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Artigo de método

In Vitro Ensaio de bioluminescência para caracterizar o ritmo circadiano em células epiteliais mamárias

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DOI:

10.3791/55832

⸱

28 de setembro de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, NIEHS Center for Environmental Exposures and Disease, Environmental and Occupational Health Sciences Institute, Rutgers University, 2Veterinary Drugs & Biologics Division, Animal and Plant Quarantine Agency

Neste artigo

Resumo

Um ensaio de bioluminescência em vitro para determinar celular ritmo circadiano em células epiteliais mamárias é apresentado. Este método utiliza plasmídeos de repórter de pilha mamífera expressando desestabilizado luciferase sob o controle do promotor do gene de período 2 . Ele pode ser adaptado para outros tipos de células para avaliar efeitos de órgãos específicos no ritmo circadiano.

Resumo

O ritmo circadiano é um fundamental processo fisiológico presente em todos os organismos que regula os processos biológicos, variando de expressão gênica de comportamento de dormir. Nos vertebrados, ritmo circadiano é controlado por um oscilador molecular que funciona no núcleo supraquiasmático (SCN; marcapasso central) e composto por tecidos mais periféricos de células individuais. Mais importante ainda, perturbação do ritmo circadiano pela exposição à luz durante a noite, estressores ambientais e/ou substâncias tóxicas é associada com aumento do risco de doenças crônicas e envelhecimento. A capacidade de identificar os agentes que podem prejudicar a centrais e/ou periféricos relógios biológicos e agentes que podem prevenir ou atenuar os efeitos da perturbação circadiano, tem implicações significativas para a prevenção de doenças crônicas. Embora modelos de roedores podem ser usados para identificar riscos e agentes que induzem ou impedem/atenuar perturbações circadiana, estas experiências exigem um grande número de animais. Estudos in vivo também necessitam de infra-estrutura e recursos significativos e exigem que os investigadores a trabalhar a noite toda. Assim, há uma necessidade urgente de um tipo de célula adequado em vitro sistema de tela para os disruptores circadianos ambientais e realçadores em tipos de células de diferentes órgãos e Estados de doença. Nós construímos um vetor que impulsiona a transcrição da luciferase desestabilizado em células eucarióticas, sob o controle do promotor gene período 2 humano. Essa construção circadian repórter foi estàvel transfected em células epiteliais mamárias humanas, e células circadian repórter responsivos foram Selecionadodas para desenvolver o ensaio de bioluminescência em vitro . Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para estabelecer e validar o ensaio. Nós fornecemos mais detalhes para a prova de experimentos de conceito, demonstrando a capacidade do nosso ensaio em vitro de recapitular na vivo efeitos de vários produtos químicos sobre o celular relógio biológico. Os resultados indicam que o ensaio pode ser adaptado a uma variedade de tipos de células para a tela para ambos os disruptores ambientais e quimiopreventivo potenciadores de relógios circadianos.

Introdução

O relógio circadiano regula uma ampla gama de processos biológicos de diurna expressão de genes para dormir o comportamento em um ritmo previsível com uma periodicidade de aproximadamente 24 h. epidemiológico estudos sugerem fortemente que perturbação crônica de circadiano ritmo aumenta o risco de cancro da mama e da próstata em trabalhadores de turno, incluindo enfermeiros e tripulações de voo a1,2,3. Esses achados são corroborados por estudos de roedores, demonstrando que a exposição aos ciclos de luz durante a noite, ou luz luz constante, que imitam a incidência de tumor de jet-lag aumento e acelera o crescimento de tumor4,5. Com base em dados de estudos humanos e roedores, a Agência Internacional para pesquisa sobre câncer classificados trabalho por turnos como um provável carcinogênico humano (tipo 2A) em 20106.

