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Neurocomportamentais avaliações em um modelo do rato de lesão cerebral hipóxica-isquêmica Neonatal

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DOI:

10.3791/55838

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24 de novembro de 2017

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1Department and Research Institute of Rehabilitation Medicine, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University, 3Department of Rehabilitation Medicine, Yonsei University Wonju College of Medicine, 4Rehabilitation Institute of Neuromuscular Disease, Yonsei University College of Medicine, 5Graduate Program of NanoScience and Technology, Yonsei University

Neste artigo

Resumo

Realizamos a oclusão da artéria carótida unilateral no pós-Natal dia 7-10 CD-1 mouse filhotes para criar um modelo de (HI) hipóxico-isquêmica neonatal e investigaram os efeitos da lesão cerebral de HI. Nós estudamos funções Neurocomportamentais nestes ratos em comparação com camundongos normais não operado.

Resumo

Realizamos a oclusão da artéria carótida unilateral em ratos CD-1 para criar um modelo de (HI) hipóxico-isquêmica neonatal e investigou os efeitos de uma lesão cerebral neonatal HI estudando funções Neurocomportamentais nestes ratos em comparação com não-operados (i.e., ratos normais). Durante o estudo, método do arroz-Vannucci foi usado para induzir dano de cérebro HI neonatal em ratos de 7-10 (P7-10) dia pós-natal. A operação de HI foi executada sobre os filhotes por ligadura da artéria carótida unilateral e exposição à hipoxia (8% O2 e 92% N2 para 90 min). Uma semana após a operação, os cérebros danificados foram avaliados com o olho nu através do crânio semi-transparente e foram divididos em subgrupos baseados na ausência (grupo "nenhuma lesão cortical") ou presença (grupo de "lesão cortical") da lesão cortical, como uma lesão no hemisfério direito. Na semana 6, os seguintes testes Neurocomportamentais foram realizados para avaliar as funções cognitivas e motoras: escada de (PAT), vacância passiva tarefa andando de teste e teste de força de aperto. Estes testes comportamentais são úteis para determinar os efeitos de uma lesão cerebral neonatal HI e são utilizados em outros modelos de rato de doenças neurodegenerativas. Neste estudo, os ratos da lesão cerebral de HI neonatais mostraram déficit motor que correspondessem aos danos do hemisfério direito. Os resultados do teste comportamental são relevantes para os déficits observados em pacientes humanos de HI neonatais, tais como paralisia cerebral ou pacientes com AVC neonatal. Neste estudo, um modelo do rato de uma lesão cerebral neonatal HI foi estabelecido e mostraram diferentes graus de déficits motor e comprometimento cognitivo comparado com ratos não operado. Este trabalho fornece informações básicas sobre o modelo do rato do HI. Imagens de MRI demonstram os fenótipos diferentes, separados de acordo com a gravidade da lesão cerebral por testes de motor e cognitivos.

Introdução

Uma lesão cerebral neonatal HI ocorre durante a primeira infância (aproximadamente dois pacientes por cada 1.000 crianças)1,2,3,4,5. Estudos sobre uma lesão cerebral neonatal HI são importantes, e usar um neonatal HI cérebro lesão do mouse modelo estabelecido pode facilitar na vivo pesquisas pré-clínicas na lesão cerebral de HI.

Os modelos tradicionais de HI são usados em ratos adultos6. Para o modelo em recém-nascidos, o método de arroz-Vannucci é comumente usado em P7 ratos7,8. No entanto, como ratos e camundongos são ligeiramente diferentes9,10, mesmo que eles são ambos os roedores, realizamos um método modificado de arroz-Vannucci na CD-1 filhotes no P7-10, com base em estudos anteriores que mostraram que o P7-10 é o período com oligodendrócitos imaturos, correspondente ao termo humano P011,12. O modelo de rato HI neonatal é estabelecido através de ambos a ligadura da artéria carótida unilateral e a exposição dos ratos a hipóxia com 8% de oxigênio em P7-10 filhotes.

Os ratos submetido ao procedimento mostrou vários graus de lesões cerebrais na área póstero-lateral do hemisfério direito. Para identificar os déficits cognitivos e motor, Neurocomportamentais avaliações com base no PAT, realizaram-se escada curta teste e teste de força de aperto. Analisaram-se as diferenças entre não-operados (isto é, normal) e ratos HI. Este trabalho apresenta informações básicas sobre o modelo do rato do HI. As imagens de MRI demonstram os fenótipos diferentes, separados de acordo com a gravidade dos danos de cérebro usando testes de motor e cognitivos.

