Aqui, apresentamos um protocolo para a gravação da teta de rede neuronal rítmica e das oscilações gama de uma preparação isolada do hipocampo inteiro. Descrevemos os passos experimentais da extração do hipocampo para detalhes de gravações de grampos de campo, unidade e toda célula, bem como a estimulação optogenética do ritmo de theta.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo descreve os procedimentos para a preparação e gravação do hipocampo inteiro isolado, de WT e camundongos transgênicos, além de melhorias recentes em metodologias e aplicações para o estudo das oscilações theta. Uma caracterização simples da preparação isolada do hipocampo é apresentada pelo qual a relação entre os osciladores internamente da teta do hipocampo é examinada em conjunto com a atividade das células piramidais e interneurônios GABAérgicos, nas áreas cornu ammonis-1 (CA1) e subículo (SUB). No geral, mostramos que o hipocampo isolado é capaz de gerar oscilações theta intrínsecas in vitro e que a ritmicidade gerada no hipocampo pode ser manipulada com precisão pela estimulação optogenética de interneurônios com parvalbumina positiva (PV). A preparação de hipocampo isolado in vitro oferece uma oportunidade única de usar gravações simultâneas de grampos e grampos intracelulares de neu visualmente identificadoRons para entender melhor os mecanismos subjacentes à geração de ritmo theta.
Introdução
As oscilações do hipocampo (4 - 12 Hz) estão entre as formas mais predominantes de atividade rítmica no cérebro de mamíferos e acreditam desempenhar papéis fundamentais nas funções cognitivas, como o processamento da informação espaciotemporal e a formação de memórias episódicas 1 , 2 , 3 . Enquanto vários estudos in vivo que realçam a relação das células do quadrado modificadas com estudos espaciais de navegação e lesão, além de evidências clínicas, sustentam a visão de que as oscilações do theta do hipocampo estão envolvidas na formação da memória 4 , 5 , 6 , os mecanismos associados Com a geração das oscilações do theta do hipocampo ainda não são totalmente compreendidas. As primeiras investigações in vivo sugeriram que a atividade theta dependia principalmente de osciladores extrínsecos, em particular a entrada rítmicaA partir de estruturas cerebrais aferentes, como o septo e o córtex entorrinal 7 , 8 , 9 , 10 . Um papel para fatores intrínsecos - conectividade interna das redes neurais do hipocampo juntamente com as propriedades dos neurônios do hipocampo - também foi postulado com base em observações in vitro 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . No entanto, além de alguns estudos históricos 19 , 20 , 21 , dificuldades no desenvolvimento de abordagens que poderiam replicar atividades de população fisiologicamente realistas em simples preparações de fatia in vitroS têm, durante muito tempo, um exame experimental mais detalhado das habilidades intrínsecas do hipocampo e áreas relacionadas para auto-gerar oscilações theta.
Uma desvantagem importante da configuração experimental padrão de fatias finas in vitro é que a organização celular e sináptica 3D das estruturas cerebrais geralmente está comprometida. Isso significa que muitas formas de atividades de rede concertada baseadas em conjuntos de células espacialmente distribuídos, que vão desde grupos localizados (≤ 1 mm de raio) até populações de neurônios espalhados por uma ou mais áreas cerebrais (> 1 mm), não podem ser suportadas. Diante dessas considerações, era necessário um tipo diferente de abordagem para estudar como as oscilações theta emergem no hipocampo e se propagam para estruturas de saída corticais e subcorticais relacionadas.
Nos últimos anos, o desenvolvimento inicial da preparação "septo-hipocampo completo" para examinar a interação bidirecionalAs citações das duas estruturas 22 e a evolução subseqüente da preparação do "hipocampo isolado" revelaram que as oscilações teta intrínsecas ocorrem espontaneamente no hipocampo que não possui entrada rítmica externa 23 . O valor dessas abordagens reside na visão inicial de que toda a estrutura funcional dessas regiões teve que ser preservada para funcionar como um gerador de ritmo theta in vitro 22 .
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Protocolo
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos e diretrizes aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade McGill e pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais.
