Artigo de método

PIP-on-a-chip: um estudo livre de rótulos de Interações Proteína-fosfoinositide

DOI:

10.3791/55869

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27 de julho de 2017

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry, The Pennsylvania State University

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos uma bicamada lipídica suportada no contexto de uma plataforma microfluídica para estudar as interações proteína-fosfoinositide usando um método livre de rótulas baseado na modulação do pH.

Resumo

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Numerosas proteínas celulares interagem com superfícies de membrana para afetar processos celulares essenciais. Essas interações podem ser direcionadas para um componente lipídico específico dentro de uma membrana, como no caso de fosfoinositidos (PIPs), para garantir a localização e / ou ativação subcelular específica. PIPs e domínios de ligação celular PIP foram estudados extensivamente para entender melhor seu papel na fisiologia celular. Aplicamos um teste de modulação de pH em bicamadas lipídicas (SLBs) suportadas como uma ferramenta para estudar interações proteína-PIP. Nestes estudos, a fosfatidiletanolamina conjugada orto- Sulforododina B, utilizada para o pH, é utilizada para detectar interações proteína-PIP. Após a ligação de uma proteína a uma superfície de membrana contendo PIP, o potencial interfacial é modulado ( isto é, mudança no pH local), deslocando o estado de protonação da sonda. Um estudo de caso do uso bem sucedido do ensaio de modulação de pH é apresentado usando fosfolipase C delta1 PleckstrNo domínio da Homologia (PLC-δ1 PH) e da fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PI (4,5) P 2 ) como exemplo. A constante de dissociação aparente ( K d, app ) para essa interação foi de 0,39 ± 0,05 μM, semelhante a K d, valores de aplicativos obtidos por outros. Como observado anteriormente, o domínio PH de PLC-δ1 é PI (4,5) P 2 específico, mostra fraca ligação no sentido de fosfatidilinositol-4 fosfato, e nenhuma ligação a SLBS fosfatidilcolina pura. O ensaio PIP-on-a-chip é vantajoso em relação aos ensaios tradicionais de ligação a PIP, incluindo, mas não limitado a, baixo volume de amostra e nenhum requerimento de marcação de ligando / receptor, a capacidade de testar interações de membrana de alta e baixa afinidade com pequenas e pequenas Grandes moléculas e uma relação sinal / ruído melhorada. Consequentemente, o uso da abordagem PIP-on-a-chip facilitará a elucidação de mecanismos de uma ampla gama de interações de membrana. Além disso, este método poderia ser potencialmente vocêNa identificação de terapias que modulam a capacidade da proteína para interagir com as membranas.

Introdução

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Inúmeras interacções e processos bioquímicos ocorrem em superfícies de membranas fluidas de duas dimensões. Os organelos fechados em membrana em células eucarióticas são únicos, não apenas nos processos bioquímicos e seu proteoma associado, mas também na sua composição lipídica. Uma classe excepcional de fosfolípidos é fosfoinositides (PIPs). Embora constituam apenas 1% do lipidoma celular, eles desempenham um papel crucial na transdução de sinal, autofagia e tráfico de membrana, entre outros 1 , 2 , 3 , 4 . A fosforilação dinâmica do grupo de cabeça de inositol pelas quinases PIP celulares dá origem a sete grupos principais PIP que são mono-, bis- ou trisfosforilados 5 . Além disso, os PIPs definem a identidade subcelular das membranas e servem como locais de encaixe de membrana especializados para proteínas / enzimas contendo um ou mais fosfoinosDomínios de vinculação, por exemplo, Pleopstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) e epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . Um dos domínios de ligação ao PIP mais bem estudados é o da fosfolipase C (PLC) domínio PH -δ1 que interage especificamente com fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) dentro de uma gama micromolar nanomolar de baixa afinidade elevada 8 , 9, 10, 11.