Anteriormente, temos demonstrado que uma dose única de cancerígena de carcinógeno específico tumor mamário, N- nitroso-N- methylurea (NMU), interrompeu a expressão circadiana dos principais genes circadianos (CGs) (por exemplo, período 2 , Per2) e vários circadian controlado por genes (CCGs), incluindo danos ao DNA responsivo-chave e reparar os genes (DDRR) na glândula mamária alvo (mas não no fígado). Além disso, redefinindo a expressão circadiana dos genes tanto Per2 e DDRR no sentido normal por um regime quimiopreventivo de dietético L-metil-selenocisteína (MSC) reduziu a incidência de tumor em 63%. Estas conclusões foram os primeiros a mostrar um link mecanicista entre ritmo circadiano, carcinogênese química e Quimioprevenção7,8. Riscos em relação a outros tóxicos ambientais mostrados interromper genética circadian expressão na vivo também estão associados com risco aumentado de doenças ambientais9,10. Compreender os mecanismos que vinculam circadian interrupção por tóxicos ambientais e patogênese pode originar abordagens mecanicamente para a prevenção de doenças. No entanto, estudos destinados a definir as interacções entre as exposições e ritmo circadiano geralmente são realizadas in vivo. Um típico na vivo experimento a investigar que o impacto sobre o ritmo circadiano requer um grande número de animais, como os tecidos de pelo menos três controlam e três animais expostos devem ser coletados a cada 3-4 h durante um período de 24 ou 48 h. Desenvolvimento de um sistema validado em vitro que recapitula as observações na vivo e mecanismos que, por conseguinte, não só reduzir o número de animais necessários, mas também dramaticamente reduzir custos experimentais e a exigência que pesquisadores trabalham continuamente ao longo de um período de 24-48 h. Além disso, um sistema validado em vitro poderia ser usado para o rastreio de alta taxa de transferência de compostos e/ou alteração genética que afetam o ritmo circadiano, ou sua resposta a estressores ambientais ou substâncias tóxicas. Portanto, a combinação estratégica de modelos in vitro e in vivo e experiências são necessárias para obter insights diferentes com foco diferente.

Nos mamíferos, osciladores circadianos existem não só nos neurônios especializados do SCN, mas também em tipos de células mais periféricos. Estes pulsos de disparo moleculares são similares em linhas de células de fibroblastos estabelecida e em fibroblastos primários de embriões ou animais adultos; no entanto, há uma necessidade de tecido celular modelos específicos do tipo11. Consequentemente, estudos tradicionais da atividade locomotora em vivo, SCN explants ex vivoe ensaios baseados em células em vitro em células de fibroblastos imortalizado são amplamente utilizados para estudar a célula autónomos defeitos circadianos. No entanto, não há provas indicando que um em vitro fibroblasto baseada em célula ensaio pode recapitular circadianos mecanismos e respostas presentes em células de outros órgãos periféricos na vivo. Diferentes tipos de células podem ter padrões distintos de expressão gênica, metabolismo e DDRR, e as ligações entre a toxicidade e a expressão genética circadian podem ser o tipo de célula específica e/ou modulada por diferentes parâmetros fisiológicos. Além disso, osciladores circadianos em sistemas baseados em fibroblasto não foram totalmente avaliados para respostas a tóxicos ambientais, estressores e agentes preventivos que ligam as exposições aos mecanismos de desenvolvimento de doenças e prevenção. Assim, há uma necessidade de facile, validado-tipo de células específicas, em vitro bioluminescência ensaios para estudar órgão específico ambiental circadian os disruptores. Apesar de ter uma variedade de modelos de relógio celular (por exemplo, no fígado, queratinócitos e as células de gordura, bem como uma linha de celular de osteossarcoma) foram desenvolvidas nos últimos anos12,13,14, 15, o ensaio descrito aqui é o primeiro modelo de relógio celular em células epiteliais da mama e a primeira demonstração de recapitular na vivo respostas a estressores ambientais, substâncias tóxicas, drogas e agentes quimiopreventivo.