1. Preparação intacta de hipocampo agudo
NOTA: O isolamento da preparação intacta do hipocampo envolve três etapas principais: (1) Preparação de soluções e equipamentos, (2) Dissecção do hipocampo e (3) Configuração do sistema de taxa de perfusão rápida necessário para geração de oscilações intrínsecas da teta. Neste protocolo, o desempenho atempado dos procedimentos - desde a dissecação até a gravação - é particularmente importante porque o hipocampo isolado constitui uma preparação tão densa, mas delicada, que a manutenção da conectividade funcional da estrutura in vitro requer um grande cuidado. Preparar tudo antes garante que um nível adequado de perfusão esteja disponível o mais cedo possível para minimizar a célula dMelhore e mantenha a função fisiológica.
- Solução de fluidos cerebrais cerebrais artificiais baseados em sacarose (aCSF)
- Prepare a solução de sacarose de estoque 1X a ser utilizada para a dissecção e incubação pós-dissecção. Combine todos os componentes listados na Tabela 1 , com exceção de CaCl 2 , em 1 L de água desionizada e armazene a 4 ° C por até 2 semanas.
- Solução padrão aCSF
- Prepare o aCSF padrão para perfusão de alta taxa de fluxo do hipocampo isolado durante gravações eletrofisiológicas. Para fazer o concentrado (5X) aCSF, dissolva todos os componentes listados na Tabela 2 , exceto o CaCl 2 , em 2 L de água desionizada e armazene a 4 ° C.
- Prepare o equipamento
- Antes de iniciar a dissecação, coloque a área do banco com uma bandeja de plástico cheia de gelo (30 x 20 x 5 cm), linhas de tubulação conectadas ao carbógeno ePratos de Petri de vidro ee (10 x 2 cm) (Ver Figura 1 ).
- Adicionar 300 mL de solução de sacarose (estoque 1X) para um copo de 500 mL, bolha com carbogénio (95% O2, 5% de CO 2) e adicionar Ca 2+ [1,2 mM].
- Transfira 60 mL desta solução de sacarose para uma placa de Petri de vidro e deixe à temperatura ambiente. Coloque o restante em um congelador a 4 ° C durante 10 a 15 min.
- Bolha a solução de sacarose gelada com carbogênio durante a dissecção.
- Encha uma segunda placa de Petri (câmara de retenção a frio) com solução de sacarose (4 ° C) e continue com gelo.
- Adicione 30 mL de solução de sacarose gelada a um copo de 50 mL.
2. Dissecção inteira do hipocampo
NOTA: O método para dissecar o hipocampo isolado é essencialmente idêntico ao desenvolvido e descrito originalmente 22 , mas com detalhes adicionais e mudanças em relação ao peTaxa de rfusão e técnicas de gravação.
- Dissecção cerebral
- Anestesize o mouse (P20 - 35) sob uma chaminé com uma pequena toalha de papel embebida com 1 mL de isoflurano (100%) que é adicionado na gaiola.
- Decapite o mouse anestesiado e submergir rapidamente a cabeça em solução de sacarose gelada (copo de 50 mL, ~ 5 s). Transfira para uma toalha de papel.
- Use um bisturi para fazer uma incisão medial da pele (caudal para rostral) e empurre a pele nos lados para expor o crânio.
- Corte o crânio com uma pequena tesoura e use uma espátula para extrair rapidamente o cérebro e deixá-lo no prato de Petri contendo solução de sacarose gelada. Deixe 1-2 minutos para o cérebro esfriar.
- Enquanto o cérebro está se recuperando, adicione 2 a 3 mL de solução de sacarose em um prato de lentes de vidro coberto com Petri (dissecção) no gelo.
- Isolando o hipocampo
- Coloque o cérebro no prato de dissecção em uma posição verticalN.
- Remova o cerebelo eo córtex frontal com uma lâmina de barbear. Corte o cérebro pela metade ao longo do plano midsagital e retorna os dois hemisférios isolados para a câmara de espera. Permita mais 1 - 2 min para recuperação.
- Coloque o cérebro hemisectado único na vertical na placa de dissecação.
- Gire o prato até as estruturas midsagittal enfrentar o observador e o contorno embutido do complexo septal é visível como uma fina camada de tecido em forma de pera anterior ao tálamo.