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Protocolo

Todos os animais foram alojados em uma gaiola padrão (27 × 22,5 × 14 cm3) em uma instituição credenciada pela Associação de avaliação e acreditação do laboratório Animal conta (AAALAC) e dado comida e água ad libitum sob alternando-12h claro/escuro ciclos. Os autores seguiram de regulamentos de proteção animal, e os procedimentos experimentais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê de Yonsei University College of Medicine (IACUC n º 2010-0252; 2013-0220).

1. Mouse modelo de uma lesão cerebral Neonatal HI

  1. Anestesia os filhotes com isoflurano.
    1. Coloque os filhotes (inferior a 5) em uma caixa de anestésica e feche a tampa.
    2. Ligue o sistema anestésico por aproximadamente 15 min; ajuste o gás e isoflurano usando uma máquina de anestesia superior da tabela. Ajuste o medidor de fluxo de oxigênio para 1,5 L/min. Ajuste o vaporizador de isoflurano para 3-5% para a indução da anestesia.
    3. Depois de 15 min, ajuste o vaporizador de isoflurano a 1-2% para a manutenção da anestesia.
  2. Coloque um filhote totalmente anestesiado sob um microscópio de dissecação (abdome virado para o pesquisador) e prenda com fita.
  3. Faça uma incisão de ~0.7-mm no pescoço com uma tesoura esterilizada.
  4. Cuidadosamente remova o tecido adiposo usando Pinças esterilizadas e expor a artéria carótida direita unilateral.
  5. Ligar a artéria carótida direita unilateral com uma sutura absorvível de 5-0.
  6. Sutura da incisão no pescoço com sutura de 5-0.
  7. Coloque cada filhote em uma câmara de hipoxia quente 37 ° C por 1h para recuperação. Não feche a tampa da câmara.
  8. 1 h após a cirurgia, quando os filhotes são totalmente acordados, feche a tampa de câmara de hipóxia e diminuir os níveis de gás para estabelecer condições de hipóxicos (8% O2 e 92% N2).
  9. Após 90 min de hipóxia, retorne os filhotes de suas gaiolas.
  10. Uma semana após a lesão cerebral HI, repita a etapa 1.
    1. Após a anestesia, fazer uma incisão no couro cabeludo com tesoura esterilizada e pinça para identificar a lesão cerebral na área póstero-lateral do hemisfério direito.
      Nota: Este tratamento induz hipóxia em filhotes. A presença e a extensão da lesão cerebral em ratos todos é avaliada visualmente a olho nu através do crânio semi-transparente. Conforme determinado pelo tamanho ou volume da descoloração (ou seja, a lesão cerebral), os filhotes são classificados em grupos. Se não há nenhuma lesão visível cortical, o mouse é classificado no grupo "sem lesão cortical". Se houver uma lesão cortical visível (ou seja, uma lesão no hemisfério direito), o mouse é classificado no grupo "lesão cortical". Desde a classificação dos ratos em grupos é feita uma semana após a operação, os agrupamentos podem ser modificados quando as morfologias das amostras de cérebro estão claramente definidas no momento do sacrifício1,2,3, 4.

figure-protocol-1
Figura 1: Modelagem neonatal lesão cerebral de HI em camundongos.
(A) um filhote de rato de sete dias de idade foi submetido a cirurgia, e a artéria carótida direita unilateral foi ligada. (B) filhotes foram colocados numa câmara hipóxica para 90 min com 8% de O2 e 92% N2. (C, D e E) O cérebro com lesão de HI neonatal mostrou vários severidade de danos e foram categorizado com base no grau de dano. Na semana 14, obtiveram-se os miolos, e as lesões foram visualizadas. (C) a imagem de um cérebro, classificado como uma "nenhuma lesão cortical". Os dois (D) e (E) foram classificados no grupo "lesão cortical". (F, G e H) MRI representativa de (C), (D) e os ratos (E), respectivamente. (F) os danos no hipocampo é indicado com uma seta amarela, e lesões no hemisfério direito são também indicadas com setas amarelas (G e H). Barras de escala = 1 mm clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. neonatais testes comportamentais

Nota: Aqui, os testes comportamentais foram realizados em 6 semanas de idade.