Renilla luciferase (rLuc) e a luciferase de vaga-lume são 30-61 kDa proteínas monoméricas que não exigem posttranslational de processamento para a atividade enzimática e podem funcionar como um repórter genética imediatamente após a tradução. Uma vez que o substrato associa-se com a enzima luciferase, a reação bioquímica catalisada gera um flash de luz. Assim, a luciferase construções são amplamente utilizadas como um gene expressão repórter sistema em vitro e in vivo. No entanto, em estudos de ritmo circadiano, o utilitário do repórter do luciferase é limitado pelo relativamente longo Half-Life da proteína luciferase (T1/2 = h 3,68) relativamente ao período (especialmente para o período curto) para que as alterações no gene circadian expressão; no entanto, numerosos estudos ao longo dos anos usaram com sucesso o gene da luciferase no vetor pGL3, indicando que a luciferase rapidamente degradável pode não ser necessário para relatórios dos ritmos circadianos, especialmente para os ritmos com um período mais longo, tais como 24 h. Portanto, um repórter do usando vetor de luciferase desestabilizado, pGL [Luc2P/Neo], que contém hPEST (uma sequência de desestabilização da proteína) foi desenvolvido, permitindo-nos usá-lo como um vetor de repórter circadiano para nosso atual in vitro ensaio de bioluminescência. A proteína codificada pelo Luc2P tem uma meia-vida mais curta (T1/2 = 0,84 h) e, portanto, responde mais rapidamente e com uma maior amplitude a alterações na atividade transcricional do selvagem-tipo, eundicating que pode ser usado para monitorar a expressão rítmica da luciferase regulado pelo promotor PER2 com precisão em tempo real16.