- Mantenha o cérebro hemiciculado firme com a microspatula e coloque a pequena extremidade da espátula revestida de politetrafluoroetileno (PTFE) imediatamente atrás (caudal) da área septal.
- Insira a espátula revestida embaixo do septo e mova a ponta para baixo até chegar a placa de dissecação. Segure as fibras que conectam a área septal caudalmente. Repita a mesma operação ao longo da borda anterior do septo e corte as fibras que se conectam à parte frontal do cérebro.
- Com a espátula segurando ligeiramente a parte interna do córtex logo acima do hipocampo em posição vertical, use a microspatula para retirar cuidadosamente os núcleos tálamo, hipotalâmico e do tronco cerebral. Use a espátula para cortar e remover o tecido afastado.
- Transforme o hemisfério isolado do seu lado e identifique o contorno do hipocampo.
- Insira a espátula revestida no ventrículo lateral, embaixo da extremidade rostral do hipocampo dorsal.
- Segure a espátula alinhada horizontalmente com o plano midsagital do cérebro hemi-detrito e deslize-a através do contorno suave das paredes ventriculares até a ponta emergir caudalmente.
- Segure a espátula embaixo do hipocampo e pressione-a ligeiramente sobre as fibras de conexão, ao longo da camada interna, onde o hipocampo se junta ao córtex sobrepente. Aplique a microspatula no lado externo desta camada e deslize contra a espátula revestida para cortar o fioBers.
- Para completar a extração, gire o prato de dissecação e insira a espátula revestida embaixo do hipocampo ventral. Segure levemente o interior da dobra cortical com a espátula e corte através das conexões entorhinais usando um movimento de corte contra a microspatula.
NOTA: Todo o complexo septohipocampal pode ser removido colocando a espátula revestida sob todo o hipocampo e retirando o tecido cerebral restante por baixo. - Uma vez que o isolamento é completo, mantenha o hipocampo descansando no prato e adicione uma gota de solução de sacarose gelada para mantê-lo fresco. Corte cuidadosamente qualquer cortex e fibras restantes e separe o hipocampo do septo aplicando suavemente uma lâmina de barbear através do fórnix.
NOTA: Se as gravações de grampos de patch devem ser realizadas a partir de células piramidais (ver Seção 4.6 Controle optogenético), o hipocampo isolado pode ser cortado transversalmente em um ângulo de 45 ° para expor a camada piramidal de CA1 ("anglE-cut "), sem comprometer os circuitos de rede locais na parte restante do hipocampo. - Transfira a preparação para solução de sacarose à temperatura ambiente e deixe-a recuperar por 15 a 30 min antes de transferir para a câmara de gravação.
3. Configurar a perfusão rápida para gravar o hipocampo isolado
- Configure o sistema de perfusão alimentado por gravidade para permitir uma entrada contínua de alta velocidade de aCSF oxigenado a 20 - 25 mL / min.
- Prepare frascos aCSF (1X) com antecedência e mergulhe-os em um banho de aquecimento (~ 30 ° C) pelo menos 15 minutos antes do início da experiência. Ligue o sistema de aquecimento da solução em linha (30 ° C).
- Use borbulhadores de aquário e linhas de tubagem ligadas a um tanque de carbogénio para oxigenar aCSF ao longo da expericia, e adicionar CaCl2 [2 mM], antes do início da perfusão.
- Pare o fluxo de aCSF e transfira o hipocampo para a câmara de gravação usando a amplaFim de uma pipeta de vidro. Permitir que a preparação saturada de sacarose afunda e se assente no fundo.
- Coloque a preparação no centro da câmara de gravação (em linha com o eixo entrada-saída) com a superfície lisa de CA1 e SUB na parte superior. Estabilize o hipocampo com pequenos pesos nas extremidades septais e temporais e reinicie o fluxo de aCSF.
4. Eletrofisiologia no hipocampo isolado
- Gravação extracelular de oscilações intactas do hipocampo in vitro
- Para o monitoramento extracelular do potencial de campo local (LFP) ou atividade de unidade única do hipocampo isolado in vitro , use micropipetas de vidro (1 - 3 MΩ) preenchidas com aCSF. Gravar sinais de potencial de campo acoplados a CA de baixo ruído com um amplificador de grampo de gramatura de ganho x1000, filtragem de passagem de banda on-line 0,1 - 500 Hz e uma taxa de amostragem de 5-20 kHz.