  1. Tarefa de vacância passiva.
    Nota: Para avaliar a função de memória com base na aprendizagem e a evitação de um estímulo contrário, uma compartimento de dois passo-a PAT deve ser conduzido13,14,15,16.
    1. Coloque um rato no compartimento da brilhante da caixa de transporte de Plexiglas (41,5 × 21 × 35 cm3) de um aparelho de PAT.
    2. Após 30 s, abra a porta de guilhotina e registrar o tempo de latência para o mouse para mover para o compartimento escuro (até 300 s).
    3. Feche a porta de guilhotina quando todos os quatro membros do mouse são totalmente no interior do compartimento escuro.
    4. Administrar o choque elétrico de pé (0,5 mA) para 2 s e retorno o mouse para sua gaiola.
    5. Substitua o mouse no compartimento do brilhante 24 h após o choque elétrico de pé.
    6. Abra a guilhotina porta 10 s depois que o mouse é totalmente colocado no compartimento de brilhantes e registrar o tempo de latência para o mouse para mover para o compartimento escuro (até 300 s).
  2. Teste de caminhada de escada.
    Nota: A tarefa de ambulante de degrau de escada permite a discriminação entre sutis distúrbios da função motora combinando qualitativas e análises quantitativas de qualificados ambulante de17,18.
    1. Ligue uma câmara de vídeo.
    2. Coloque o mouse no painel do início da escada e começar imediatamente a gravação.
    3. Grave o vídeo, enfocando os membros do mouse.
    4. Pare a gravação quando o mouse toca o último painel da escada. Repeti a viagem de volta-e-vem quatro vezes.
    5. Analisar a gravação de vídeo e manualmente, contar o número de deslizamentos de cada membro anterior, como segue:
      1. Jogar a gravação do vídeo em um computador a uma velocidade lenta (0,1 x) e contar os passos manualmente.
  3. Ensaio de resistência de aderência.
    Nota: O ensaio de resistência de aderência é executado usando um medidor de força de aperto, que inclui um calibre de tensão-empurra.
    1. Conserte o aparelho de força de aperto em um painel de acrílico.
    2. Coloque um rato no painel de acrílico e segure sua cauda.
      1. Mova a mão segurando a cauda para que o rato pode chegar e pega o fio de metal do aparelho.
    3. Permitir vários ensaios até o mouse agarra um pedaço triangular de fio de metal (2 mm de diâmetro); a força máxima é automaticamente registrada em gramas pelo aparato.
      Nota: Utilize a força média de três ensaios para análise19,20,21.

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Resultados

Todos os dados são expressos como média ± erro padrão da média (SEM). A comparação das variáveis entre os dois grupos foi realizada utilizando um independente ou a pares, t-teste em software de estatística SPSS. Um p-valor < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

O cérebro com lesão de HI neonatal mostrou diferente gravidade dos danos e foram Categorizado em conformidade (Figu...

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Discussão

Neste estudo, nós induzido por lesão cerebral de HI em um rato P7-10 CD-1 neonatal e identificado a lesão cerebral com relevantes déficits cognitivos e motor. Durante este procedimento, oclusão da artéria carótida direita unilateral foi crítico. Nesta etapa, a artéria pode ser danificada e rasgada. A maioria dos filhotes que experimentaram uma lágrima de artéria morreram. Por outro lado, se pesquisadores ligados a outra veia de sangue em vez da artéria carótida direita unilateral, o cérebro do filhote foi apenas levement...

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Divulgações

Os autores têm sem interesses concorrentes.

Agradecimentos

Este estudo foi suportado por doações da Fundação Nacional de pesquisa (NRF-2014R1A2A1A11052042; 2015M3A9B4067068), do Ministério da ciência e tecnologia, República da Coreia, o coreano saúde tecnologia R & D Project (HI16C1012), Ministério da saúde & Bem-estar, República da Coreia e o programa de assistência de pesquisa da faculdade "Dongwha" do Yonsei University College de medicina (6-2016-0126).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Câmara hipóxicaJeung Do Bio & Aparelho PAT Plant CoExperimental Builder
Jeung Do Bio & Plant CoExperimental Builder
O degrau da escada andandoJeung Do Bio & Plant CoExperimental Builder
SDI Sistema de Força de Preensão SanDiego Instruments Inc.
Medidor de Força de AgarreUgo Basile47200
Aparelho Harvard Sistema de anestesia Fluovac Aparelho
Caixa de anestésicocaixa
de acrílico I-Fran Liquid (Isofluorano)Hana Pharm. Co., Ltd.Anestésicos Gerais (isoflurano 100ml) Camundongos
CD-1Orient Co., Ltd.
Sutura de nylon azul mono não absorvível 5-0 50cmAilee Co., Ltd.NB 521
Estatísticas do IBM SPSSIBMVer. 23
de Harvard

Referências

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