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Protocolo

1. construção de PER2 promotor Driven desestabilizado Luciferase Reporter Vector

  1. comprar um personalizado pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vector que contém a codificação rLuc e humanos de cDNA Fragmento de promotor PER2 (hPER2P, 941 bp) no site entre Sac I e Hind III em clonagem múltiplos região 17.
  2. Cortar o fragmento de promotor PER2 humano (hPER2P, 941 bp) fora do vetor.
    1. Adicionar 2,5 µ l de buffer de enzima de restrição, 10 µ l (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vector e 1 μL de cada das enzimas de restrição, Sac I (unidade 10 / µ l) e Hind III (10 unidade / µ l), em um DNA/RNA/nucleotídeo livre tubo de microcentrifugadora. Adicionar água ultrapura (10.5 µ l) até 25 µ l e misture suavemente pipetando.
    2. Incubar a 37 ° C por 90 min em um bloco de aquecimento.
    3. Executar todo o volume (25 µ l) da reação de enzima de restrição em gel de agarose 0.7% contendo brometo de etídio (EtBr) para separar a hPER2P do vetor 0,0001%.
      Nota: EtBr, brometo de 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium (número de registo CAS: 1239-45-8), é um líquido inodoro e vermelho. É um agente intercalante que é comumente usado como um fluorescente tag (mancha de ácido nucleico) em eletroforese em gel de agarose e visível como uma cor laranja sob luz UV. Possíveis riscos de efeitos mutagénicos irreversíveis tenham ocorrido em animais experimentais, embora nenhuma das agências reguladoras é Categorizado como um carcinógeno 18. Portanto, nós coletados solução tampão de gel e eletroforese de agarose usado com EtBr como resíduos de risco químico e requisitado a saúde ambiental de Rutgers & segurança (REHS) para buscar e eliminar com segurança.
    4. Corte um pedaço de gel de agarose contendo uma banda de fluorescência de EtBr em 941 bp e purificar os fragmentos hPER2P do gel com um kit de extração de gel de DNA, seguido de quantificação em um espectrofotômetro, medindo a densidade de absorção (OD) no comprimento de onda de 260 nm.
  3. Linearizar 1.0 µ l (1 µ g) do vetor de expressão luciferase de vaga-lume desestabilizado, pGL [Luc2P / Neo] com o mesmo método como é descrito nas etapas 1.2.1-1.2.2. Extraia o vetor com um kit de limpeza de DNA seguido de quantificação, como descrito acima usando um spectrophotometer.
  4. Ligate a hPER2P para o vetor tornado linear pGL [Luc2P / Neo].
    Nota: pelo fabricante ' s instrução, a relação molar ideal de inserção e o vetor é 2:1. Para 50 vector ng, a quantidade ideal de inserção é calculada como 23,6 ng com um fórmula, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4,242 kb vetor] x (1/2) = 23,6 ng inserir]. Baseia-se as concentrações de hPER2P (7,26 ng / µ l) e pGL [Luc2P / Neo] (50 ng / µ l), os volumes de 50 ng pGL [Luc2P / Neo] e 23,6 ng hPER2P são calculados como 1 µ l e 3,26 µ l, respectivamente. Reação de
    1. Adicionar 2 µ l T4 DNA ligase buffer (10 X) (50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl 2, ATP de 1 mM e 10 mM DTT), 3,26 µ l (23,6 ng) hPER2P, 1 µ l (50 ng) pGL [Luc2P / Neo], e até 20 µ l de água de 13.74 µ l , misture suavemente.
    2. Adicionar 1 µ l T4 DNA ligase (400 unidade / µ l), misture delicadamente e incubar a 16 ° C durante a noite em um thermocycler e depois relaxar o vetor ligado no gelo pelo fabricante ' instrução de s.
  5. Transformar o pGL ligados vetor [hPer2P / Luc2P / Neo] para quimicamente competentes de Escherichia coli 19.
    1. Definir o banho-maria a 42 ° C, ideal caldo Super aquecimento com meio de repressão (S.O.C) catabolite (2% triptona, 0,5% de extracto de levedura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 10mm MgSO 4 e glicose de 20 mM) à temperatura ambiente , aquecer a placa de ágar Luria-Bertani (LB) (contendo 100 µ g/mL ampicilina, 80 µ g/mL X-galão e 0,5 µM IPTG) incubadora de 37 ° C e descongelar no gelo, um frasco de competentes de Escherichia coli células para cada transformação.
    2. Adicionar 6 µ l (21 ng) ligados a vetor ou 1 µ l (30 ng) vazio vector (controle negativo) para um tubo de quimicamente competentes de Escherichia coli (50 µ l) e em seguida, virar suavemente o tubo para misturar. Incubar no gelo por 30 min.
    3. Calor choque em um banho de água de 42 ° C por 30 s sem tremer e em seguida retorno ao Ice.
  6. Selecione uma colônia de e. coli transformada com um vetor ligado usando azul/branco triagem.
    1. Médio de S.O.C Adicionar 250 µ l no transformado Escherichia coli tubo e incube-lo durante 1 h a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
    2. Espalhar 10-50 µ l de transformada de Escherichia coli na superfície da placa de ágar LB uniformemente. Colocar a placa de cabeça para baixo na incubadora de 37 ° C durante a noite.
      Nota: Uma reação eficiente de clonagem deve produzir várias centenas de colónias. Chapeamento de dois diferentes volumes é recomendado para assegurar que tenha pelo menos uma placa grande, clara branca ou azul cor e colônias bem espaçadas. Quando as colônias são muito pequenas e a cor não é distinguível, usar um microscópio (10 X ou 50x) é útil.
    3. Escolher 3-6 colônias brancas das placas com palitos de dente esterilizado e liberar cada colônia no tubo de uma cultura contendo 4 mL de meio de cultura LB com ampicilina 50 de µ g/mL.
    4. Incubar os tubos a 37 ° C com agitação durante a noite a 200 rpm. Extrair o DNA usando 2 mL a 4 ml cultivadas Escherichia coli com um plasmídeo DNA extração mini prep kit pelo fabricante ' instrução de s.
  7. Verificar e analisar a inserção (hPER2P, 941 bp)
    1. digerir o ADN do plasmídeo com enzimas de restrição e executar eletroforese, conforme descrito em etapas 1.2.1-1.2.3 para confirmar se há uma inserção.
      Nota: Controle positivo (hPER2P purificado no passo 1.2.4) e o controlo negativo (e. coli transformada com um vetor vazio) foram incluídos.
    2. Sequenciar o DNA de plasmídeo selecionado usando M13 para a frente e M13 reversos primers para confirmar a orientação e a sequência de inserção em plasmídeo 19.
      Nota: Apenas uma colônia que tinha um encarte com o tamanho correto do hPER2P em eletroforese e orientação correta e sequência no resultado sequenciamento foi selecionada.
    3. Analisar o fragmento de promotor PER2 humano (hPER2P, 941 bp) sequência para os elementos normativos circadianos, incluindo E-caixa do motivo (sítio de ligação Bmal1, CAT/CGTG), CCAATC, caixa de GC e transcrição iniciar o site (CAGCGG) 20.
  8. Amplificar o selecionado Escherichia coli, adicionando o restante 2 mL cultivadas Escherichia coli em meio de cultura LB de 200 mL contendo 50 ampicilina µ g/mL e em seguida, incubando-lo durante a noite a 37 ° C, com agitação a 200 rpm.
  9. Extrair DNA com um maxi livre de endotoxinas plasmídeo prepara kit o fabricante ' instrução de s e em seguida quantificá-lo medindo OD no comprimento de onda de 260 nm com um espectrofotômetro. Alíquota e loja do Plasmídeo, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo], no congelador-80 ° C para uso futuro.