NOTA: O microscópio personalizado usado neste protocoloEstá equipado com objetivos de baixa (2.5X) e alta ampliação (40X) para visão de baixa ampliação do hipocampo, bem como microscopia de video infravermelho e epifluorescência para reconhecimento de célula única. Os componentes deste sistema incluem o microscópio de fluorescência vertical, cubos de filtro de fluorescência, uma câmera de vídeo analógica e captura de quadros digital com software de imagem, uma câmara de perfusão personalizada no estágio ( Figura 2A , inserção i) e micromanipuladores de alta precisão para gravações neuronais e Colocação de fibra óptica. - Use a câmera montada no microscópio e conectada a uma tela do computador para inspecionar a preparação do hipocampo sob baixa ampliação (2.5X) e verifique rapidamente que não haja cortes inferiores ou danos na superfície externa. O arranjo orientado diagonalmente das fibras de alveus ao longo da superfície lisa de CA1 deve ser visível ( Figura 2A , inserção ii) ao brilhar a luz transmitida através do hipocampopus.
- Use o objetivo de campo largo de ampliação baixa para ver o hipocampo isolado e a colocação de eletrodos LFP em locais de gravação específicos.
NOTA: Um layout da preparação isolada do hipocampo com múltiplos eletrodos colocados em diferentes locais de gravação é ilustrado na Figura 2A . - Abaixe um eletrodo LFP no banho até tocar na superfície (alveus) da área CA1.
NOTA: Isso geralmente produz um transiente rápido na gravação acoplada a CA, semelhante ao que acontece quando o eletrodo entra em contato com a mídia de gravação. Um monitor de áudio pode ser útil para ouvir o sinal do canal LFP após essa etapa.
NOTA: Muitas vezes, os primeiros sinais de atividade só aparecerão após 10-15 minutos, portanto, é importante não avançar rapidamente na preparação. Se, após este período, o eletrodo LFP da superfície ainda não estiver pegando atividade, avançar um pouco mais para baixo através dos estranhos oriensE paie periodicamente para ver se surge alguma forma de atividade ao aproximar-se da camada celular principal. Se nada for detectado após 5 a 10 minutos adicionais, retire cuidadosamente o eletrodo e coloque-o em outro lugar ao longo da mesma região. - Avance o eletrodo LFP através da camada piramidal. Observe que a atividade de exclusão extracelular aumenta inicialmente, uma vez que a única unidade de descarga de neurônios individuais (principalmente células de cesta piramidais e inibitórias) é detectada. Abaixe ainda mais o eletrodo e observe que o pico começa a desaparecer novamente à medida que a ponta cruza no radiatum. Observe que uma oscilação de rede claramente visível na faixa theta-frequency (4 - 12 Hz) se torna aparente e atinge a amplitude máxima (~ 100 - 300 μV), pois a localização da gravação é baixada através do radiatum.
- Para o monitoramento extracelular do potencial de campo local (LFP) ou atividade de unidade única do hipocampo isolado in vitro , use micropipetas de vidro (1 - 3 MΩ) preenchidas com aCSF. Gravar sinais de potencial de campo acoplados a CA de baixo ruído com um amplificador de grampo de gramatura de ganho x1000, filtragem de passagem de banda on-line 0,1 - 500 Hz e uma taxa de amostragem de 5-20 kHz.
- Oscilações de Theta em uma única região
- Para testar as propriedades espaciais das oscilações teta espontâneas na região CA1, coloque a ponta oEletrodo LFP de referência em um local CA1 medial (localizado ao longo do eixo septo-temporal longitudinal) e baixe-o para o radiatum como descrito anteriormente.
- Coloque um segundo eletrodo LFP em um site CA1 (200 - 800 μm septal ou temporal da primeira LFP) e observe que as oscilações CAl theta podem sincronizar em distâncias relativamente grandes.
- Oscilações Theta em camadas
- Para testar as propriedades das oscilações theta em camadas do hipocampo, deixe um eléctrodo LFP de referência em um local CA1 radiatum. A partir de apenas acima do estrato oriens, abaixe um segundo eletrodo na camada de células piramidais e através do radiatum. Observe uma inversão gradual do sinal LFP (inversão relativa da fase) através da camada piramidal.
