Um ensaio de bioluminescência em vitro para determinar celular ritmo circadiano em células epiteliais mamárias é apresentado. Este método utiliza plasmídeos de repórter de pilha mamífera expressando desestabilizado luciferase sob o controle do promotor do gene de período 2 . Ele pode ser adaptado para outros tipos de células para avaliar efeitos de órgãos específicos no ritmo circadiano.
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Artigo de método
In Vitro Ensaio de bioluminescência para caracterizar o ritmo circadiano em células epiteliais mamárias
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ritmo circadiano é um fundamental processo fisiológico presente em todos os organismos que regula os processos biológicos, variando de expressão gênica de comportamento de dormir. Nos vertebrados, ritmo circadiano é controlado por um oscilador molecular que funciona no núcleo supraquiasmático (SCN; marcapasso central) e composto por tecidos mais periféricos de células individuais. Mais importante ainda, perturbação do ritmo circadiano pela exposição à luz durante a noite, estressores ambientais e/ou substâncias tóxicas é associada com aumento do risco de doenças crônicas e envelhecimento. A capacidade de identificar os agentes que podem prejudicar a centrais e/ou periféricos relógios biológicos e agentes que podem prevenir ou atenuar os efeitos da perturbação circadiano, tem implicações significativas para a prevenção de doenças crônicas. Embora modelos de roedores podem ser usados para identificar riscos e agentes que induzem ou impedem/atenuar perturbações circadiana, estas experiências exigem um grande número de animais. Estudos in vivo também necessitam de infra-estrutura e recursos significativos e exigem que os investigadores a trabalhar a noite toda. Assim, há uma necessidade urgente de um tipo de célula adequado em vitro sistema de tela para os disruptores circadianos ambientais e realçadores em tipos de células de diferentes órgãos e Estados de doença. Nós construímos um vetor que impulsiona a transcrição da luciferase desestabilizado em células eucarióticas, sob o controle do promotor gene período 2 humano. Essa construção circadian repórter foi estàvel transfected em células epiteliais mamárias humanas, e células circadian repórter responsivos foram Selecionadodas para desenvolver o ensaio de bioluminescência em vitro . Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para estabelecer e validar o ensaio. Nós fornecemos mais detalhes para a prova de experimentos de conceito, demonstrando a capacidade do nosso ensaio em vitro de recapitular na vivo efeitos de vários produtos químicos sobre o celular relógio biológico. Os resultados indicam que o ensaio pode ser adaptado a uma variedade de tipos de células para a tela para ambos os disruptores ambientais e quimiopreventivo potenciadores de relógios circadianos.
Introdução
O relógio circadiano regula uma ampla gama de processos biológicos de diurna expressão de genes para dormir o comportamento em um ritmo previsível com uma periodicidade de aproximadamente 24 h. epidemiológico estudos sugerem fortemente que perturbação crônica de circadiano ritmo aumenta o risco de cancro da mama e da próstata em trabalhadores de turno, incluindo enfermeiros e tripulações de voo a1,2,3. Esses achados são corroborados por estudos de roedores, demonstrando que a exposição aos ciclos de luz durante a noite, ou luz luz constante, que imitam a incidência de tumor d....
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Protocolo
1. construção de PER2 promotor Driven desestabilizado Luciferase Reporter Vector
- comprar um personalizado pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vector que contém a codificação rLuc e humanos de cDNA Fragmento de promotor PER2 (hPER2P, 941 bp) no site entre Sac I e Hind III em clonagem múltiplos região 17.
- Cortar o fragmento de promotor PER2 humano (hPER2P, 941 bp) fora do vetor.
- Adicionar 2,5 µ l de buffer de enzima de restrição, 10 µ l (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vector e 1 μL de cada das enzimas de restrição, ....
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Resultados
Vetor de repórter Circadian bioluminescência: PER2 humana orientada por promotor expressão variante desestabilizado luciferase
A sequência de DNA, que inclui um fragmento de bp 941 derivado o promotor PER2 humano, usado para construir o vetor de repórter circadiano, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, primeiro foi analisada a presença de elementos reguladores conhecidos para regular expressão de genes circadi.......