2. Transfection transiente

  1. compra e cultura de células de MCF10A
    1. compra uma linha imortalizado, não-transformadas normal humano mamária célula epitelial (MCF10A) de um comercial banco de células, onde as células são cromossómico testado e autenticado com tandem curto repetir a análise antes do congelamento. Descongelar e manter cada frasco de células congeladas em cultura para um máximo de 8 semanas.
      Nota: Ao contrário de outras células, estas células têm contato inibição quando chegarem ao ~ 70% confluência. Requer que subcultura é conduzida em ~ 70%.
    2. Cultura de células com meio de cultura de células epiteliais mamárias (MEGM), contendo meio basal epitelial mamário (MEBM), suplementos de crescimento e toxina da cólera em uma incubadora de cultura celular em 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO 2.
      Nota: Compra de fatores de crescimento de ready-to-use fornecidos em SingleQuot (SQ) e obter a toxina da cólera separadamente. As concentrações finais dos suplementos de crescimento são 0,4% bovina extrato pituitário, insulina 0,1%, 0,1% hidrocortisona, fatores de crescimento epidérmico humano de 0,1%, toxina da cólera 100 ng/mL e 0,05% de sulfato de gentamicina e 0.05% anfotericina B.
    3. Dissociar as células em placa de cultura de 10 cm por incubação com 10 mL de tripsina/EDTA para ~ 20 min e depois neutralizar a tripsina adicionando tripsina 10 mL solução de neutralização. Recolher todas as células com HEPES buffer solução salina (HBSS).
    4. Contar as células com um hemocytometer sob um microscópio invertido e calcular a concentração da suspensão única célula e então propagar um certo número de células, conforme necessário. Agite as placas cuidadosamente, para se obter uma distribuição uniforme de células em cada prato. Incubar as células na incubadora de cultura celular em 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO 2.
      Nota: Compre um pack de reagente de subcultura contendo tripsina/EDTA, solução neutralizadora de tripsina e HBSS usar.
  2. Transfection transiente de células com o vetor circadian construído.
    1. Semente 2 x 10 5 MCF10A células uniformemente na cultura de 35 mm prato com MEGM e crescer a confluência de 20-30% (dia seguinte).
      2. Mídia de soro
    2. quente até o reduzido (por exemplo, Opti-MEM) em 37 ° C água banho e transfecção reagente em temperatura ambiente por 30 min. diluir o plasmídeo construído (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) a 30 ng / µ l com endo-toxina livre Tampão Tris-EDTA (TE) e mantenha em temperatura ambiente.
    3. Preparar a mistura de transfeccao Plasmideo em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL adicionando 63,6 mídia de µ l soro reduzida quente primeiro e, em seguida, adicionando 33,4 µ l (0.1 µ g) plasmídeo e misture suavemente pipetagem, e finalmente adicionando 3 µ l do transfection reagente diretamente para o centro do tubo sem tocar a parede. Após a mistura suavemente pipetando, manter em temperatura ambiente por 30 min.
    4. Deixar a mistura inteira do plasmídeo (100 µ l) diretamente sobre a superfície do centro do meio da placa e em seguida misture delicadamente agitando o prato. Cultura de células numa incubadora de CO 2 para adicionais 48-72 h
      Nota: Prevê-se que a mais alta eficiência de transfeccao seria na confluência de 40-70% dessas células devido à sua inibição de contato no ~ 70%. Portanto, transfecção funciona melhor começando com ~ 20% e pare na ~ 70% confluência.