Uma variedade de métodos in vitro qualitativos e quantitativos foram desenvolvidos e utilizados para estudar o mecanismo, termodinâmica e especificidade dessas interações. Entre os ensaios de ligação a PIP mais utilizados são a ressonância de plasmão de superfície (SPR), a calorimetria isotérmica (ITC), a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), o ensaio de flotação / sedimentação de lipossomas e transferências de lipidos (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . Embora estes sejam amplamente utilizados, todos eles têm muitas desvantagens. Por exemplo, SPR, ITC e RMN requerem grandes quantidades de amostras, instrumentação cara e / ou pessoal treinado 12 , 13 . Alguns formatos de ensaio, tais como tampões lipídicos baseados em anticorpos, utilizam formas solúveis em água de PIPs e os apresentam de maneira não fisiológica 12 , 14 , 15 , 16 . Além disso, as transferências de lípidos não podem ser quantificadas de forma confiável e muitas vezes resultaram em observações falsas positivas / negativas 12 , 17 , 18 . Para superar esses desafios e melhorar o conjunto de ferramentas atual, um novo método livre de etiqueta foi estabelecido com base em uma bicamada lipídica suportada (SLB) no contexto de am Plataforma icrofluidica, que foi aplicada com sucesso no estudo das interações proteína-PIP ( Figura 1 ) 19 .

A estratégia empregada para detectar interações proteína-PIP é baseada na detecção de modulação de pH. Isto envolve um corante sensível ao pH que tem orto- Sifforodamina B ( o SRB) diretamente conjugado com o grupo de cabeça lipídica de fosfatidiletanolamina 20 . A sonda o SRB-PAPA (Figura 2A) é altamente fluorescente a um pH baixo e extinguiu-se a pH elevado com um pKa dentro de cerca de 6,7 7,5 mol% de PI (4,5) P 2 SLBS molecular contendo (Figura 5B). O domínio PLC-δ1 PH tem sido amplamente utilizado para validar as metodologias de ligação à proteína-PIP devido à sua alta especificidade em relação a PI (4,5) P 2 ( Figura 5A ) 21 , 22 ,"23 , 24 , 25. Assim, argumentamos que o domínio PH do PLC-δ1 pode ser usado para testar sua ligação ao PI (4,5) P 2 através do ensaio PIP-on-a-chip. A construção do domínio PH utilizado no presente estudo tem uma carga global positiva (pI 8,4), e, assim, atrai OH -. iões (Figura 5C) após ligação a PI (4,5) P 2 SLBS molecular contendo, o domínio PH traz as OH - iões para o superfície da membrana, que por sua vez modula o potencial interfacial e muda o estado de protonação do SRB-PAPA (Figura 5C) 26. Como uma função da concentração de domínio PH, a fluorescência é extinta (figura 6A). Finalmente, os dados normalizados é ajustar a uma isotérmica de ligação para determinar a afinidade do domínio PH-PI (4,5) P 2 interacção (Figura 6B, 6C).

Neste estudo, um protocolo detalhado é fornecido para realizar a ligação de proteínas aos SLBs contendo PIP dentro de uma plataforma microfluídica. Este protocolo leva o leitor a montar o dispositivo microfluídico e a preparação da vesícula para a formação de SLB e ligação de proteínas. Além disso, instruções para a análise de dados para extrair a informação de afinidade para o domínio PI-PLC-δ1 PH (4,5) P 2 interacção são fornecidos.

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Protocolo

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1. Limpando as lâminas de vidro

  1. Diluir a solução de limpeza 7x (ver Tabela de materiais ) 7 vezes com água desionizada em um prato de vidro de borosilicato de 100 mm de profundidade com um fundo plano e aquecê-lo até 95 ° C em uma placa quente nivelada durante 20 min ou até a solução turva ficar clara .
    NOTA: A solução será quente, tenha cuidado para evitar lesões corporais. A Solução de Limpeza 7x é uma mistura proprietária de fosfato de hexasódio [oxido (fosfonatooxi) fosforil] oxifosforilo], 2- (2-butoxietoxi) etanol 1,4-bis (2-etilhexoxi) -1,4-dioxobutano -2-sulfonato e adições não-perigosas.
  2. Usando pinças, coloque as lamelas (40 mm de comprimento x 22 mm de largura x 0,16-0,19 mm de altura) em um suporte de coloração de alumínio em direções alternadas. Mantenha um ponto vazio entre cada lamínula para evitar que eles se toquem.
  3. Submergir completamente o suporte de coloração com os lamínulas na solução de limpeza. Mantenha os lamínulas emA solução por 1 h.
    NOTA: À medida que a água se evapora, continue adicionando água desionizada fresca para manter a concentração da solução inalterada.
  4. Retire os estantes de coloração da solução de limpeza e lave as lamínulas com quantidades abundantes de água desionizada para remover o detergente.
  5. Secar os lamínulas com gás nitrogênio (aproximadamente 5 min por cremalheira) e, em seguida, colocar as lamínulas em um forno durante 6 h a 550 ° C para recozir.
    NOTA: Este é um passo crucial que suaviza os recursos ásperos na superfície do vidro.
  6. Coloque os lamínulas em um recipiente de plástico e mantenha-os afastados da poeira.