NOTA: Para exemplos representativos desses tipos de atividade, veja a Figura 2B . Exemplos de perfis laminar / profundidade e análise de densidade de fonte atual (CSD)Está ilustrando o local de reversão de fase em hipocampos isolados que foram publicados anteriormente 23 , 24 , 25 .
- Para testar as propriedades das oscilações theta em camadas do hipocampo, deixe um eléctrodo LFP de referência em um local CA1 radiatum. A partir de apenas acima do estrato oriens, abaixe um segundo eletrodo na camada de células piramidais e através do radiatum. Observe uma inversão gradual do sinal LFP (inversão relativa da fase) através da camada piramidal.
- Oscilações gamma e acoplamento theta-gamma no hipocampo intacto
- Coloque um eléctrodo de campo na borda CA1 / SUB e abaixe-o até que ele fique na interface entre as camadas piramidais e moleculares. A este nível, um potencial de campo exibindo oscilações nítidas claras com mudanças na amplitude que o bloqueio de fase ao ritmo theta local pode ser gravado 24 . Ajuste a escala para observar a escala de tempo lenta do acoplamento theta-gamma. Note-se que as explosões de gama ocorrem em duas bandas de freqüência distintas, que podem ser reveladas através da filtragem passa-banda do sinal LFP em curso na faixa lenta (25 - 50 Hz) e gama rápida (150 - 250 Hz) (veja a Figura 2C para o filtro representado Traços).
- Gravação de grampos de patch de células inteiras durante as oscilações de theta do hipocampo in vitro
NOTA: Nesta parte do protocolo, o objetivo é obter gravações de grampos de patch de células inteiras guiadas visualmente de interneurônios identificados em hipocampos isolados de camundongos PV-TOM transgênicos que expressam a proteína fluorescente, tdTomato, sob o controle do promotor PV (para Mais detalhes veja materiais e Ref 26 ).- Use microscopia de vídeo de fluorescência com ampliação baixa (2.5X) e alta potência (40X) para visualizar os interneurônios tdTomato-positivos localizados perto da superfície de uma preparação do hipocampo a partir de um mouse PV-TOM ( Figura 3 ). Note-se que, embora os neurônios PV-TOM possam ser visualizados com sucesso e direcionados para o parto através do alvéoto (até 100 μm), as células piramidais não fluorescentes também podem ser alcançadas com bastante facilidade quando o hipocampo é preparado com a técnica de corte angular (ver Nota da Seção 2.2.14).
- Sob uma visão de baixa ampliação do hipocampo, coloque um eletrodo LFP em CA1 / SUB para monitorar as oscilações theta enquanto se prepara para experimentos de grampos patch.
- Mude para a ampliação 40X e mergulhe o objetivo sobre a região alvo; Abaixe-o até que as camadas superiores se tornem visíveis. Manipule a posição do microscópio para garantir um acesso aberto suficiente para a aproximação da pipeta do lado oposto.
- Sob microscopia de fluorescência, selecione uma célula fluorescente de PV-TOM e aproxime-a com uma pipeta de patch (2 - 3 MΩ) preenchida com solução intracelular padrão.
- Use uma peça de boca para aplicar pressão positiva leve à pipeta e monitore a resistência à medida que o eletrodo é baixado para a célula. Quando a ponta encontra a célula alvo, a resistência da pipeta aumenta e uma covinha transparente aparece quando a pressão positiva empurra a membrana. Solte a pressão e verifique se o pulso atual se aplana quando um selo começa a se formar. Imediatamente clAmplificador para um potencial hiperpolarizado (-70 mV), e uma vez que uma vedação GΩ é alcançada, rompa a membrana celular com uma pequena quantidade de pressão negativa aplicada através do suporte da pipeta.
- Uma vez na configuração de células inteiras, examine as propriedades fisiológicas da célula fotovoltaica identificada durante oscilações espontâneas do hipocampo ( Figura 3B ).
- Observe que a gravação de potencial de membrana intracelular a partir de células fotovoltaicas é caracterizada por comportamento de pico rápido e rajadas de potenciais de ação sincronizados com o ritmo de onda CA1 / SUB contínuo.
