suplementado com coquetel de inibidor de protease) (ver tabela de materiais).
    2. Incubar por 15 min a 4 ° C, sob agitação, poços com uma ponta de pipeta de raspar e coletar o homogeneizado em tubos de 1,5 mL.
    3. Centrifugar os tubos a 11.600 x g a 4 ° C.
    4. Armazenar o sobrenadante em tubos limpos 1,5 mL a-80 ° C até o processamento.
  5. Medida que a concentração de proteína pelo ensaio de ácido bicinchoninic, seguindo o padrão do protocolo (ver tabela de materiais) 13.
  6. Resolver a 30 µ g de proteína total lisada para cada amostra, a técnica padrão de 0,1% Dodecil sulfato de sódio, 10% gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de electroforese 14. Executar amostras com 10 mM de β-mercaptoetanol (condições redutoras) ou sem (condições não-redução) dependendo o anticorpo usado para detectar a proteína de interesse.
  7. Transferir as proteínas separadas do polyacrylamide gel para uma membrana de transferência do polyvinylidene difluoreto (PVDF) com 0,45 µm poro tamanho usando o procedimento padrão.
  8. Após a transferência, lave a membrana duas vezes com PBS, polisorbato-20 de 0,1% (PBS-T) e bloquear sites de ligação inespecífica, adicionando 20 mL 2% BSA, diluído em PBS-T para fosfoproteínas detectadas ou 5% leite desnatado em PBS-T para proteínas totais, sob agitação (90 min, RT).
  9. Diluir o anticorpo selecionado em 10 mL de tampão de bloqueio de apropriado na concentração recomendada e incubar a membrana sob agitação (ON, 4 ° C). Alternativamente, colocar a membrana em sacos plásticos fechados e usado 5 mL de anticorpo diluído.
  10. No dia seguinte, lave a membrana três vezes (excesso PBS-T, 15 min, RT).
  11. Incubar a membrana sob agitação (30 min, RT) com 10 mL de anticorpo secundário correspondente limite a peroxidase de rábano (HRP) diluído na 1:10,000 no buffer de bloqueio apropriado.
  12. Lavar a membrana três vezes sob agitação (excesso PBS-T, 15 min, RT).
  13. Incuba a membrana por 1 min com 0,1 mL/cm 2 de quimioluminescência de carcaça reforçada a peroxidase (ECL). Coloque a membrana drenada entre duas folhas de plástico transparentes e insira-o sistema de detecção de quimioluminescência que inclui uma câmera de Charged-Coupled dispositivo (CCD).
    1. Usar a câmera do CCD para detectar o sinal e seu software para gravar imagens com o programa acumulativo (imagens exibir sinal acumulada em cada exposição s 30 por um período total de 15 min).
  14. Quantificar a intensidade da banda por densitometria usando o software ImageJ seguindo o protocolo descrito na guia usuário 15.
    1. Aberto a amostra no software ImageJ e selecione a banda de interesse com a ferramenta de seleção retangular.
    2. Selecione a primeira pista e imprensa enredo pistas para obter as perfil parcelas.
    3. Delimitar a área dos picos com a seleção linear.
    4. Medir o tamanho de cada banda clicando-se no interior de cada pico.
    5. Representam os resultados em relação ao carregar o controle de proteínas (β-actina, tubulina, etc.).