2. Fabricação de Blocos PDMS Micropatternados

  1. Misture o pré-polímero de polidimetilsiloxano (PDMS) e o agente de cura a uma proporção de 10: 1 (p / p) em um grande barco de pesagem de plástico e desgaseifique-o no vácuo durante 1 h com força de vácuo a 500 Torr ou menos.
    NOTA: PDMS é um polímero de silicone transparente e inerte. Para obter o bloco PDMS desejado tHickness (0,5 cm), misture 55 g do pré-polímero com 5,5 g do agente de cura.
  2. Coloque o mestre de silício que contenha múltiplas réplicas do mesmo microprocessador SU-8 em um grande barco de pesagem de plástico (10 cm de diâmetro de base) e despeje o PDMS desgaseificado. Em seguida, cure-o em um forno seco a 60 ° C durante a noite.
    NOTA: Micropatterns são grandes o suficiente para serem vistos a olho nu. Cada padrão contém 8 microcanais (100 μm de largura x 40 μm de altura x 1 cm de comprimento) com espaçamento de 40 μm entre ( Figura 1A , 1B ). O molde de bolacha de silício composto por fotoresist SU-8 assado duro foi fabricado em uma instalação de nanofabricação 27 . Outras abordagens para a preparação do mestre incluem corrosão de ácido fluorídrico (HF), gravura a água a alta temperatura, xurografia e impressão 3D 28 , 29 , 30 , 31 . CommercAs fontes de preparação de silício de silicone também podem ser usadas. Os padrões para o dispositivo microfluídico foram projetados com um software de desenho (ver tabela de materiais). O arquivo original que contém o design do padrão é fornecido como um arquivo suplementar "Pattern Design.dwg", que pode ser fornecido diretamente ao fabricante.
  3. Gentilmente, remova o PDMS do mestre de silício com as mãos. Marque os limites de cada micropatrone em retângulos usando um bisturi cirúrgico e uma régua. Em seguida, corte o PDMS em blocos.
  4. Punch 16 buracos (8 entradas e 8 saídas por bloco) em ambas as extremidades de cada microcanal com um punção de biópsia (1,0 mm de diâmetro do furo) conforme indicado na Figura 3B .
  5. Aplique fita sobre cada bloco PDMS para proteger os micropatrones contra danos e poeiras. Armazene-os em um recipiente de plástico.

3. Preparando pequenas vesículas unilamelares (SUVs)

NOTA: composição de bilayer de controle negativoÉ 99,5% molar de 1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3-fosfocolina (POPC) e 0,5% em moles de orto- Sulforodamina B-1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicer-3-fosfoetanolamina ( o SRB- PAPA). Composição de teste bicamada é 92,0% em moles de POPC, de 0,5% molar o SRB-Pope, e 7,5% em moles de qualquer L-α-fosfatidilinositol-4-fosfato (PI4P) ou L-α-fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PI ( 4,5) P 2 ). Abaixo encontra-se o procedimento para a preparação de 92,0% em moles de POPC, de 0,5% molar o SRB-Pope, e 7,5 mol% de PI (4,5) P 2 SUVs molecular contendo. A síntese de o SRB-POPE utilizada neste estudo foi descrita anteriormente 20 .