- Mude para a tensão-braçadeira e mantenha a célula em diferentes potenciais de membrana para caracterizar a proporção das correntes sinápticas excitatórias versus inibitórias geradas pela atividade rítmica intrínseca. Um exemplo de gravação de grampos patch de uma célula piramidal é mostrado na Figura 3A para comparação.
- Controle optogenético no hipocampo isolado
NOTA: Para o controle optogenético da atividade da rede do hipocampo, uma estratégia específica do tipo celular envolvendo ativação rítmica de células GABAérgicas contendo PV é usada aqui, pois essas células mostraram desempenhar um papel importante na sincronização das principais populações celulares no hipocampo isolado 25 . A expressão seletiva da canalrhodopsina-2 excitadora (ChR2) em células fotovoltaicas é conseguida atravessando a linha de mouse PV-Cre com camundongos que expressam constitutivamente ChR2 Cre-dependentemente (Ai32), gerando assim ratos PV-ChY. Alternativamente, as construções de vetores virais ( por exemplo , AAVdj-ChETA-eYFP) podem ser injetadas no hipocampo de ratos PV-Cre ou PV-TOM (P15-16) para direcionar a expressão do opsin excitatório em interneurônios CA1 / SUB ( Figura 4A ).
NOTA: Esta estratégia foi descrita anteriormente 25 .- Coloque um eletrodo LFP na área CA1 / SUB e repare uma célula piramidal próxima no hipoco isoladoAmpus de um mouse que expressa o opsin excitatório sensível à luz azul ChR2 em interneurônios PV.
- Coloque uma guia de luz de fibra óptica (0,2 - 1 mm de diâmetro) acima da preparação do hipocampo e centre-a na região registrada. Use luz azul (473 nm) a partir de uma fonte de LED para estimulação optogenética, consistindo em pulsos de luz (10 - 20 ms, acionados por um sinal de transistor-transistor), ou comandos de tensão de onda sinusoidal entregues nas freqüências de theta (4 - 12 Hz).
NOTA: O conjunto personalizado de estimulação de luz com base em LED foi descrito em outro lugar 25 . - Mude para o grampo atual e caracterize a atividade da piramidal durante oscilações espontâneas da teta.
- Comece o protocolo de estimulação e registre as respostas da luz. Considere que as oscilações do campo e a atividade sináptica no neurônio gravado se sincronizam cada vez mais durante a estimulação optogenética e que a estimulação rítmica das células fotovoltaicas resulta em um controle robusto das duas frequênciasIncitação e potência das oscilações theta ( Figura 4 ).
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Resultados
Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos estudando oscilações theta na preparação de hipocampo isolado no mouse in vitro . O procedimento de dissecção para extração do hipocampo isolado está ilustrado na Figura 1 . Usando esta preparação, as oscilações teta intrínsecas podem ser examinadas durante a colocação de eletrodos de campo múltiplos, registrando atividade geral e entradas sinápticas sincronizadas para populações ...
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Discussão
Embora as gravações eletrofisiológicas de fatias agudas do hipocampo constituam uma técnica in vitro padrão, os métodos aqui apresentados diferem substancialmente da abordagem clássica. Ao contrário das preparações finas em fatias onde as camadas celulares específicas são visíveis na superfície e podem ser examinadas diretamente, as preparações intactas do hipocampo são mais parecidas com as configurações in vivo onde os eletrodos são abaixados em regiões cerebrais direcionadas enquanto atravessam cama...
