Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

Ian Diner; Tram Nguyen; Nicholas T. Seyfried

doi:10.3791/55835

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Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

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DOI:

10.3791/55835

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24 de outubro de 2017

Ian Diner¹ , Tram Nguyen¹ , Nicholas T. Seyfried¹

¹Department of Biochemistry, Emory School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Um protocolo de fracionamento abreviado para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte é descrito.

Resumo

Neste estudo, descrevemos um protocolo abreviado fracionamento de etapa única para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte. O detergente iônico N-Lauril-sarcosina (sarkosyl) efetivamente solubiliza proteínas dobradas nativamente no tecido cerebral, permitindo o enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente de uma ampla gama de proteinopathies neurodegenerativas, tais como A doença de Alzheimer (AD), doença de Parkinson e esclerose lateral amiotrófica e doenças de príon. Controle humano e tecidos do cérebro após a morte de AD foram homogeneizadas e sedimentada por ultracentrifugação na presença de sarkosyl para enriquecer agregados de proteína insolúvel em detergente incluindo tau fosforilada patológica, o componente do núcleo do tangles emaranhados em AD. Mancha ocidental demonstrou a solubilidade diferencial de agregados-tau fosforilada e a proteína solúvel em detergente, Early Endosome antígeno 1 (EEA1) no controle e no cérebro do AD. Análise proteômica também revelou o enriquecimento de β-amiloide (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) e apolipoproteína E (APOE) nas fracções sarkosyl insolúveis do cérebro AD comparados de controle, consistente com estratégias de fracionamento de tecido anterior . Assim, o presente protocolo simples enriquecimento é ideal para uma ampla gama de aplicações experimentais variando de mancha ocidental e proteína funcional ensaios de agregação co a espectrometria de massa-baseado proteomics.

Introdução

Doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD), esclerose lateral amiotrófica (ela) e as doenças de príon estreitamente relacionadas são proteinopathies caracterizadas pelo acúmulo gradual de agregados de proteína insolúvel em detergente no cérebro com acompanhamento cognitivo declinam. ¹ ^, ² este recurso compartilhado patológico é pensado para jogar um papel central na etiologia e fisiopatologia dessas doenças neurodegenerativas. ² estes agregados, normalmente, compostos de fibras de amiloides poliméricas, que são compostas de repetir unidades de misfolded proteínas exibindo Cruz β-estrutura. ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ bioquimicamente, agregados amiloides são altamente resistentes à desnaturação química ou térmica e solubilização,³ que apresenta desafios únicos para a sua purificação, análise e estudo através de técnicas bioquímicas tradicionais. ² ^, ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ não é novidade, a fração de proteína insolúvel em detergente tem sido o foco de muita pesquisa em fisiopatologia das doenças neurodegenerativas que envolvem o acúmulo de misfolded proteínas. ⁶ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴

Técnicas de fracionamento bioquímico frequentemente têm sido utilizadas para enriquecer a fração insolúvel em detergente de homogenates cerebral post-mortem. ⁶ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ um dos métodos mais comuns envolve a extração sequencial de tecido homogenates com buffers e detergentes de aumentar o rigor, seguido por ultracentrifugação para particionar as frações solúveis e insolúveis. Um protocolo comumente usado fracionamento sequencial⁶^,¹⁴ envolve a homogeneização de amostras de tecido congelado em um buffer de detergente livre baixo sal (LS) e as pelotas insolúveis resultantes então são extraídas sequencialmente com amortecedores que contêm sal elevado, detergentes não-iônicos, alta sacarose, detergentes iônicos e finalmente chaotropes como ureia. ⁶ ^, ¹⁴ uma desvantagem óbvia de tais protocolos um fracionamento sequencial é o tempo substancial e compromisso de trabalho necessário para concluí-las. Incluindo a homogeneização e ultracentrifugação, um protocolo típico de cinco etapas de fracionamento pode levar várias horas ou mesmo dias para completar. ⁴ ^, ⁶ ^, ⁷ ^, ¹⁰ ^, ¹⁵ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ além disso, como muitos agregados de proteína patológica permanecem insolúveis em todos, mas as mais adversas condições¹⁹^,²⁰ a maioria das frações geradas são de valor limitado. Assim, as etapas de fracionamento menos rígidas utilizando altas concentrações de sal e detergentes não-iônicos são em grande parte redundantes.