  1. Calcule o volume de POPC, PI (4,5) P 2 e o SRB-POPE que precisa ser misturado, o que representa as seguintes quantidades totais: 2,22 mg de POPC, 0,26 mg de PI (4,5) P 2 , E 2,1 x 10 -5 mg de o SRB-POPE.
  2. Pipetar o volume calculado de POPC, PI (4,5) P 2 , o SRB-POPE em um único frasco de cintilação de vidro de 20 mL.
    NOTA: as soluções de estoque POPC e o SRB-POPE vêm em uma solução de clorofórmio, enquanto que o estoque de PI (4,5) P 2 (e outros fosfoinositidos) vem em uma mistura de solventes com clorofórmio: metanol: água (20: 9: 1). Para obter precisão, molhe a ponta da pipeta com clorofórmio antes de usá-la. Por segurança, este passo deve ocorrer dentro de um exaustor químico.
  3. Secar a mistura em uma corrente de gás nitrogênio dentro de um exaustor químico por 10 min ou até o solvente evaporar e uma fina película lipídica se forma no fundo do frasco para injectáveis.
  4. Desecar a mistura sob vácuo durante ≥ 3 h com uma força de vácuo de 10 mTorr para remover qualquer solvente orgânico residual.
    NOTA: O tempo de dessecação de 3 h é suficiente para a escala de preparação SUV descrita neste protocolo, o que é adequado para 50 experimentos. Se for necessária uma escala maior de preparação SUV, pode ser realizada dessecação durante a noite.
  5. Rehydrate the drFilme lipídico com 5 mL de tampão de corrida (HEPES 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,0) e colocá-lo em um banho ultra-sônico a uma freqüência de operação de 35 kHz durante 30 minutos à RT.
    NOTA: misturar as quantidades de lípidos especificadas no passo 3.1 e adicionar 5 mL de tampão de corrida no passo 3.5 produz uma suspensão de vesícula a 0,5 mg / mL. Nesta fase, a suspensão de vesículas é uma mistura de vesículas unilamelares e multilamelares ( Figura 2B ). A solução aparecerá cor de rosa / roxo e relativamente turva.
  6. Congelar-descongelar a suspensão de vesículas com nitrogênio líquido e banho-maria a 40 ° C para obter vesículas unilamelares. Repita o congelamento-descongelamento 10 vezes.
    NOTA: (Opcional) Para garantir a ausência de vesículas não-unilamelares na suspensão, o passo de centrifugação pode ser aplicado 32 , 33 .
  7. Extrude a suspensão de vesículas através de uma membrana de policarbonato gravada com pista de 0,10 μm usando uma extrusora de lipídios (verTabela de materiais) para enriquecer para SUVs. Repita a extrusão 10 vezes.
    NOTA: Um tubo cônico de 15 mL pode ser usado para coletar as vesículas extrudidas. A solução deve estar vazia de turbidez nesta fase. O diâmetro SUV pode ser confirmado através de dispersão de luz dinâmica (DLS) ( Figura 2C ). SUVs são os mais adequados para formar SLBs 34 .
  8. Cubra o tubo cônico com papel alumínio e guarde-o a 4 ° C até estar pronto para usar.

4. Montagem do dispositivo microfluídico

  1. Teste as entradas e saídas do bloco PDMS para bloquear, esguichando água desionizada através dos buracos usando uma garrafa de lavagem de água. Em seguida, secar o bloco PDMS com gás nitrogênio.
    NOTA: Esta etapa também irá remover quaisquer partículas de poeira que possam ter sido presas dentro e / ou entre canais. Se necessário, lamínulas pré-limpas com esgotos com gás nitrogênio para remover partículas de poeira.
  2. Coloque o bloco PDMS e o pré-limpadoLâmina de cobre (ver seção 1) dentro da câmara de amostra do sistema de plasma de oxigênio (ver tabela de materiais) para expor com plasma de oxigênio por 45 s com ajuste de energia a 75 Watts, velocidade de fluxo de oxigênio a 10 cm 3 / min e força de vácuo a 200 mTorr .
  3. Coloque a superfície padronizada do bloco PDMS em contato com o lamínula imediatamente após o tratamento com plasma de oxigênio. Pressione suavemente para remover as bolhas de ar em locais de contato.
  4. Coloque o dispositivo em uma placa quente nivelada a 100 ° C durante 3 min para aumentar a ligação.
  5. Use um toalhete sem molho ( p . Ex. Kimwipe) com 100% de etanol para remover partículas de poeira da parte superior (PDMS) e do fundo (vidro) do dispositivo. Em seguida, gravar o dispositivo em cima de um slide de microscópio de vidro.
    NOTA: Não use uma quantidade excessiva de etanol e evite o etanol entrar nos canais de entrada e saída. Realizar esse passo enquanto o dispositivo ainda está quente é recomendado para garantir que o etanol se evapore imediatamente. Micr. De vidroOs slides de oscopia podem ser armazenados em solução de etanol a 100% para remover poeira e outros contaminantes.