3. Estabelecimento de bioluminescência ensaio In Vitro em células MCF10A de Transfected transitoriamente

  1. de fome as células cultivadas na confluência de ~ 70% (depois de Transfeccao para 48-72 h) em MEBM sem fatores de crescimento por 24 h.
  2. Tratar as células com o agente de sincronização (por exemplo, 50% de soro de cavalo (HS)) em MEBM para 1,5 h numa incubadora de CO 2.
    Nota: Para a seleção de um agente de sincronização ideal, 10 µM forskolin, 1 nM melatonina, dexametasona 0,1 µM, 50% HS e 100% SQ foram comparados em termos de amplitude circadiano e período nas células circadian vector transfectada. Células vazias vector transfectada são tratadas com 100% SQ como controlo negativo.
  3. Meio de pre-prepare 20 mL gravação (para 10 dos pratos 30mm cultura) pela adição de 5 mL de MEGM, 15 mL de MEBM, 150 µ l de bicarbonato de sódio, 200 µ l de HEPES e Luciferina de 40 µ l de solução (50 mM) em um tubo de centrífuga de 50 mL esterilizado ações.
    Nota: As concentrações finais de cada componentes: 20% SQ e toxina da cólera 20 ng/mL, 0,06% de bicarbonato de sódio, 1% penicilina/estreptomicina e 10 mM HEPES. Aquece pré-preparadas gravação médio e esterilizados 1X PBS por 30 min em banho-maria a 37 ° C. Adicionar 100 luciferina µM imediatamente antes do uso.
  4. Lavar as células com quente 1 x Dulbecco ' s Phosphate-Buffered salina (D-PBS) por 3 vezes após a incubação com o agente de sincronização e em seguida, adicione 2 mL de meio de gravação.
  5. Selar o prato com uma classe de tampa esterilizado usando graxa de silicone para evitar a evaporação e nomeie-o do lado.
  6. Colocar a cápsula selada no assento dentro do luminómetro e ative a opção para salvar o local do arquivo na pasta (para detalhes, consulte a seção 6).

4. Seleção de células estàvel Transfected

  1. otimizar uma concentração ideal de G418 (800 µ g/mL) com um ensaio de curva de matar de acordo com o fabricante ' instrução de s para a seleção das células transfectadas estàvel.
  2. Depois de transfecção transiente para 48 h ou 72 h, subcultura e semente as células com MEGM em pratos maiores de 5.000 células/prato (100 mm). Após 24 h cultura na incubadora de cultura celular (37 ° C, umidade de 95% e 5% CO 2), tratar as células com 800 µ g/mL de G418, substituindo o antigo médio com novo meio contendo 800 µ g/mL G418 cada 3-4 dias por 2 semanas.
  3. Subcultura o sobrevivente estàvel transfected colônias para 1-3 passagens com MEGM com 500µg/mL G418 para manter a expressão estável de hPer2P/Luc2P e congelamento em nitrogênio líquido para uso futuro.
  4. Tratar G418 de 500µg/mL após a subcultura geral para re-selecionar estàvel transfectada população de células, se a intensidade de bioluminescência no resultado do ensaio de bioluminescência em vitro torna-se progressivamente menor após o uso em muitas passagens.

