Funções de endossomo precoce dependem de polimerização de F-Actina. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio, tornando assim esta complexa série de reações passíveis de bioquímicos e genéticos manipulações.
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Artigo de método
In Vitro Polimerização de F-Actina no início endossomos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Muitas funções endossomo precoce, particularmente carga proteína classificação e membrana deformação, dependem de patches de curto F-Actina filamentos nucleated na membrana da CDDP. Nós estabelecemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio, tornando assim esta complexa série de reações passíveis de genética e bioquímica manipulações. CDDP frações são preparadas pela flutuação em gradientes de sacarose de celulas que expressam a início CDDP proteína GFP-RAB5. Citosólica frações são preparadas a partir de lotes separados das células. Tanto CDDP e citosólica frações podem ser armazenadas congelados em nitrogênio líquido, se necessário. No ensaio, o CDDP e frações citosólica são misturadas, e a mistura é incubada a 37 ° C, sob condições adequadas (por exemplo, força iônica, reduzindo o ambiente). No momento desejado, a mistura de reação é fixo, e a F-Actina é revelado com faloidina. Polimerização e nucleação de actina são então analisados por microscopia de fluorescência. Aqui, nós relatamos que este ensaio pode ser usado para investigar o papel dos fatores que estão envolvidos na nucleação de actina na membrana, ou no subsequente alongamento, ramificação ou reticulação de filamentos de actina-F.
Introdução
Em células eucarióticas superiores, proteínas e lipídios são internalizados em endossomos iniciais onde ocorre a classificação. Algumas proteínas e lipídios, que são destinados a ser reaproveitado, são incorporados em regiões tubulares dos endossomos iniciais e então transportados para a membrana plasmática ou para o trans-Golgi network (TGN)1,2. Em contraste, outras proteínas e lipídios são seletivamente empacotados em regiões dos endossomos iniciais que exibem uma aparência multivesiculares. Estas regiões expandir e, após descolamento de membranas de CDDP cedo, eventualmente maduro em vesículas de transporta....
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Protocolo
1. soluções e preparações
Nota: todos os buffers e soluções devem ser preparadas em bidestilada (dd) H 2 O. Porque varia o estado de hidratação de sacarose, a concentração final de todas as soluções de sacarose deve ser determinada usando um refratômetro.
- Preparar fosfato salino sem cátions divalentes (PBS-): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4 e 6,5 mM Na 2 HPO 4. Ajuste o pH para 7,4. Esterilizar em autoclave (1 ciclo a 121 ° C por 15 min) e armazenar à temperatura ambiente.
- Prepare uma solução stock de imidazol 300mm: 0,204 g de imidazol em 10 mL de DDQ
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Resultados
Para obter insights sobre a formação de manchas de F-Actina nas membranas de endossomo precoce, seguimos o protocolo descrito na Figura 2. Resumidamente, as células foram transfectadas com GFP-RAB5 e então endossomos iniciais foram preparados pelo fraccionamento subcelular. Estes purificada endossomos iniciais foram incubados com o citosol a fim de proporcionar a actina, em si, bem como outros fatores possivelmente envolvidos na reação. No final do período de.......
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Discussão
Actina desempenha um papel crucial na endossomo membrana dinâmica4,14. Informamos anteriormente que a polimerização e a nucleação de actina ocorrem em endossomos iniciais, formando pequenas manchas de F-Actina ou redes. Estas redes de F-Actina são absolutamente necessários para o transporte de membrana além endossomos iniciais ao longo da via de degradação. Interferir em qualquer etapa deste processo de nucleação e polimerização impede endossomo maturação e, port.......
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Apoio recebido dos Swiss National Science Foundation; o programa Sinergia suíço; os polonês-Swiss investigação programa (PSPB-094/2010); o NCCR em biologia química; e LipidX da iniciativa Suíça SystemsX.ch, avaliada pela Swiss National Science Foundation (a G.). O. M. foi apoiado por uma comunhão de longo prazo EMBO (ALTF-516-2012).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Acetato de magnesiun tetrahidratado | Fluka | 63047 | |
| Ditiotreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sacarose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptina | Roche | 11017101001 | |
| Pestatina | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Sondas Moleculares | A34055 | |
| Actina rodamina | Citoesqueleto. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poli(álcool vinílico), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-caseína | Filtro Sigma-Aldrich | C6905 | |
| 0.22 μ m | Millex | SL6V033RS | |
| Pratos redondos de 10 cm para cultura de células | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Pipeta de plástico Pasteur | Assistent | 569/3 40569003 | |
| Tubo de polipropileno de 15 mL | TPP | 91015 | |
| Agulha hipodérmica 22G Preto 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Seringas estéreis Luer-slip 1mL sem agulha | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro lâminas de vidro | Assistent | 2406 | |
| 18 x 18 mm lamínula de vidro | Assistent | 1000/1818 | |
| Tubo de centrífuga SW60 | Relha | Beckman 344062 | |
| Tubo de centrífuga TLS-55 | Relha | Beckman 343778 | |
| 200-μ L ponta amarela | Starlab | S1111-0706 | |
| 1.000-μ L Blue Ponta Graduada | Starlab | S1111-6801 | |
| Tubo de ensaio de 1,5 mL | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| Lamínula redonda de 18 mm de diâmetro | Assistent | 1001/18 | |
| Prato redondo de 35 mm de diâmetro com fundo de vidro de 20 mm (0,16 - 0,19 mm) | Refratômetro científico in vitro | D35-20-1.5-N | |
| Carl Zeiss | 79729 | ||
| Limpador de plasma | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrífuga | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Ultracentrífuga de mesa | relha Beckman relha | TL-100 | |
| rotor SW60 | relha Beckman | 335649 | |
| rotor TLS-55 | relha Beckman relha | 346936 | |
| Microscopia confocal | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD reagente de transfecção | Promega | E2311 | |
| Reagente de ensaio de proteína A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Reagente de ensaio de proteína B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Reagente de ensaio de proteína S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Raspador de células | caseiro | Peça de borracha de silicone de cerca de 2 cm, cortada em um ângulo muito agudo e presa a uma barra de metal ou presa com pinça | |
| Refratômetro | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Aminoácidos Não Essenciais (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamina | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Medidor de pH 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
Referências
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al.
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Reimpressões e permissões