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Discussão
Em células de mamíferos, periodicidade do relógio circadiano é regulada por loops de feedback transcriptional/translacional interconectadas. Heterodímeros de Bmal1 e o relógio ou o Npas2 regular circadian transcrição por ligação aos promotores do núcleo CGs, incluindo Per2 e chorare numerosos CCGs4elementos E-caixa. Como eles se acumulam na célula, heterodímeros de por: Cry post-translationally são modificados e transportados para o núcleo para reprimir a atividade transcricional.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela sociedade 2012 de toxicologia (SOT)-Colgate Palmolive Grant para pesquisa Alterative (M. Fang) e a pesquisa de colaboração internacional fundo de Animal e planta agência de quarentena, República da Coreia (M. Fang), e conceder as NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Gostaríamos de agradecer o Dr. Zheng Chen (McGovern escola médica da Universidade do Texas Health Science Center em Houston) para sua discussão útil, Sr. Juan de Shao-An por sua assistência experimental e a Sra. Kimi Nakata para a leitura de prova.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vetor | SwitchGear Genomics | S700000 | vetor personalizado |
| pGL4.18 [Luc2P / Neo] vetor | Promega | 9PIE673 | vetor de expressão de luciferase desestabilizado |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224041 | para subclonagem |
| TOPO TA kit de clonagem | Invitrogen | K4500-02 | com One Shot TOP10 E. coli quimicamente competente |
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | Enzima |
| de restrição Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | Enzima de restrição |
| CutSmart buffer | New England BioLabs | B7204S | tampão enzimático de restrição |
| Qiagen | 28704 | Purificar fragmentos de DNA de gel de agarose | |
| Kit de purificação de PCR | Qiagen | 28104 | Limpeza de DNA LB |
| Modificação de Miller | TEKNOVA | L8600 | Para cultura de E. Coli transformada |
| LB Agar Plate | TEKNOVA | L1902 | Para seleção branca/azul |
| QIAprep spin miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Para extração de DNA de plasmídeo |
| EndoFree plasmídeo maxi prep Kit | Qiagen | 12362 | Para extração de DNA de plasmídeo |
| FuGene HD | Promega | E2311 | Reagente de transfecção |
| Opti-MEM reduzido meio sérico | Invitrogen | 31985-062 | Para transfecção |
| Linha celular MCF10A | Coleção de cultura de tipo americano | CRL-10317 | Células epiteliais mamárias |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | Meio de crescimento epitelial mamário |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Kit SingleQuot MEGM Médio Epitelial Epitelial Mamário |
| Lonza | CC-4136 | Suprimentos & Fatores de crescimento | |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | Reagente para subcultura |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | Lave células em placas de cultura |
| Água Destilada UltraPure | Invitrogen | 10977 | Diluir 10X D-PBS Placa de cultura de |
| tecidos (35 mm) | BD/Falcon | 353001 | placa de cultura de células adequada para LumiCycle |
| Graxa de silício | Fisher | NC9044707 | Para prato de vedação com meio de registro |
| Vidro de cobertura redondo | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | Para prato de vedação com meio de registro |
| Toxina da cólera | Sigma | C8052 | Suplemento para meio de crescimento |
| Sulfato G418 (Geniticina) | Invitrogen | 10131035 | Antibiótico para seleção de células transfectadas estáveis |
| Ampicilina | Sigma | A9393 | Para seleção de colônias |
| Forskolin | Sigma | F6886 | Agente de sincronização |
| Melatonina | Sigma | M5250 | Agente de sincronização |
| Dexametasona | Sigma | D4902 | Agente de sincronização |
| Soro de cavalo | Sigma | H1138 | Agente de sincronização |
| d-Luciferina, sal de sódio | Invitrogen | L2912 | Substrato de luciferase |
| IC261 | Sigma | 10658 | Controle positivo para disruptor circadiano |
| Metilnitrosoureia (NMU) | Sigma | N1517 | Carcinógeno específico mamário |
| Metilselenocisteína (MSC) | Sigma | M6680 | Selênio orgânico (agente quimiopreventivo) |
| EX527 | Sigma | E7034 | Inibidor específico de SIRT1 |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 & |
| Espectrofotômetro | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | Quantificar o sistema 9700 do PCR de GeneAmp do nucleotídeo |
| Biosystems | aplicados N805-0200 | para a série | |
| 8000 DH | incubadora | NAPCO | da experiência da biologia molecular para a cultura de pilha no CO2 de 5% em 37 ° C |
| Centrífuga de mesa com recondicionador | Eppendorf | 5430R | Para experiência de biologia molecular |
| Centrífuga com balde oscilante | Eppendorf | 5810 R | Para cultura de células |
| Microscópio invertido | Nikon | 80124 | Contraste de fase opcional |
| Capuz de cultura de tecidos | Labconco | Classe II A2 | BSL-2 certificado |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | não disponível | Detector de luminoscência |
Referências
- Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127(2015).
- Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012)....
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Reimpressões e permissões