5. Tratamento com produtos químicos

  1. em 48 h ou 72 h após transfeccao, morrer de fome as células de fatores de crescimento em MEBM por 24 h.
  2. Após a sincronização com 50% HS por 2 h, tratar as células com nitrosomethylurea 0,5 mM ou 0,25 mM (NMU), 20 nM EX527 ou cambinol de 1 µM por 1h em MEBM contendo 20% sq.
  3. Após a lavagem com 1 x D-PBS, adicionar gravação médio contendo 12,5 µM MSC sozinho ou em combinação com 20 nM EX527 ou cambinol de 1 µM, para as células. Acompanhamento a bioluminescência com o luminómetro.
  4. Tratar o estàvel transfectadas MCF10A / PER2-dLuc células com NMU em 0,5, 1 ou 2 mM, EX527 em 40 nM, ou Cambinol em 2,0 µM, por 1h após a sincronização com 50% HS e em seguida Incube as celulas em gravação médio contendo µM 12.5 da MSC ou (5, 10 ou 20 µM) de diferentes doses de n-acetilcisteína (NAC). Colocar as placas no luminómetro, registro e salvar a bioluminescência pelo luminómetro durante 4 a 8 dias, conforme descrito na seção 3.6.
    Nota: NMU é uma composto com propriedades mutagênicos, carcinogênicas e teratogênicos de Nitrosoureia metilada. NMU é um Agente alquilante acção directa e tem uma curta meia-vida (T 1/2 = ~ 30 min). É estável em condições ácidas (pH 4-5), mas instável em condições alcalinas (pH 9-10) e a temperaturas além de 20 ° C. Portanto, lixívia a 10% pode ser usada como um agente de desativação eficiente para limpeza de superfícies de bancada e utensílios de laboratório potencialmente contaminados por NMU comunicantesno. Solução-mãe de sobra é captado e eliminada com segurança por REHS. Dependendo do modo de ação dos produtos químicos, células sincronizadas podem ser tratadas por tempos mais curtos antes de cultivo em meio de gravação. As células também podem ser tratadas em meio de gravação por mais tempo (vários dias).

6. Coleta de dados, análise e apresentação

Nota: viabilidade celular precisa ser determinado usando métodos padrão (por exemplo, ensaio de MTT) após o tratamento de células nas mesmas concentrações para os mesmos tempos indicados. Todas as concentrações de tratamento utilizadas no ensaio em vitro bioluminescência foram inferiores a 30% de concentração letal (LC30). Todos os experimentos foram conduzidos em triplicado e foram apresentados resultados representativos.

  1. Após a selagem do prato (passo 3.5), carregar os pratos para os assentos no luminómetro, que é mantido dentro de uma incubadora a 37 ° C, sem H 2 O e CO 2 e conectado a um computador.
  2. Clique " salvar " e insira os nomes para a pasta e o arquivo onde será salvo o sinal gravado luminescência do prato correspondente.
    Nota: O sistema detecta o sinal de luminescência em tempo real das células no prato em posições individuais. Os sinais são transferidos para o computador através de 4 fóton-contagem de tubos fotomultiplicadores e salvos e exibidos no computador pelo software de coleta de dados.
  3. Analisar os sinais depois de gravar durante 4-7 dias, que pode ser seguido por mudança média e gravação contínua para uma segunda semana, se necessário.
    Nota: Para obter parâmetros circadianos, incluindo a fase, duração do período, amplitude de ritmo e amortecimento taxa, usamos o software de análise do luminómetro para analisar os dados de bioluminescência.
  4. Detrend dados brutos com uma média de execução e analisar a melhor se adapta a uma onda de seno de período, fase, amplitude e amortecimento taxa 21 , 22.
  5. Devido a alta transitória bioluminescência sobre tratamento e mudança média, exclui o primeiro ciclo de dados análise.
  6. Para apresentação de dados, plotar dados brutos (bioluminescência, contagem/s) contra o tempo (h ou dia). Quando necessário, subtraído de linha de base de dados podem ser plotados para comparar a amplitude e fase.

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Resultados

Vetor de repórter Circadian bioluminescência: PER2 humana orientada por promotor expressão variante desestabilizado luciferase

A sequência de DNA, que inclui um fragmento de bp 941 derivado o promotor PER2 humano, usado para construir o vetor de repórter circadiano, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, primeiro foi analisada a presença de elementos reguladores conhecidos para regular expressão de genes circadi...