Estudos anteriores mostraram que o detergente iônico N-Lauril-sarcosina (sarkosyl) é um excelente candidato para um protocolo simplificado fracionamento de detergente de etapa única. ⁵ ^, ⁶ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³ como um detergente de desnaturação, sarkosyl é suficientemente rigorosa para solubilizar a maioria vasta das proteínas nativamente dobradas no cérebro sem solubilizing agregados de misfolded proteínas compostos por beta-amiloide (Aβ),⁶^,¹¹tau fosforilada (pTau),⁶ TAR ADN-proteína obrigatória 43 (TDP-43),¹⁴ alfa-synuclein,¹²^,¹³ do tremor epizoótico,²³ ou U1 pequenas ribonucleoproteínas nucleares (snRNPs U1) como U1 - 70 K. ⁵ ^, ²¹ ^, ²² Como sarkosyl é menos rigoroso do sulfato dodecyl de sódio detergente aniônico onipresente (SDS), preserva menos robustas oligoméricas formas de agregados de misfolded proteínas que não podem suportar o tratamento de SDS. ⁹

Anteriormente, nós descrevemos um protocolo de detergente-fracionamento Abreviado que obtiveram resultados comparáveis aos métodos de fracionamento sequencial mais trabalhosos. ⁵ , omitindo as menos rigorosas etapas de fracionamento, fomos capazes de desenvolver um protocolo facile fracionamento de etapa única para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte. ⁵ este protocolo detalhado aqui descrito é bem adequado para uma ampla gama de aplicações experimentais que variam de mancha ocidental e ensaios de espectrometria de massa-baseado proteomics para enrolamento de proteína funcional e propagação de agregação. ⁵ ^, ⁶ ^, ²¹

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Protocolo

declaração de ética: todos os tecidos do cérebro foram obtidos a partir da Emory Alzheimer ' s doença Research Center (ADRC) banco de cérebro. Tecidos humanos após a morte foram adquiridos ao abrigo de protocolos apropriados institucional Review Board (IRB).

1. homogeneização e fracionamento

seleção de tecido
Nota: congelado o tecido do córtex frontal após a morte de controle saudável (Ctl) e patologicamente casos confirmados de AD foram seleccionados a partir do Emory Banco de cérebro ADRC (n = 2). Post-mortem neuropatológica avaliação da distribuição de placa amiloide foi realizada de acordo com o consórcio para estabelecer um registro para Alzheimer ' s doença semi-quantitativa marcando critérios ²⁴, embora patologia do tangles emaranhado foi avaliada em conformidade com o sistema de preparo de Braak. ¹⁶
1. obter congelado o tecido cerebral post-mortem de controle saudável (Ctl) e patologicamente confirmado casos de AD. Utilizando recipientes de gelo seco, fórceps e uma lâmina de barbear, impostos especiais de consumo ~ porções de 250 mg de matéria cinzenta de cada amostra de tecido na tarada descartável pesam barcos, tendo o cuidado de evitar que o tecido descongelar. Registrar o peso de cada peça para ser homogeneizado.
2. Impostos ~ 250 mg de matéria cinzenta, usando a pinça e navalha, inspecionando visualmente para localizar a interface entre a substância cinzenta externa e interna de substância branca. Evitar a substância branca e, mais importante, qualquer grandes vasos sanguíneos ou regiões sangrentas, meninges ou aracnoide. Mantenha o tecido congelado durante o processo de corte a trabalhar rapidamente e frequentemente colocando o barco pesagem com tecido cerebral em recipientes de isopor com gelo seco
3. Gravar o peso exato da matéria cinzenta extirpado da cada pedaço congelado usando uma balança analítica. Calcular o volume de tampão baixo sal (LS) (ver tabela 1) necessário para homogeneização de homogenizacao (5 mL/g ou 20% w/v).
4. Preparar 10 mL LS de tampão com 1x do inibidor de protease e fosfatase cocktail e calma na Ice.
5. Remover tecido pesado e pesagem do barco de gelo seco e corte em pedaços de 2 x 2 mm aproximadamente, enquanto ele derrete. Transferência para um tubo de homogeneizador de pre-refrigerados homogenizacao 2ml no gelo
6. Adicionar 5 mL/g (20% w/v) do buffer de sal baixo gelada (LS) com 1 X coquetel de inibidor de protease e fosfatase.
7. Homogenize no tecido cerebral no gelo usando aproximadamente 10 traços de alta apuramento pilão A e 15 golpes de pilão de depuração baixa B.
8. Transferir tudo homogeneizado para um tubo de polipropileno 2 mL, usando um pipeta Pasteur de vidro. Rótulo do tubo com “ TH ” (Homogenate Total), o tecido caso número e homogeneizado volume. alíquota 0,8 mL num tubo rotulado 1,5 mL. Qualquer excesso homogenate pode ser similarmente aliquotadas e armazenado a -80 ° C.
9. a cada 0,8 mL alíquota, adicionar 100 µ l cada de 5 M NaCl e sarkosyl de 10% (p/v) para as concentrações de 0,5 M e 1% p/v, respectivamente. Misturar os tubos bem pela inversão e incubar no gelo por 15 min. de tubos de rótulo com " TH-S " (Total homogeneizado-Sarkosyl) para indicar que o homogenates estão no buffer de sarkosyl (tabela 1).
10. Proceda à sonicação cada tubo para pulsos de três 5 s em 30% amplitude no gelo (intensidade máxima = 40%) usando uma sonda de microtip.
11. determinar as concentrações de proteína do homogenates usando o ácido bicinchoninic (BCA) ensaio ²⁵ método.
  Nota: A concentração de proteína média de TH-S homogenates preparado em 5 mL LS por grama de tecido é de 15-20 mg/mL. O homogenates pode ser fracionada imediatamente ou armazenado a-80 ° C até o uso.
12. Homogenates TH-S diluir a 10 mg/mL, usando gelada sark buffer (tabela 1) com 1 x inibidores de protease e fosfatase.
13. Transferir 5 mg proteína (0,5 mL) de cada homogenate TH-S em 500 tubos de se µ l em policarbonato e par-equilíbrio com buffer de sark. Carregar os tubos em um rotor pre-refrigerado e se a 180.000 x g durante 30 min a 4 ° C. transferência do sarkosyl-solúvel fracções sobrenadantes (S1) para tubos de 1,5 mL e armazene a -80 ° C.
  Nota: (Lavagem opcional) adicionar 200 µ l de sark-buffer para o se tubos contendo as frações insolúveis em detergente (P1) e desalojar as pelotas (P1) da parte inferior dos tubos se utilize uma ponta de pipeta de 200 µ l.
14. brevemente de pulso-gire o invertido para 2-3 s (≤ 2.500 x g) em um microcentrifuge para transferir o buffer e pelotas (P1) para os tubos de 1,5 mL abaixo. Resuspenda as pelotas insolúveis (P1) no buffer de sark pipetando para cima e para baixo para garantir a pelota é interrompida.
15. Par-equilíbrio e centrifugar 180.000 x g por um adicional 30 min a 4 ° C.
16. Desprezar o sobrenadante de lavagem opcional (S2) e incube as pelotas de sarkosyl insolúveis (P2) em 50-75 µ l de tampão de ureia (tabela 1) com 1 x PIC (protease e fosfatase inibidor cocktail) por 30 min à temperatura ambiente para solubilizar o pelota.
  Nota: Buffer de ureia quente a temperatura ambiente antes do uso para evitar a precipitação de SDS. Para aplicações sensíveis ao detergente, omitir SDS de buffer de ureia e considerar lavar o sedimento insolúvel (P2) no baixo sal buffer antes de resuspending no buffer de ureia.
17. Transferir as ressuspensa Pelotas (P2) para tubos de 0,5 mL e usar breve (1 s) microtip sonication em amplitude de 20% (intensidade máxima = 40%) para solubilizar totalmente as pelotas.
18. Determinar as concentrações de proteína de sarkosyl-solúvel (S1) e insolúveis (P2) frações usando o BCA método de ensaio. Use estas frações imediatamente ou armazenar a-80 ° C até o uso.