5. Formando bolhas lipídicas suportadas (SLBs)

  1. Transferir 100 mL de PI (4,5) P 2 SUVs molecular contendo a partir do passo 3.8 para um tubo de microcentrífuga de 0,65 mL. Ajuste o pH da solução para ~ 3,2, adicionando 6,4 μL de ácido clorídrico 0,2 N.
    NOTA: Confirme o pH da solução com um medidor de pH equipado com uma sonda de pH micro (ver tabela de materiais).
  2. Pipetar 10 μL da solução de SUV ajustada em pH em cada canal através da entrada e aplicar pressão através da pipeta até a solução chegar à saída. Retire a ponta da pipeta e deixe-a em anexo ao dispositivo.
  3. Repita o passo acima para cada canal e, em seguida, incubar o dispositivo durante 10 minutos à RT.
    NOTA: A injeção de vesículas em microcanais deve ser realizada imediatamente após a montagem do dispositivo.
  4. Corte conjuntos de tubos de entrada e saídaCh 60 cm (tubo de entrada) e 8 cm (tubo de saída) longos, respectivamente.
    NOTA: Cortando a tubagem na diagonal e criando uma borda afiada, facilita a inserção da tubulação nas entradas e nas saídas. O tubo de saída deve ter uma forma de arco. O comprimento da tubulação de entrada pode variar de acordo com a configuração do microscópio. O diâmetro interno da tubulação é de 0,05 cm.
  5. Usando pinças, conecte o conjunto de tubos de saída ao dispositivo e, em seguida, fita o dispositivo em uma etapa de microscópio.
  6. Submergir uma extremidade da tubulação de entrada em 25 mL de tampão corrente contida em um tubo cônico e gravá-la para garantir que a tubulação esteja segura.
  7. Coloque o tubo cônico em um terreno mais alto (~ 20 cm) do que o dispositivo para empurrar a solução através dos microcanais via fluxo de gravidade; Um gatilho de laboratório pode ser usado para conseguir isso.
  8. Para cada tubo de entrada, use uma seringa para desenhar 1 mL de tampão corrente a partir da extremidade livre da tubulação. Remova a ponta da pipeta da entrada e insira aExtremidade livre da tubulação de entrada no dispositivo.
    NOTA: Introduza uma queda do buffer de corrida na entrada para reduzir a probabilidade de uma bolha de ar ser introduzida no canal durante esta etapa. Depois que a tubulação de entrada estiver conectada ao dispositivo, use uma limpeza sem fiapos para remover o excesso de amortecedor.
  9. Repita o passo acima para conectar todas as peças da tubulação de entrada ao dispositivo.
    NOTA: O fluxo contínuo através dos canais ajuda a remover o excesso de vesículas e equilibrar a bicamada às condições experimentais.
  10. Abra o software de controle do microscópio (veja a tabela de materiais). No painel esquerdo, clique na guia "Microscópio" e escolha o objetivo "10X".
  11. Clique nos ícones de imagem "Live" e "Alexa 568" na barra de ferramentas. Usando os botões de ajuste fino e de curso, concentre-se nos microcanais.
  12. Analise o dispositivo para verificar a qualidade dos SLBs e dos canais ( Figura 8 ). Então,Clique no ícone de imagem "FL Shutter Closed" na barra de ferramentas.
  13. Clique na guia "Aquisição" e, em "Ajustes básicos", selecione "Tempo de exposição". Defina o tempo de exposição para "200 ms".
  14. No painel esquerdo, clique em "Aquisição multidimensional" e, no menu de filtros, selecione o canal vermelho (marcado como "Alexa 568"). Em seguida, clique no menu "lapso de tempo", defina o intervalo de tempo para 5 min, duração até 30 min, e clique em "Iniciar".
    NOTA: Com base na duração (30 min) e na taxa de fluxo (~ 1,0 μL / min), 30 μL de buffer de corrida são utilizados para equilibrar o SLB dentro de um canal, ou seja , são utilizados 240 μL de buffer de operação para todos os 8 canais.
  15. Selecione a ferramenta "Círculo" na guia "Medir" e desenhe um círculo em qualquer canal. Clique com o botão direito enquanto o círculo é selecionado e escolha "Propriedades". Na guia "Perfil", marque "todo o T" para ver oIntensidade de fluorescência em função do tempo.
    1. Certifique-se de que esta curva alcance um planalto, o que indica equilíbrio, antes de prosseguir para o próximo passo.
  16. Abaixe a solução tampão em um solo ponto como o dispositivo para parar o fluxo.
  17. Salve o arquivo de lapso de tempo.

