Aqui, apresentamos um protocolo para a gravação da teta de rede neuronal rítmica e das oscilações gama de uma preparação isolada do hipocampo inteiro. Descrevemos os passos experimentais da extração do hipocampo para detalhes de gravações de grampos de campo, unidade e toda célula, bem como a estimulação optogenética do ritmo de theta.
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Artigo de método
Tuning na banda Theta do hipocampo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo descreve os procedimentos para a preparação e gravação do hipocampo inteiro isolado, de WT e camundongos transgênicos, além de melhorias recentes em metodologias e aplicações para o estudo das oscilações theta. Uma caracterização simples da preparação isolada do hipocampo é apresentada pelo qual a relação entre os osciladores internamente da teta do hipocampo é examinada em conjunto com a atividade das células piramidais e interneurônios GABAérgicos, nas áreas cornu ammonis-1 (CA1) e subículo (SUB). No geral, mostramos que o hipocampo isolado é capaz de gerar oscilações theta intrínsecas in vitro e que a ritmicidade gerada no hipocampo pode ser manipulada com precisão pela estimulação optogenética de interneurônios com parvalbumina positiva (PV). A preparação de hipocampo isolado in vitro oferece uma oportunidade única de usar gravações simultâneas de grampos e grampos intracelulares de neu visualmente identificadoRons para entender melhor os mecanismos subjacentes à geração de ritmo theta.
Introdução
As oscilações do hipocampo (4 - 12 Hz) estão entre as formas mais predominantes de atividade rítmica no cérebro de mamíferos e acreditam desempenhar papéis fundamentais nas funções cognitivas, como o processamento da informação espaciotemporal e a formação de memórias episódicas 1 , 2 , 3 . Enquanto vários estudos in vivo que realçam a relação das células do quadrado modificadas com estudos espaciais de navegação e lesão, além de evidências clínicas, sustentam a visão de que as oscilações do theta do hipocampo estão envolvidas na formação da memória
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Protocolo
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos e diretrizes aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade McGill e pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais.
1. Preparação intacta de hipocampo agudo
NOTA: O isolamento da preparação intacta do hipocampo envolve três etapas principais: (1) Preparação de soluções e equipamentos, (2) Dissecção do hipocampo e (3) Configuração do sistema de taxa de perfusão rápida necessário para geração de oscilações intrínsecas da teta. Neste protocolo, o desempenho atempado dos procedimentos - desde a dissecação até a gravação - é pa....
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Resultados
Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos estudando oscilações theta na preparação de hipocampo isolado no mouse in vitro . O procedimento de dissecção para extração do hipocampo isolado está ilustrado na Figura 1 . Usando esta preparação, as oscilações teta intrínsecas podem ser examinadas durante a colocação de eletrodos de campo múltiplos, registrando atividade geral e entradas sinápticas sincronizadas para populações .......
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Discussão
Embora as gravações eletrofisiológicas de fatias agudas do hipocampo constituam uma técnica in vitro padrão, os métodos aqui apresentados diferem substancialmente da abordagem clássica. Ao contrário das preparações finas em fatias onde as camadas celulares específicas são visíveis na superfície e podem ser examinadas diretamente, as preparações intactas do hipocampo são mais parecidas com as configurações in vivo onde os eletrodos são abaixados em regiões cerebrais direcionadas enquanto atravessam cama.......