2. Immunoblotting

mancha ocidental
Nota: mancha ocidental foi realizada de acordo com os procedimentos anteriormente relatados com ligeiras alterações. ⁵ ^, ¹⁰
1. preparar 40 µ g amostras de homogenates total (TH-S), sark-solúvel (S1) e frações de sark insolúveis (P2) em 1 amortecedor da amostra X Laemmli SDS-page com pH TCEP 5 mM 7. Incubar as amostras a 95 ° C por 5 min.
2. carga em SDS-PAGE um pré-moldado bem 10 4-12% Bis-Tris gel. Electrophorese em 80 V para o primeiro centímetro (10 min) e 120 V para o restante (60 min), ou até que a tintura de seguimento atinge a parte inferior do gel.
3. Use uma lâmina de barbear fresca e gel de faca para dividir-abrir a gaveta do gel de pre-cast. Delicadamente cortar fora os pentes e inferior do gel com uma lâmina de barbear fresco.
4. Resuspenda as pelotas insolúveis (P1) em 200 µ l sark-buffer com 1x PIC pipetando cima e para baixo.
5. Transferência para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 µm usando um método de transferência de seco em uma máquina de mancha (consulte a tabela de materiais).
6. Bloquear a membrana em tampão de bloqueio (BB) sem Tween 20 por 30 min, seguida com BB com 0,05% Tween 20 (BB/T) por 30 min. Após o bloqueio, lavar a membrana em TBS/T (0.1% Tween 20) por 5 min remover o tampão de bloqueio excesso.
7. Preparar diluições de 1:1,000 de pT231 os anticorpos primários, Tau-2 (pan tau), AT8 e EEA1 no BB/T (0,05% Tween 20).
8. Incubar as membranas em solução de anticorpo primário durante a noite a 4 ° C, com agitação circular. Lavar a membrana em TBS/T 3 x 15 min.
9. Sonda a membrana com uma diluição de 1: 20.000 de fluorescente-etiquetadas infravermelho próximo anticorpo secundário no BB/T para 60 min à temperatura ambiente na escuridão agitador. Lavar a membrana para 3 x 10 min na TBS/T e 2 x 5 min em TBS
10. Scan a membrana usando um sistema no comprimento de onda de excitação apropriada (por exemplo, 700 nm (canal vermelho) para tintura infravermelho 680 cabra anti-rato IgG (H + L) secundário e 800 nm (canal verde) para tintura infravermelho 790 burro anti-rabbit IgG (H + L de imagens de infravermelho secundária)).
11. Usar o software de imagem para quantificar a intensidade do sinal e executar medidas de densitometria conforme o fabricante ' instruções de s, garantir autoconfiguração de fundo é definido como média o fundo todo.

