Um protocolo de fracionamento abreviado para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte é descrito.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neste estudo, descrevemos um protocolo abreviado fracionamento de etapa única para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte. O detergente iônico N-Lauril-sarcosina (sarkosyl) efetivamente solubiliza proteínas dobradas nativamente no tecido cerebral, permitindo o enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente de uma ampla gama de proteinopathies neurodegenerativas, tais como A doença de Alzheimer (AD), doença de Parkinson e esclerose lateral amiotrófica e doenças de príon. Controle humano e tecidos do cérebro após a morte de AD foram homogeneizadas e sedimentada por ultracentrifugação na presença de sarkosyl para enriquecer agregados de proteína insolúvel em detergente incluindo tau fosforilada patológica, o componente do núcleo do tangles emaranhados em AD. Mancha ocidental demonstrou a solubilidade diferencial de agregados-tau fosforilada e a proteína solúvel em detergente, Early Endosome antígeno 1 (EEA1) no controle e no cérebro do AD. Análise proteômica também revelou o enriquecimento de β-amiloide (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) e apolipoproteína E (APOE) nas fracções sarkosyl insolúveis do cérebro AD comparados de controle, consistente com estratégias de fracionamento de tecido anterior . Assim, o presente protocolo simples enriquecimento é ideal para uma ampla gama de aplicações experimentais variando de mancha ocidental e proteína funcional ensaios de agregação co a espectrometria de massa-baseado proteomics.
Introdução
Doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD), esclerose lateral amiotrófica (ela) e as doenças de príon estreitamente relacionadas são proteinopathies caracterizadas pelo acúmulo gradual de agregados de proteína insolúvel em detergente no cérebro com acompanhamento cognitivo declinam. 1 , 2 este recurso compartilhado patológico é pensado para jogar um papel central na etiologia e fisiopatologia dessas doenças neurodegenerativas. 2 estes agregados, normalmente, compostos de fibras de amiloides poliméricas, que são co....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
declaração de ética: todos os tecidos do cérebro foram obtidos a partir da Emory Alzheimer ' s doença Research Center (ADRC) banco de cérebro. Tecidos humanos após a morte foram adquiridos ao abrigo de protocolos apropriados institucional Review Board (IRB).
1. homogeneização e fracionamento
- seleção de tecido
Nota: congelado o tecido do córtex frontal após a morte de controle saudável (Ctl) e patologicamente casos confirmados de AD foram seleccionados a partir do Emory Banco de cérebro ADRC (n = 2). Post-mortem neuropatológica avaliação da distribuição de placa amiloide foi realizada de acordo....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O protocolo de sarkosyl de etapa única abreviado-fracionamento foi usado para enriquecer agregados de proteína insolúvel em detergente de controle e o cérebro após a morte de AD (Figura 1). Proteínas de frações TH-S, S1, S2 e P2 foram resolvidas por SDS-PAGE, fixado por 15 min em Coomassie azul reserva fixador seguida de coloração suave com buffer de coloração azul brilhante de Coomassie G-250. A etapa de ressuspensão é opcional, desde que não havia níveis in.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Neste documento vamos apresentar e discutir um protocolo de detergente-fracionamento de etapa única Abreviado que é aplicável a uma ampla variedade de aplicações experimentais que variam de análise proteômica de espectrometria de massa-baseado a proteína funcional ensaios de enrolamento e mancha ocidental. 5 , 6 , 7 , 10 esta metodologia é talvez mais eficaz quando usado para estudar proteinopa.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecer os Drs Jim Lah e Allan Levey, Emory departamento de Neurologia, sugestões e comentários úteis. Este trabalho foi parcialmente financiado pela parceria de medicina acelerando subvenção (U01AG046161-02), o Emory Alzheimer centro de pesquisa da doença (P50AG025688) e um Instituto Nacional sobre envelhecimento concedem (R01AG053960-01) para N.T.S. Esta pesquisa também foi apoiada em parte pelo núcleo neuropatologia da subvenção Emory neurociência NINDS núcleo instalações, P30NS055077.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Coquetel de inibidores de protease e fosfatase, sem EDTA (100X) | Coquetel de inibidores de protease e fosfatase | Thermo Fisher | 78441 |
| Sistema de desmembranador sônico (ultrassom) | de microponta de FB505110 | Fisher | |
| Scientific Ultracentrífuga Optimax TLX Ultracentrífuga | Beckman Coulter | 361545 | ultracentrífuga refrigerada |
| TLA120.1 rotor | de | ultracentrífuga | Beckman Coulter |
| 362224 500 ul (8 x 34 mm) tubos de policarbonato, parede espessa | Beckman Coulter | 343776 | para rotor TLA120.1 |
| Tampão de amostra 4X SDS | Solução caseira | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP, pH neutro | Thermo Fisher | 77720 | tampão de bloqueio do agente redutor |
| (TBS) | Thermo Fisher | 37542 | tampão de bloqueio |
| (TBS) tampão de bloqueio + 0,05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | tampão de bloqueio e diluente de anticorpos |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus géis, 10 poços | Thermo Fisher | NW04120BOX | géis SDS-PAGE pré-moldados |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroilsarcosina sal de sódio (sarkosyl) | Sigma Detergente Aldrich | L5777-50G | |
| Anticorpo anti-Tau-2 (pan tau) | Anticorpos Chemicon | MAB375 | |
| Anticorpo anti-fosfo-treonina 231 Tau | Anticorpos Millipore | MAB5450 | |
| Anti-fosfo-seroína 202 e treonina 205 Anticorpo Tau (AT8) | Anticorpos Thermo Fisher | MN1020 | |
| Anticorpo anti-antígeno 1 do endossomo precoce (EEA1) | abcam | ab2900 | anticorpos |
| Alexa Fluor 680 anticorpo secundário IgG (H+L) de cabra anti-camundongo | Thermo Fisher | A21058 | anticorpos |
| Alexa Fluor 790 anticorpo secundário IgG (H+L) de burro | Thermo Fisher | A11374 | anticorpos |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Transferência de gel |
| iBlot2 Pilhas de transferência, nitrocelulose, mini | Transferência | de | gel |
Referências
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991(1991).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