6. Teste de PLC-δ1 interacção com o domínio PH de PI (4,5) P 2 SLBS molecular contendo

  1. Prepare diluições do domínio PH utilizando o tampão corrente como diluente.
    NOTA: Uma vez que existem oito canais dentro do dispositivo, use pelo menos dois deles para controles em branco. Escolha as extremidades distantes de cada lado e use os canais restantes para diluições de proteínas. As seguintes concentrações de domínio de PH foram testadas: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 e 2,50 μM. Aproximadamente 200 μL de cada diluição foi suficiente para alcançar o equilíbrio dentro de 30 min.
  2. Um de cada vez, separe cada tubo de saída e aplique 200 μL de cada diluição de proteína emO canal de saída usando uma pipeta. Não aplique qualquer pressão, deixe a gravidade fazer o trabalho. Retire a ponta da pipeta e deixe-a em anexo ao dispositivo microfluídico.
  3. Repita o passo acima para cada canal e certifique-se de que as bolhas de ar não sejam introduzidas nos canais durante este processo.
  4. Abaixe o tubo de entrada para um solo abaixo do dispositivo microfluídico para começar a fluir a proteína através dos microcanais. Fixe a extremidade livre da tubulação para um recipiente de lixo. Flute as diluições de proteínas durante 30 min.
    NOTA: Isso irá reverter o fluxo e permitir que a proteína seja introduzida nos canais. O tempo de equilíbrio e o volume das diluições de proteínas necessárias dependerão da afinidade da interação.
  5. No painel esquerdo do software, no separador "Time Lapse", clique em "Iniciar" para iniciar a imagem novamente.
  6. Repita o passo 5.15 para garantir que o equilíbrio seja alcançado. Quando a experiência estiver completa, salve o lapso de tempoArquivo.

7. Avaliação da Fluidez da Membrana

NOTA: Os experimentos de recuperação de fluorescência após Photobleaching (FRAP) devem ser realizados com cada novo lote de SUVs e lamínulas de vidro limpo para garantir que os SLBs sejam fluidos.

  1. Siga o procedimento para a limpeza de lamínulas de vidro (1.1-1.6), fabricação de blocos de PDMS micropatternados (2.1-2.5), preparando SUVs (3.1-3.8), montando o dispositivo microfluídico (4.1-4.5) e formando SLBs (5.1-5.17) como anteriormente Descrito.
  2. Focalize o microscópio na bicamada, ajuste o tempo de exposição para 200 ms e o binning para 1.
  3. Photo-bleach um ponto circular usando um raio laser de 532 nm, 2 mW (raio de 13 μM). Imediatamente após o fotobleaching, comece a capturar uma série de imagens a cada 3 s para as primeiras 45 s, seguido de um intervalo de 30 s pelo restante do tempo (15 min de duração total). Uma vez concluída a aquisição de dados, salve o arquivo de lapso de tempo.
  4. Selecione o branqueado aRea usando a ferramenta de desenho de círculo para extrair valores de intensidade de fluorescência em função do tempo. Além disso, selecione mais duas áreas próximas, uma correspondente a uma região não branqueada e uma correspondente a uma região sem SLBs.
  5. Calcule a recuperação de fluorescência ( y ) usando a seguinte equação:
    figure-protocol-1
    NOTA: Aqui F t representa a intensidade da região branqueada como função do tempo, F i representa a intensidade de fluorescência antes do branqueamento (use "1" como um valor normalizado neste caso); F 0 é a intensidade do fundo.
  6. Trace a recuperação de fluorescência (eixo dos e-e) em função do tempo (eixo dos x) para gerar uma curva de FRAP. Em seguida, ajuste os dados a uma única função exponencial da seguinte maneira,
    figure-protocol-2
    NOTA: Aqui A representa a fração móvel e k é a constante cinética para a fração móvel, que é usada para calcular a meia hora de recuperação ( t 1/2 ):
    figure-protocol-3
  7. Use o t 1/2 para calcular a constante de difusão ( D ):
    figure-protocol-4
    NOTA: Aqui R representa o raio do raio laser (13 μm). A constante de difusão para uma bicamada fluida deve ser ≥1,0 ​​μm 2 / s.

8. Processando dados

NOTA: A rotina da análise de dados dependerá do microscópio, do software de processamento de imagem e do software de ajuste de curva que esteja sendo usado.

