Artigo de método

Análise do Gap Junction-dependente Transferência de miARN com 3D-FRAP Microscopia

DOI:

10.3791/55870

⸱

19 de junho de 2017

 ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), 2Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 3Department of Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, University of Rostock

Neste artigo

Resumo

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Aqui, descrevemos a aplicação da recuperação de fluorescência tridimensional após o fotobleaching (3D-FRAP) para a análise do deslocamento dependente da junção de miARN. Em contraste com os métodos comumente aplicados, o 3D-FRAP permite a quantificação da transferência intercelular de pequenos RNAs em tempo real, com alta resolução espaço-temporal.

Resumo

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Os pequenos ARNs antisentidos, como o miARN e o siRNA, desempenham um papel importante na fisiologia celular e na patologia e, além disso, podem ser utilizados como agentes terapêuticos no tratamento de diversas doenças. O desenvolvimento de novas estratégias inovadoras para a terapia com miARN / siRNA é baseado em um amplo conhecimento dos mecanismos subjacentes. Dados recentes sugerem que os pequenos RNAs são trocados entre as células de uma maneira dependente da junção de lacunas, induzindo os efeitos reguladores de genes na célula receptora. Técnicas biológicas moleculares e análise citométrica de fluxo são comumente usadas para estudar a troca intercelular de miARN. No entanto, esses métodos não fornecem alta resolução temporal, o que é necessário ao estudar o fluxo juncional de gap das moléculas. Portanto, para investigar o impacto do miARN / siRNA como moléculas de sinalização intercelular, são necessárias novas ferramentas que permitirão a análise desses pequenos RNAs no nível celular. O presente protocolo descreve o apPlicação da recuperação de fluorescência tridimensional após microscopia de fotoblanqueamento (3D-FRAP) para elucidar a troca de moléculas de miARN entre as células cardíacas dependentes da junção gap. É importante ressaltar que esta abordagem direta e não invasiva de imagens de células vivas permite a visualização e quantificação do deslocamento de junção de RNA pequenos com marcação fluorescente em tempo real, com alta resolução espaço-temporal. Os dados obtidos por 3D-FRAP confirmam uma nova via de regulação de genes intercelulares, onde os pequenos RNAs atuam como moléculas de sinalização dentro da rede intercelular.

Introdução

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Os pequenos RNAs não codificados são jogadores importantes na regulação de genes celulares. Estas moléculas são compostas por 20-25 nucleótidos que se ligam a um mRNA alvo específico, levando ao bloqueio da tradução ou à degradação mRNA 1 , 2 . O processo de regulação de genes realizado por pequenos RNAs, como o miARN e siRNA, é um mecanismo altamente conservado que foi encontrado em muitas espécies diferentes 3 . Em particular, as moléculas de miARN são de importância crucial para uma variedade de processos fisiológicos, incluindo proliferação, diferenciação e regeneração 4 , 5 . Além disso, a desregulação da expressão de miARN é atribuída a muitas doenças patológicas. Correspondentemente, os miRNAs demonstraram ser adequados como biomarcadores para o diagnóstico e como agentes terapêuticos para terapia genética 6 , 7 .

As junções de abertura (GJs) são estruturas de proteínas especializadas na membrana plasmática de duas células adjacentes que permitem a troca difusional de moléculas com um peso molecular de até 1 kD. Eles mostraram ser importantes para o desenvolvimento de tecidos, diferenciação, morte celular e distúrbios patológicos, como câncer ou doença cardiovascular 8 , 9 , 10 . Várias moléculas foram descritas como capazes de atravessar canais GJ, incluindo íons, metabólitos e nucleotídeos. Curiosamente, GJs também foram encontrados para fornecer um caminho para o movimento intercelular de pequenos RNAs 11 , 12 . Assim, os miRNAs podem atuar não apenas dentro da célula em que são produzidos, mas também dentro das células receptoras. Isso destaca o papel dos miRNAs no sistema de transdução de sinal intercelular. Ao mesmo tempo, os dados demonstramEssa comunicação intercelular juncional gap está intimamente ligada à função miRNA. Devido ao impacto significativo do miARN e do GJ na homeostase, na patologia e no diagnóstico de tecido, uma compreensão abrangente da função dos GJ e da dinâmica intercelular relacionada do miARN ajudará a esclarecer os mecanismos das doenças baseadas em miARN e a desenvolver novas estratégias para Terapias de miRNA.

Dependendo da extensão do acoplamento juncional gap, a transferência de moléculas de miARN entre as células pode ser um processo muito rápido. Portanto, é necessária uma metodologia que permita a visualização e quantificação do movimento intercelular rápido dessas moléculas de sinalização regulatória. Comumente, as técnicas de citometria de fluxo e biologia molecular foram aplicadas para demonstrar o transporte de pequenos RNAs 11 , 12 , 13 , 14 . No entanto, ao contrário dos micros FRAPCopiar, essas abordagens não possuem alta resolução temporal, o que é obrigatório ao analisar a troca de miRNA via GJs. Além disso, o microscópio FRAP é menos invasivo e, portanto, representa uma poderosa e nova técnica de imagem de células vivas para avaliar a troca dependente de GJ de moléculas em vários tipos de células 15 , 16 , 17 .

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado descrevendo a aplicação de 3D-FRAP para avaliar a transferência de miARN entre cardiomiócitos. Para este fim, os cardiomiócitos foram transfectados com miARN marcado fluorescentemente. Uma célula marcada com este miRNA foi fotobleached, e o reentensign de miARN juncional de junção de células adjacentes foi registrado de maneira dependente do tempo. A alta resolução temporal de experiências FRAP oferece a possibilidade de realizar estudos cinéticos para a avaliação precisa da transferência intercelular de miARN e siARN entre células vivas. MoreoComo os pequenos RNAs podem ser trocados através de mecanismos diferentes com cinética altamente diferente, o microscópio FRAP pode ajudar a esclarecer até que ponto os GJs estão envolvidos nos respectivos processos de shuttling 18 . Além disso, 3D-FRAP pode ser usado para investigar alterações fisiológicas e patológicas na permeabilidade GJ e seu impacto na transferência de RNA pequena 15 , 19 .

