Um método rápido e eficiente para dissecar asas Pupal de Drosophila apropriado para Immunodetections ou ensaios PCR

Summary

A capacidade de detectar com precisão as transcrições ou proteínas em Drosophila tecidos é fundamental para estudar a sua abundância e relacionadas com o processo de desenvolvimento de localização. Aqui está a descrição de um procedimento simples para dissecar as asas pupal. Estas asas podem ser usadas como amostras em várias técnicas (imuno-histoquímica, ensaio PCR, etc.).

Abstract

Desenvolvimento de asa em Drosophila melanogaster é um modelo ideal para o estudo de morfogênese a nível do tecido. Estes apêndices desenvolvem a partir de um grupo de células chamado discos imaginária de asa formados durante o desenvolvimento embrionário. Na fase larval os discos imaginária crescem, aumentando seu número de células e formando estruturas epiteliais monolayered. Dentro da pasta pupal, os discos imaginária brote para fora e dobram em bilayers ao longo de uma linha que se torna a futura margem da asa. Durante este processo, as veias primodia longitudinal se originam células veia nas potenciais superfícies dorsais e ventrais da asa. Durante a fase de pupa as listras de veia células da superfície de comunicam para gerar tubos apertados; ao mesmo tempo, as Cruz-veias começam a sua formação.

Com a ajuda de marcadores moleculares apropriadas, é possível identificar os principais elementos que compõem a ala durante seu desenvolvimento. Por esta razão, a capacidade de detectar com precisão as transcrições ou proteínas nesta estrutura é fundamental para estudar a sua abundância e localização relacionadas com o processo de desenvolvimento da asa.

O procedimento descrito aqui centra-se na manipulação de asas pupal, fornecendo instruções detalhadas sobre como dissecar a ala durante a fase de pupa. A dissecção de tecidos pupal é mais difícil de executar do que suas contrapartes em larvas de terceiro instar. É por isso que esta abordagem foi desenvolvida, para obter amostras de rápida e eficiente de alta qualidade. Detalhes de como delgados e montagem destas amostras de asa, para permitir a visualização de proteínas ou componentes celulares, são fornecidas no protocolo. Com pouco conhecimento, é possível coletar 8-10 asas pupal de alta qualidade em um curto espaço de tempo.

Introduction

Asas de drosófila são desenvolvidas a partir dos discos de imaginária de asa. O primordial destes discos de asa são colocadas de lado durante o desenvolvimento embrionário como pequenos grupos de 20-30 células imaginária que invaginate do epitélio embrionário. Quando a larva está crescendo para a terceira fase de instar, mitose ocorre nas células imaginária em horários específicos característicos, aumentando seus números (cerca de 50000 células) e formando a ala disco^{1,2,3, 4}. Como as células proliferam, elas forme um epitélio tubu....

Protocol

Dia 1

1. coleta e cultivo de pupas.

1. Remover 0 h após a formação do casulo (APF) ou pré-pupa usando um pincel molhado de frascos culturas e colocá-los em frascos novos quase completar o período de desenvolvimento (ver 2.1 e 2.2).
   Nota: Uma população saudável de moscas deve ser mantida usando protocolos padrão de cultivo. Depois de três ou quatro dias em que os ovos são postos, os adultos podem ser removidos de frascos para permitir um desenvolvimento ideal dos indivíduos. Eles são mantidos a uma temperatura constante, até as terceiro ínstar larvas iniciar pupa. A transição larval/pupa é marcada pela formação d....

Results

O protocolo oferece um método simples para a obtenção de amostras de asa pupal que retêm a morfologia familiar da asa. Partir dessas preparações, é possível obter pilhas de imagens que podem ser projetadas como 2-D ou 3-d, para investigar a distribuição e/ou o enriquecimento das proteínas durante a diferenciação da ala. Um protocolo semelhante (veja a nota em 2.9) pode ser usado para coletar a amostra de grandes asas pupal (envolvendo asas pupal de 50-80) necessária para sintetizar ácido .......

Discussion

O método de dissecação descrito neste vídeo pode ser usado para preparar amostras de alta qualidade da drosófila asas pupal de diferentes estágios de desenvolvimento para muitos tipos de técnicas (por exemplo, imunofluorescência, síntese de cDNA para ensaios PCR, in vitro desenvolvimento de asa). Em termos deste método o cientista envolvidos usaram 24-30 h APF. No entanto, não deve haver nenhum obstáculo dentro as etapas essenciais na dissecação da pupa mais jovem ou mais velho. Mudanças podem.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estereomicroscópio com iluminação de luz fria	Nikon
Plataforma de balanço	Biometra (WT 16)	042-500
Lâminas de microscópio	StarFrost	8037/1
Óculos de cobertura (24 x 32 mm)	Deltalab	D102432
Fórceps	FST	11252-00
Tesoura	Lawton	63-1400
Prato de plástico multipoços	Thermo Pipeta Scientific	144444
p100 ou p200	Finnpipette (Labsystems)	9400130
1X PBS (Dulbecco)	Gibco	21600-010
4% paraformaldeído	Sigma	158127
Triton X-100	Sigma	T8787
BSA	Bio Basic INC.	9048-46-8
Glicerol	Mallinckrodt	5092
Tris	Amresco	497
TRIzol Reagente	Ambion	15596026
DEPC água tratada	MO. BIO	17011-200
Alexa Fluor 546 cabra anti-camundongo IgG (H+L), 2 mg/mL (diluição de trabalho 1/800)	Invitrogen	A11030
Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μ g/mL (diluição de trabalho 1/100)	Banco de Hibridoma de Estudos de Desenvolvimento (DSHB)		Por Isabel Gerrero do DSHB sob os auspícios do NICHD e mantido pela Universidade de Iowa, Departamento de Ciências Biológicas, Iowa City, IA 52242.
DAPI, 1 mg/mL (diluição de trabalho 1/5000)	Invitrogen	62248
Faloidina conjugada a Alexa 488, 300 U/1,5 mL de metanol (diluição de trabalho 1/600)	Invitrogen	A12379
Canton S (estoque de mosca)	Bloomington Drosophila Stock Center