  1. Abra os arquivos de lapso de tempo de antes (a partir do passo 5.17) e depois (a partir da etapa 6.6) titulando o domínio PH. Vá para o último quadro de cada arquivo de lapso de tempo e faça uma varredura de linha em todos os microcanais para obter o fluorescDados de intensidade de intensidade em função da distância em pixels ( Figura 6A ). Transfira os dados para um software de planilha.
  2. Para cada microcanal (antes e depois da adição do domínio PH), amostra alguns dados dentro do canal e ambos os lados do canal que representam a linha de base ( Figura 7A ).
    NOTA: A intensidade de fluorescência do canal em branco deve ter permanecido inalterada. Todos os outros canais são normalizados para o canal em branco, por isso é crucial ter dois canais em branco e garantir que suas intensidades de fluorescência permaneçam consistentes umas com as outras.
  3. Aplique a fórmula abaixo para normalizar os dados para o canal em branco; Um cálculo de amostra é fornecido na Figura 7B .
    figure-protocol-5
    NOTA: Aqui a proteína ΔF representa a intensidade de fluorescência subtraída de fundo do canal de proteína, Δ; F em branco representa a intensidade de fluorescência subtraída de fundo do canal em branco, pré e posterior referem-se a etapas de titulação de proteínas anteriores e posteriores, e α representa o fator de correção que é a proporção das intensidades de fluorescência do canal de proteína e do canal em branco ([ F proteína / F em branco ] pré ) em um passo de titulação pré-proteína. Uma vez que a intensidade de fluorescência diminui em função da concentração do domínio PH, os dados normalizados serão negativos.
  4. Usando um software de ajuste de curva (veja Tabela de Materiais ), trace a fluorescência normalizada como uma função da concentração do domínio PH e se encaixa em uma isoterma de Langmuir ( Figura 6C ):
    figure-protocol-6
    NOTA: Aqui ΔF representa a mudança na intensidade de fluorescência em relação à mudança máxima em fluoIntensidade de incisão quando está presente uma concentração de saturação de proteína ( ΔF max ), enquanto que o aplicativo K d representa a constante de dissociação aparente, que é igual à concentração de proteína em massa ( [PLC-δ1 PH] ), na qual 50% de cobertura ( Complexo ligado à membrana). Esta é uma medida de ligação baseada em equilíbrio para que os dados normalizados sejam adequados a uma isoterma de Langmuir simples para extrair um parâmetro experimental aparente K d, app . Com base no software de montagem , o aplicativo K d, aplicativo para PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 é de 0,39 ± 0,05 μM ( Figura 6B ).