6. Avaliar endotelial fator liberado da ativação dos leucócitos pelos ensaios de adesão

  1. obter os meios condicionados endoteliais.
    1. Tratar as células MLEC-04, conforme indicado no ponto 2 e recolher a sobrenadante de cultura após estimulação de 24 h com LPS (100 ng/mL).
    2. Coletar os meios condicionados dos células tratadas MLEC-04 e centrífuga (600 x g). Manter o sobrenadante em alíquotas de 0,5 mL a-80 ° C até o uso.
  2. Ensaio de adesão de leucócitos
    1. revestir as placas de 96 poços com 50 µ l/poço de proteínas da matriz extracelular selecionado diluído em PBS (exceto para o colágeno, que é diluído em 0,1 M de ácido acético): fibronectina (1-10 µ g/mL ), (1-10 µ g/mL) de laminina e colágeno tipo I (10-40 µ g/mL). Deixe ON a 4 ° C.
    2. Descartar a mídia revestida e bloquear sites de ligação inespecíficas em poços com 150 µ l PBS, 1% BSA inactivados por calor (1 min, 100 ° C) por 90 min no RT.
    3. Lavar os poços duas vezes com PBS e adicionar 100 µ l de previamente coletados endotelial condicionado mídia (seção 6.1) aos poços.
      Nota: As placas estão prontas para realizar o ensaio de adesão.
    4. Cultura do mouse monócito-macrófago linhagem celular J774 numa incubadora biológica (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO 2) com Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI), 10% FBS, 1% P/S.
      Nota: As células de J774 crescem em suspensão.
    5. Coletar as células J774 em um tubo de 15 mL e centrífuga (300 x g, 5 min). Desprezar o sobrenadante e ressuspender o celular com media 10 mL de soro-free. Conte as células em uma câmara de Neubauer. Centrifugar as células (300 x g, 5 min), desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em media serum-free em 15 x 10 4 J774 células por meios de comunicação 50 social µ l.
    6. Adicionar 15 x 10 4 J774 células a cada bem em 50 µ l soro livre de meios de comunicação e incube por 15 min a 4 ° C, seguido de 1 h a 37 ° C, a incubadora de célula 2 CO.
    7. Lavar os poços duas vezes, delicadamente adicionando PBS quente; centrifugar (300 x g, 5 min) e descartar o sobrenadante por uma pressão de 180° do pulso de cima para baixo e recuperação rápida para a posição original. Corrigir a célula anexadas, adicionando-se 100 µ l/poço de paraformaldeído 4% (PFA) em PBS e incubar (10 min, RT).
    8. Descartar a mídia suavemente e permeabilize as células com 2% de metanol em PBS por 2 min em RT. Discard a mídia suavemente e manchar as células pela adição de 50 µ l/poço de violeta de cristal de 0,5% em 20% de metanol para 90 s no RT.
    9. Lavar a placa com água corrente abundante, elimine o excesso de líquido e deixe-o secar ao ar livre. Relatório das células anexadas por câmera digital acoplada a um microscópio de luz.
    10. Diluir a célula coloração adicionando-se 100 µ l/poço de citrato de sódio 0,1 M, 50% de etanol. Medida da absorvância em 545 nm e representam os resultados como unidades arbitrárias de absorvância ou percentagem de adesão considerando 100% como adesão celular chegaram aos poços revestida com maior concentração de ligante

7. Teste de ativação endotelial por ensaio de co de adesão leucócito-endotélio

  1. tratar as MLEC-04 células em placas de 96 poços, conforme descrito na seção 2 e incubar com LPS (6h, 37 ° C).
  2. Etiqueta fluorescente J774 células com Carboxyfluorescein succinimidil éster (CSFE).
    1. Lavar o J774 células em PBS, seguindo o procedimento em 6.2.5. Contagem de células pelo Neubauer método de câmara e ressuspender a 1 x 10 6 células/mL em PBS, 0,1% BSA.
    2. Incube as celulas com CFSE (5 µM, concentração final) por 20 min a 37 ° C. adicionar 5 mL incompleta meios de comunicação e incubar (5 min, 4 ° C).
    3. Lave uma vez com mídia incompletas, conforme explicado em 6.2.5. Ressuspender em 15 x 10 4 células/100 µ l e prossiga para o ensaio de adesão co.
  3. Após o tratamento do endotélio, lavar os poços três vezes com mídia incompleta. Adicione células CFSE-J774 (15 x 10 4 células/100 µ l) a cada endotelial revestido bem. Incubar a placa por 10 min a 4 ° C, seguido por 60 min a 37 ° C.
  4. Lavar os poços suavemente, conforme descrito em 6.2.7., usando o PBS aquecido e relatório a adesão de J774 à camada endotelial por dois métodos a seguir:
    1. lisar as células em 0.1 M Tris-HCl pH 8.8, SDS 1% (100 µ l/poço) e medir a CFSE-J774 sinal por fluorometry (excitação/emissão = 492 nm nm/517). Representam os resultados como unidades arbitrárias de intensidade de fluorescência ou percentagem de adesão em relação ao controle positivo (sinal de células totais adicionadas a cada poço).
    2. Consertar as células em 4% PFA e relatório a fixação das células CFSE-J774 para o endotélio através da visualização sob um microscópio de fluorescência (excitação/emissão = 492 nm nm/517).

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Resultados

Avaliação da ativação de células endoteliais induzida por LPS por RT-qPCR

As soro fome MLEC-04 células foram estimuladas por 100 ng/mL de LPS para 6h, e a expressão de gene endotelial foi avaliada por meio de RT-qPCR, comparando a expressão de marcadores de ativação para a condição de repouso. Como mostrado na figura 1A, as células de LPS incubados MLEC-04 induziram a expressão de RNAm de moléculas de ...