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Resultados

O protocolo de sarkosyl de etapa única abreviado-fracionamento foi usado para enriquecer agregados de proteína insolúvel em detergente de controle e o cérebro após a morte de AD (Figura 1). Proteínas de frações TH-S, S1, S2 e P2 foram resolvidas por SDS-PAGE, fixado por 15 min em Coomassie azul reserva fixador seguida de coloração suave com buffer de coloração azul brilhante de Coomassie G-250. A etapa de ressuspensão é opcional, desde que não havia níveis in...

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Discussão

Neste documento vamos apresentar e discutir um protocolo de detergente-fracionamento de etapa única Abreviado que é aplicável a uma ampla variedade de aplicações experimentais que variam de análise proteômica de espectrometria de massa-baseado a proteína funcional ensaios de enrolamento e mancha ocidental. ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷ ^, ¹⁰ esta metodologia é talvez mais eficaz quando usado para estudar proteinopa...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecer os Drs Jim Lah e Allan Levey, Emory departamento de Neurologia, sugestões e comentários úteis. Este trabalho foi parcialmente financiado pela parceria de medicina acelerando subvenção (U01AG046161-02), o Emory Alzheimer centro de pesquisa da doença (P50AG025688) e um Instituto Nacional sobre envelhecimento concedem (R01AG053960-01) para N.T.S. Esta pesquisa também foi apoiada em parte pelo núcleo neuropatologia da subvenção Emory neurociência NINDS núcleo instalações, P30NS055077.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coquetel de inibidores de protease e fosfatase, sem EDTA (100X)	Coquetel de inibidores de protease e fosfatase	Thermo Fisher	78441
Sistema de desmembranador sônico (ultrassom)	de microponta de FB505110		Fisher
Scientific Ultracentrífuga Optimax TLX Ultracentrífuga	Beckman Coulter	361545	ultracentrífuga refrigerada
TLA120.1 rotor	de	ultracentrífuga	Beckman Coulter
362224 500 ul (8 x 34 mm) tubos de policarbonato, parede espessa	Beckman Coulter	343776	para rotor TLA120.1
Tampão de amostra 4X SDS	Solução caseira	N/A	SDS-PAGE
TCEP, pH neutro	Thermo Fisher	77720	tampão de bloqueio do agente redutor
(TBS)	Thermo Fisher	37542	tampão de bloqueio
(TBS) tampão de bloqueio + 0,05% Tween 20	Thermo Fisher	37543	tampão de bloqueio e diluente de anticorpos
4-12% Bolt Bis-Tris Plus géis, 10 poços	Thermo Fisher	NW04120BOX	géis SDS-PAGE pré-moldados
MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fisher	B0002	SDS-PAGE running buffer
N-Lauroilsarcosina sal de sódio (sarkosyl)	Sigma Detergente Aldrich	L5777-50G
Anticorpo anti-Tau-2 (pan tau)	Anticorpos Chemicon	MAB375
Anticorpo anti-fosfo-treonina 231 Tau	Anticorpos Millipore	MAB5450
Anti-fosfo-seroína 202 e treonina 205 Anticorpo Tau (AT8)	Anticorpos Thermo Fisher	MN1020
Anticorpo anti-antígeno 1 do endossomo precoce (EEA1)	abcam	ab2900	anticorpos
Alexa Fluor 680 anticorpo secundário IgG (H+L) de cabra anti-camundongo	Thermo Fisher	A21058	anticorpos
Alexa Fluor 790 anticorpo secundário IgG (H+L) de burro	Thermo Fisher	A11374	anticorpos
iBlot2 Dry Blotting System	Thermo Fisher	IB21001	Transferência de gel
iBlot2 Pilhas de transferência, nitrocelulose, mini	Transferência	de	gel

Ultrassônico Rotor Tubos de ultracentrífuga IB23002 Thermo Fisher

Referências

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