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Discussão

Em células de mamíferos, periodicidade do relógio circadiano é regulada por loops de feedback transcriptional/translacional interconectadas. Heterodímeros de Bmal1 e o relógio ou o Npas2 regular circadian transcrição por ligação aos promotores do núcleo CGs, incluindo Per2 e chorare numerosos CCGs4elementos E-caixa. Como eles se acumulam na célula, heterodímeros de por: Cry post-translationally são modificados e transportados para o núcleo para reprimir a atividade transcricional...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela sociedade 2012 de toxicologia (SOT)-Colgate Palmolive Grant para pesquisa Alterative (M. Fang) e a pesquisa de colaboração internacional fundo de Animal e planta agência de quarentena, República da Coreia (M. Fang), e conceder as NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Gostaríamos de agradecer o Dr. Zheng Chen (McGovern escola médica da Universidade do Texas Health Science Center em Houston) para sua discussão útil, Sr. Juan de Shao-An por sua assistência experimental e a Sra. Kimi Nakata para a leitura de prova.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vetorSwitchGear GenomicsS700000vetor personalizado
pGL4.18 [Luc2P / Neo] vetorPromega9PIE673vetor de expressão de luciferase desestabilizado
T4 DNA ligaseInvitrogen15224041para subclonagem
TOPO TA kit de clonagemInvitrogenK4500-02com One Shot TOP10 E. coli quimicamente competente
Sac INew England BioLabsR0156SEnzima
de restrição Hind III-HFNew England BioLabsR3104SEnzima de restrição
CutSmart bufferNew England BioLabsB7204Stampão enzimático de restrição
Qiagen28704Purificar fragmentos de DNA de gel de agarose
Kit de purificação de PCRQiagen28104Limpeza de DNA LB
Modificação de MillerTEKNOVAL8600Para cultura de E. Coli transformada
LB Agar PlateTEKNOVAL1902Para seleção branca/azul
QIAprep spin miniprep KitQiagen27104Para extração de DNA de plasmídeo
EndoFree plasmídeo maxi prep KitQiagen12362Para extração de DNA de plasmídeo
FuGene HDPromegaE2311Reagente de transfecção
Opti-MEM reduzido meio séricoInvitrogen31985-062Para transfecção
Linha celular MCF10AColeção de cultura de tipo americanoCRL-10317Células epiteliais mamárias
MEGM BulletKitLonzaCC-3150Meio de crescimento epitelial mamário
MEBMLonzaCC-3151Kit SingleQuot MEGM Médio Epitelial Epitelial Mamário
LonzaCC-4136Suprimentos & Fatores de crescimento
ReagentPackLonzaCC-5034Reagente para subcultura
D-PBS (10X)SigmaD1408Lave células em placas de cultura
Água Destilada UltraPureInvitrogen10977Diluir 10X D-PBS Placa de cultura de
tecidos (35 mm)BD/Falcon353001placa de cultura de células adequada para LumiCycle
Graxa de silícioFisherNC9044707Para prato de vedação com meio de registro
Vidro de cobertura redondoHarvard Bioscience64-1500 (CS-40R)Para prato de vedação com meio de registro
Toxina da cóleraSigmaC8052Suplemento para meio de crescimento
Sulfato G418 (Geniticina)Invitrogen10131035Antibiótico para seleção de células transfectadas estáveis
AmpicilinaSigmaA9393Para seleção de colônias
ForskolinSigmaF6886Agente de sincronização
MelatoninaSigmaM5250Agente de sincronização
DexametasonaSigmaD4902Agente de sincronização
Soro de cavaloSigmaH1138Agente de sincronização
d-Luciferina, sal de sódioInvitrogenL2912Substrato de luciferase
IC261Sigma10658Controle positivo para disruptor circadiano
Metilnitrosoureia (NMU)SigmaN1517Carcinógeno específico mamário
Metilselenocisteína (MSC)SigmaM6680Selênio orgânico (agente quimiopreventivo)
EX527SigmaE7034Inibidor específico de SIRT1
CambinolSigmaC0494SIRT1 &
EspectrofotômetroThermo ScientificNanoDrop 8000Quantificar o sistema 9700 do PCR de GeneAmp do nucleotídeo
Biosystemsaplicados N805-0200para a série
8000 DHincubadoraNAPCOda experiência da biologia molecular para a cultura de pilha no CO2 de 5% em 37 ° C
Centrífuga de mesa com recondicionadorEppendorf5430RPara experiência de biologia molecular
Centrífuga com balde oscilanteEppendorf5810 RPara cultura de células
Microscópio invertidoNikon80124Contraste de fase opcional
Capuz de cultura de tecidosLabconcoClasse II A2BSL-2 certificado
LumiCycle 32Actimetricsnão disponívelDetector de luminoscência
Kit de extração de gel de DNA de do inibidor de SIRT2 da do CO2

Referências

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