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Divulgações
Os autores declaram que não há interesses comerciais ou financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde e Ciências Naturais.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| ReagentesCloreto de | |||
| sódio | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sacarose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - fosfato de sódio monobásico | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Sulfato de magnésio | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Cloreto de potássio | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-glicose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Cloreto de cálcio di-hidratado | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Ascorbato de sódio | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Nome | Company | Número de catálogo | Comentários |
| Equipamento | |||
| Tesoura de dissecação padrão | Fisher Scientific | 08-951-25 | extração cerebral |
| Bisturi Punho #4, 14 cm | WPI | 500237 | extração cerebral |
| Filtro pinça, mandíbulas planas, retas (11 cm) | WPI | 500456 | extração de cérebro |
| Lâminas de bisturi de aço inoxidável Paragon #20 | Ultident | 02-90010-20 | extração de cérebro |
| Tesoura de dissecação curva de ponta fina | Thermo Fisher Scientific | extração de | cérebro |
| Espátula fina revestida de teflon (PTFE) VWR | 82027-534 | preparação | |
| para o hipocampoEspátula Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | preparação para hipocampo |
| Colher de laboratório | Fisher Scientific | 14-375-20 | preparação para hipocampo |
| Vidro borossilicato Pasteur Pipetas | Fisher Scientific | 13-678-20A | preparação para hipocampo |
| Droper | Fisher Scientific | preparação para hipocampo | |
| Lâminas de barbear Lâmina de barbear | VWR | 55411-055 | preparação do hipocampo |
| Papel para lentes (4 x 6") | VWR | 52846-001 | preparação do hipocampo |
| Placas de Petri de vidro (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | preparação do hipocampo |
| Bandeja de plástico para gelo; tamanho 30 x 20 x 5 cm | n.a.n.a.preparação | do hipocampo | |
| Aquecedor de solução única em linha | Warner Instruments | Sistema de perfusão SH-27B | |
| Pedras de ar de aquário para borbulhar | sistema de perfusão n.a.n.a.sistema | perfusão | |
| Tubulação Tygon E-3603 (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | sistema de perfusão |
| Frigideira elétrica | Preto & Sistema de | perfusão | Decker n.a. |
| 95% O2/5% CO2 mistura gasosa (carbogênio) | de | perfusão | Vitalaire |
| Garrafas/frascos de vidro (4 x 1 L) | n.a.n.a.sistema | perfusão | |
| Gravação submersa Desenho personalizado da câmara | (FM) | n.a.Alternativa | comercial pode ser utilizada |
| Pipetas de vidro (1,5/0,84 OD/ID (mm)) WPI | 1B150F-4 | electrofisiologia | |
| Hum Bug 50/60 Hz Eliminador de ruído | Quest Scientific | Eletrofisiologia | Q-Humbug |
| Amplificador patch-clamp Multiclamp 700B | Dispositivos | moleculares Eletrofisiologia | MULTICLAMP |
| Programa Multiclamp 700B Commander | Dispositivos moleculares | Eletrofisiologia MULTICLAMP | |
| Conversor digital/analógico | Dispositivos moleculares | Eletrofisiologia DDI440 | |
| PCLAMP10 | Dispositivos | molecularesPCLAMP10 | eletrofisiologia |
| Mesa de isolamento de vibrações | Newport | n.a.eletrofisiologia | |
| Micromanipuladores (operados manualmente | ) Siskiyou | Eletrofisiologia MX130 | (LFP) |
| Micromanipuladores (automatizados) | Siskiyou | Eletrofisiologia MC1000e | (patch) |
| Monitor de áudio | Sistemas A-M Modelo | 3300 | eletrofisiologia |
| Micropipeta/Patch extrator de pipetas | Sutter | P-97 | eletrofisiologia |
| Microscópio de fluorescência vertical personalizado | Siskiyou | n.a.Imaging | |
| Câmera de vídeo analógica | COHU | 4912-2000/0000 | Imagem |
| Capturador de quadros digital com software de imagem | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Objetiva de imagem |
| Olympus 2.5X | Olympus | MPLFLN | Objetiva de |
| imersão em água Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging | |
| de diodo emissor de luz (LED) feito sob medida | estimulação | optogenética personalizada (Amhilon et al., 2015) | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Animais | |||
| PV::Camundongos Cre (KI) | de estoque do | Jackson Laboratory | Permitir Expressão gênica dirigida por Cre em interneurônios PV |
| Camundongos Ai9 condicionais constitutivos (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))Número | de estoque do | Jackson Laboratory | Express TdTomato após recombinação mediada por Cre |
| Camundongos Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2 (H134R)-EYFP | Jackson | Laboratory stock número 012569 | Expresse a proteína de fusão de channelrhodopsin-2/EYFP aprimorada após exposição a Cre camundongos recombinase |
| PVChY | Criação domiciliar | n.a.Descendentes | obtidos do cruzamento da linhagem PV-Cre com camundongos Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
Referências
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function. Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).
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