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Divulgações
Os autores declaram que não há interesses comerciais ou financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde e Ciências Naturais.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| ReagentesCloreto de | |||
| sódio | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sacarose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - fosfato de sódio monobásico | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Sulfato de magnésio | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Cloreto de potássio | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-glicose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Cloreto de cálcio di-hidratado | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Ascorbato de sódio | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Nome | Company | Número de catálogo | Comentários |
| Equipamento | |||
| Tesoura de dissecação padrão | Fisher Scientific | 08-951-25 | extração cerebral |
| Bisturi Punho #4, 14 cm | WPI | 500237 | extração cerebral |
| Filtro pinça, mandíbulas planas, retas (11 cm) | WPI | 500456 | extração de cérebro |
| Lâminas de bisturi de aço inoxidável Paragon #20 | Ultident | 02-90010-20 | extração de cérebro |
| Tesoura de dissecação curva de ponta fina | Thermo Fisher Scientific | extração de | cérebro |
| Espátula fina revestida de teflon (PTFE) VWR | 82027-534 | preparação | |
| para o hipocampoEspátula Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | preparação para hipocampo |
| Colher de laboratório | Fisher Scientific | 14-375-20 | preparação para hipocampo |
| Vidro borossilicato Pasteur Pipetas | Fisher Scientific | 13-678-20A | preparação para hipocampo |
| Droper | Fisher Scientific | preparação para hipocampo | |
| Lâminas de barbear Lâmina de barbear | VWR | 55411-055 | preparação do hipocampo |
| Papel para lentes (4 x 6") | VWR | 52846-001 | preparação do hipocampo |
| Placas de Petri de vidro (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | preparação do hipocampo |
| Bandeja de plástico para gelo; tamanho 30 x 20 x 5 cm | n.a.n.a.preparação | do hipocampo | |
| Aquecedor de solução única em linha | Warner Instruments | Sistema de perfusão SH-27B | |
| Pedras de ar de aquário para borbulhar | sistema de perfusão n.a.n.a.sistema | perfusão | |
| Tubulação Tygon E-3603 (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | sistema de perfusão |
| Frigideira elétrica | Preto & Sistema de | perfusão | Decker n.a. |
| 95% O2/5% CO2 mistura gasosa (carbogênio) | de | perfusão | Vitalaire |
| Garrafas/frascos de vidro (4 x 1 L) | n.a.n.a.sistema | perfusão | |
| Gravação submersa Desenho personalizado da câmara | (FM) | n.a.Alternativa | comercial pode ser utilizada |
| Pipetas de vidro (1,5/0,84 OD/ID (mm)) WPI | 1B150F-4 | electrofisiologia | |
| Hum Bug 50/60 Hz Eliminador de ruído | Quest Scientific | Eletrofisiologia | Q-Humbug |
| Amplificador patch-clamp Multiclamp 700B | Dispositivos | moleculares Eletrofisiologia | MULTICLAMP |
| Programa Multiclamp 700B Commander | Dispositivos moleculares | Eletrofisiologia MULTICLAMP | |
| Conversor digital/analógico | Dispositivos moleculares | Eletrofisiologia DDI440 | |
| PCLAMP10 | Dispositivos | molecularesPCLAMP10 | eletrofisiologia |
| Mesa de isolamento de vibrações | Newport | n.a.eletrofisiologia | |
| Micromanipuladores (operados manualmente | ) Siskiyou | Eletrofisiologia MX130 | (LFP) |
| Micromanipuladores (automatizados) | Siskiyou | Eletrofisiologia MC1000e | (patch) |
| Monitor de áudio | Sistemas A-M Modelo | 3300 | eletrofisiologia |
| Micropipeta/Patch extrator de pipetas | Sutter | P-97 | eletrofisiologia |
| Microscópio de fluorescência vertical personalizado | Siskiyou | n.a.Imaging | |
| Câmera de vídeo analógica | COHU | 4912-2000/0000 | Imagem |
| Capturador de quadros digital com software de imagem | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Objetiva de imagem |
| Olympus 2.5X | Olympus | MPLFLN | Objetiva de |
| imersão em água Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging | |
| de diodo emissor de luz (LED) feito sob medida | estimulação | optogenética personalizada (Amhilon et al., 2015) | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Animais | |||
| PV::Camundongos Cre (KI) | de estoque do | Jackson Laboratory | Permitir Expressão gênica dirigida por Cre em interneurônios PV |
| Camundongos Ai9 condicionais constitutivos (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))Número | de estoque do | Jackson Laboratory | Express TdTomato após recombinação mediada por Cre |
| Camundongos Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2 (H134R)-EYFP | Jackson | Laboratory stock número 012569 | Expresse a proteína de fusão de channelrhodopsin-2/EYFP aprimorada após exposição a Cre camundongos recombinase |
| PVChY | Criação domiciliar | n.a.Descendentes | obtidos do cruzamento da linhagem PV-Cre com camundongos Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
Referências
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J.
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Reimpressões e permissões