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Resultados

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Utilizou-se o ensaio de modulação pH para estudar o PLC-δ1 PH domínio de PI (4,5) P 2 interacção dentro de um microdispositivo de PIP-on-a-chip (Figura 1). Através de um protocolo detalhado, demonstramos como preparar e montar componentes de dispositivos microfluídicos, fazer pequenas vesículas unilamelares (SUVs) ( Figura 2 ), formar SLBs dentro de um dispositivo ( Figura 3 ) e testar a ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cada variante PIP, embora com baixas concentrações, está presente na superfície citosólica de organelas específicas, onde contribuem para o estabelecimento de uma composição física única e especificidade funcional da membrana organelar 1 . Um dos usos mais importantes dos PIPs é como uma plataforma de encaixe específica para a multiplicidade de proteínas que requerem localização e / ou ativação subcelular específica 6 , 7 . Devido ao seu ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DS e CEC foram apoiados, em parte, pela concessão AI053531 (NIAID, NIH); SS e PSC foram apoiados pela concessão N00014-14-1-0792 (ONR).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Coverslip
Glass Coverwashs: RetângulosFisher Scientific12-544B22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Solução de Limpeza de Vidro Borosilicato
7XMP Biomedicals976670Detergente
PYREX Prato de Cristalização Corning3140-190Prato de vidro borossilicato com fundo plano; Diâmetro x Altura (190 x 100 mm); Distribuidor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0Paragon IndustriesSC-2Forno
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PDMS
Sylgard 184 Kit de elastómero de siliconeDow Corning4019862Polidimetilsiloxano (PDMS); Distribuidor: Ellsworth Adhesives
PYREX DessecadorVWR89134-402Punção de biópsia com classificação de vácuo
Harris15110-10Harris Uni-Core; 1,0 mm de diâmetro; Punção de Biópsia Miltex com Êmbolo (Cat. No. 15110-10) pode ser usado como uma alternativa
NomeEmpresaNúmero de catálogo<strong>Comentários
Device
Plasma Sistema de limpezaPlasmaEtchPE25-JWBomba de vácuo de óleo de acionamento direto de 2 estágios, Serviço O2 (Krytox Charged)
Digital Hot PlateBenchmarkH3760-HAdquirido através da Denville Scientific (Cat. N.º 1005640)
Microcorrediças foscasVWR48312-003Fosco, selecionado e pré-limpo; Feito de vidro suíço; Espessura: 1 mm; Dimensões: 75 x 25 mm; GR 144
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Mold
AutoCADAutodeskv.2016Software de desenho para o design de
photomaskPhotomask CAD/Art ServicesN/AO design com fundo preto e características claras foi impresso em resolução de 20k dpi em uma máscara transparente (5 x 7 pol) pela CAD/Art Services
Wafers de SiliconeUniversity Wafer1575Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 polegadas) de diâmetro; 525 um de espessura
SU-8 50MicroChem Corp.N/AFotorresistente de tom negativo; Propriedade da instalação de nanofabricação do estado da Pensilvânia
SU-8 DesenvolvedorMicroChem Corp.N / APenn State Nanofabrication Facility Propriedade
Nome< / strong>Empresa< / strong>Número de catálogo< / strong>Comentários< / strong>
SUV< / strong >
1-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolinaAvanti Polar Lipids850457CPOPC
L-&alfa;-fosfatidilinositol-4-fosfatoAvanti Polar Lipids840045XPI4P
L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bifosfatoAvanti Polar Lipids840046XPI(4,5)P2
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminaAvanti Polar Lipids850757CPOPE; Necessário para a síntese de oSRB-POPE
Lissamina Rodamina B Cloreto de Sulfonila (isômeros mistos)ThermoFisher ScientificL-20Necessário para a síntese de sonda lipídica fluorescente sensível ao pH oSRB-POPE
(oSRB-POPE)internaN/A(Huang D. et al. 2013)
Frasco de cintilação de vidroVWR66022-065Capacidade de volume de 20 mL
Aquasonic 250DMembranasultrassônicas
nucleporo de banho-mariaMembranaWhatman 110605; Diâmetro: 25 mm; Tamanho dos poros: 0,1 um; Distribuidor: Sigma-Aldrich
ClorofórmioVWRCX1054-6
Extrusora LIPEX de grau HPLCTransferra NanosciencesT.001LIPEX 10 mL Extrusora Thermobarrel
Viscotek 802 DLSMalvern InstrumentsN/AEspalhamento de Luz Dinâmico; Propriedade da Instalação de Cristalografia de Raios-X da Penn State
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Análise de dados
GraphPad PrismGraphPad Softwarev.6Software de ajuste de curvas para análise de dados
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
Microscópio
Axiovert 200M Microscópio de EpifluorescênciaCarl Zeiss Microscopia N/A
AxioCam MRm CâmeraCarl Zeiss MicroscopiaCâmera N/A
X-Cite 120Excelitas TechnologiesN/AFonte de Luz
Alexa 568 Conjunto de FiltrosCarl Zeiss Microscopia N/AEx/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 SoftwareCarl Zeiss Microscopia/ASoftware de Processamento de Imagem
NomeEmpresa Número de catálogoComentários
Outros
200 uL; Ponta fina e lisa para aplicar a solução proteica no canal microfluídico
PontasVWR53509-07010 uL ponteiras de pipeta; Ponta fina e lisa para aplicar a solução de vesícula no canal microfluídico
Medidor de pH Orion Star A321depHThermo Scientific
Micro sonda de pH Orion Micro sonda de pHThermo Scientific8220BNWPmicro Sonda
de pH N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-(ácido 2-etanossulfónico)VWRVWRB30487HEPES,
cloreto de sódioVWRBDH8014-2.5KGRNaCl
TubulaçãoAllied Wire & CaboTFT-200-24 NDiâmetro interno: 0,020-0,026 polegadas (0,051-0,066 cm); Espessura da parede: 0,010 polegadas (0,025 cm); Tubulação flexível de parede fina de politetrafluoretileno; Gás nitrogênio de cor natural
- IndustrialPraxairN/AFornecedor local
Gás oxigênio -Industrial PraxairN/AFornecedor local Nitrogênio
líquidoPraxairN/AFornecedor local
Síntese interna de VWR N/A de policarbonato NPontas VWR 10034-132 Ponteiras de pipeta de Medidor STARA3210 de ácido livre

Referências

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