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Discussão

Este protocolo endotelial descreve uma tecnologia gradual que estabelece as bases para explorar novos mecanismos envolvidos na regulação da resposta inflamatória. Essas abordagens baseiam-se no estudo da atividade endotelial estimulado por LPS e avaliar os passos críticos envolvidos no recrutamento de leucócitos durante a resposta inflamatória, especificamente: liberação de citocinas endotelial, adesão endotelial adesão de expressão e leucócitos moléculas para a camada vascular. Uma vez que os parâmetros endoteliais são ...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Economía y competitividade (MINECO) e o Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (número de concessão IERPY 1149/16 para A.L.; MPY 1410/09 para S. Hortelano); pelo MINECO através do Fondo de Investigación en Salud (FIS) (subvenções números PI11.0036 e PI14.0055 para S. Hortelano). S. Herranz foi apoiado por IERPY 1149/16 de ISCIII.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
GelatinaSigma G9391
DMEM-F12LonzaBE12-719F
Soro bovino fetalSigmaA4503
Penicilina estreptomicinaLonzaDE17-602E
TripsinaLonzaBE17-160E
EDTASigmaED2SS
LPSSigmaL2880
TrizolSigmaT9424tampão de extração de RNA
IsopropanolSigma33539
Etanol absolutoPanreac1.310.861.612
Pure H2OQiagen1017979RNAse livre
AgarosePronadisa8020
Mancha para géis de agaroseInvitrogens33102
SuperScript III First-Strand SynthInvitrogen18080051Reagentes para RT-PCR
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385610Coloração fluorescente para qPCR
MicroAmp Fast Optical 96-WellApplied Biosystems4346906Placas para qPCR
U-bottom 96 placas de poçosFalcon353072
Tubos de citometriaFalcon352054
TX100Panreac212314Surfactante não iônico
Tris-HClPanreac1.319.401.211
Cloreto de sódioMerck1.064.041.000
Pirofosfato de sódioSigma221368
Fluoreto de sódioSigmaS7920
Orthovanadato de sódiosigma13721-39-6
Inibidor de protease coquetelsigmaP8340
Pierce BCA Protein Assay KitPierce23225Reagentes para ensaio de ácido bicinchonínico
β-mercaptoetanolmerck805,740
PVDF Membrana de Transferência, 0.45 µ mThermo Scientific88518
Tween-20Panreac1,623,121,611Polissorbato 20
PBSLonzaBE17-515Q
ECLMilliporeWBKLS0500
FibronectinaSigmaF1141
LamininaSigmaL2020
Colágeno tipo ISigmac8919
Ácido acéticoPanreac1.310.081.611
Azul de tripanoSigmaT8154
ParaformaldeídoSigmaP6148
MetanolPanreac1.310.911.612
Cristal violetaSigmaHT90132
Citrato de sódioSigmaC7254
Etanol 96%Panreac1.410.851.212
CFSESigma21888
RPMILonzaBE12-115F
SDSBio-Rad161-0418
Infinite M200TecanM200Leitor de microplacas multimodo
Gel Doc 2000Bio-Rad2000Sistema de documentação de gel
StepOnePlusApplied BiosystemsStepOnePlusqPCR system
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi BiotecAnalyzer 10Equipamento de citometria
ChemiDoc MPBio-RadMPSistema de detecção de quimioluminescência
NomeEmpresa<strong>Número de catálogoComentários
Anticorpos
PECAM-1BD Biosciences553370Use a 10 µ g/mL
ICAM-2Biolegend1054602Uso a 10 µ g / mL
E-selectinaBD Biosciences553749Uso a 10 µ g/mL
VCAM-1BD Biosciences553330Use a 10 µ g/mL
ICAM-1Becton Dickinson553250Use a 10 µ g/mL
anti-rato IgG-FITCJackson Immuno Research112-095-006Use em 10 µ g/mL
anti hamster armênio-FITCJackson Immuno Research127-095-160Use em 10 µ g/mL
Controle de isotyope IgG de ratoInvitrogen10700Use a 10 µ g/mL
de controle de isotipo IgG de hamster armênioInvitrogenPA5-33220Use a 10 µ g/mL
P-Iκ β-&alfa;Sinalização Celular2859Use em 10 µ g/mL
β-ActinSigmaA5441Use a 10 µ g/mL
P-ERKCell Signaling9101Use a 10 µ g/mL
anti-camundongo HRPGE HealthcareLNXA931/AEUso a 1:10.000
anti-coelho HRPGE HealthcareLNA934V/AGUso a 1:10.000
anti-rato HRPSanta CruzSc-3823Uso a 1:10.000

Referências

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