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Protocolo

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Todas as etapas neste protocolo envolvendo ratos neonatais foram realizadas de acordo com as diretrizes éticas para o cuidado de animais do Centro Médico da Universidade Rostock.

1. Preparação de pratos de cultura de células e do meio para cultura de cardiomiócitos

  1. Revestir uma placa de cultura de células com 0,1% de gelatina em PBS e incubar a 37 ° C durante 4 h ou a 4 ° C durante a noite. Remova a gelatina e deixe secar sob fluxo de ar laminar esterilizado.
  2. Prepare o meio de cultura celular composto por 50 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). Pré-aquecer até 37 ° C.

2. Isolamento de cardiomiócitos neonatais

  1. Sacrifique ratos neonatais (1-2 dias de idade) por decapitação com tesoura esterilizada e abra o tórax ao longo do esterno. Remova o coração usando fórceps enquanto pressiona ligeiramente o tórax em conjunto e transfira o coração para uma placa de 24 poços contendo HBSS gelado(Sem Ca 2 + e Mg 2+ ).
  2. Remova o tecido não cardíaco e vasos maiores usando pinça estéril. Transferir corações limpos para um tubo de 1,5 mL contendo HBSS gelado. Use um máximo de 5 corações por tubo para digestão enzimática.
  3. Corte os corações com pequenas tesouras em <0,5 a 1 mm³ de peças.
  4. Lave os corações picados com HBSS duas vezes por aspiração / adição de HBSS usando uma pipeta de 1 ml de microlitros. Remova o HBSS completamente antes de adicionar as enzimas.
  5. Para a digestão enzimática de corações neonatais, use um kit comercialmente disponível e siga o protocolo do fabricante (veja a Tabela de Materiais ). Agite o tubo contendo os corações picados cada 5 min enquanto incuba com enzimas a 37 ° C durante 35 min.
  6. Células suspensas de sementes em pratos de cultura celular não revestidos contendo meio de cultura celular durante 1,5-2 h para permitir a aderência da fração não cardiomicítica. Repita este passo se uma alta purezaDos cardiomiócitos é necessária. Se desejado, aprofundar a fração não cardiomiócita.
    NOTA: Para uma suspensão celular de 15 corações, o passo de pré-revestimento pode ser realizado em frascos de cultura de células de 75 cm2. Normalmente, 5 x 10 5 células são obtidas de um coração neonatal.
  7. Recolher o sobrenadante em um tubo cônico de 15 mL e centrifugar durante 10 min a 300 x g. Ressuspender as células em 1 mL de meio de cultura de células.
  8. Contar as células com um hemocitômetro da câmara de Neubauer, ou usar um método equivalente.
  9. Cardiomiócitos isolados em placa em placas de 6 poços com uma densidade de 3 x 10 5 células / cm². Incubar as células durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2 .
    NOTA: Opcionalmente, as células também podem ser transfectadas neste ponto. No entanto, a viabilidade aumentada foi observada quando as células foram cultivadas durante um dia antes de serem submetidas à eletroporação.

3. Transfecção com miARN com etiqueta fluorescente

  1. Pré-Meio de cultura de células quentes (ver passo 1.2) a 37 ° C num banho de água ou num dispositivo equivalente.
  2. Prepare uma solução de reserva de 20 μM de miARN fluorescente em água estéril isenta de RNase.
  3. Prepare um tampão de eletroporação contendo Na2HPO4 90 mM, NaH2PO4 90 mM, KCl 5 mM, MgCl2 10 mM e succinato de sódio 10 mM e ajuste o pH para 7,2; O buffer de eletroporação pode ser armazenado a -20 ° C por vários meses.
  4. Descarte as células do prato de cultura usando 0,05% de tripsina por 5 min. Inactive a tripsina pela adição de meio de cultura de células.
  5. Contar as células com um hemocitômetro da câmara de Neubauer, ou usar um método equivalente. Centrifugar as células a 300 xg por 10 min.
  6. Ressuspender as células no tampão de eletroporação para obter uma concentração de 4 x 10 5 células por 100 μL.
  7. Misture 100 μL de suspensão celular com miARN fluorescente (concentração final: 0,25 μM) em um tubo eColoque a mistura em uma cuvete de eletroporação.
    1. Determinar empiricamente a quantidade apropriada de miARN, dependendo do tipo de célula.
  8. Execute eletroporação usando um dispositivo de eletroporação (veja a Tabela de Materiais ), usando o programa "G-009".
  9. Adicione 500 μL de meio de cultura de células pré-aquecido e transfira a suspensão de células inteiras (4 x 10 5 células) para dentro de um poço de um escorredor de câmara de fundo de vidro de 4 poços. Cultive as células durante 1 dia a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5%.
    NOTA: Para análise de FRAP, uma densidade celular de ~ 80% é otimizada. A transfecção de miARN marcado deve ser realizada exclusivamente por eletroporação. Uma vez que a distribuição homogênea de moléculas de miARN marcadas é benéfica para a medição de FRAP, a transfecção baseada em reagente não é recomendada.

4. Aplicando o Microscópio 3D-FRAP (Dia 3)

  1. Aquecer a incubadora do microscópio até 37 °; C e ligar o sistema de microscópio confocal pelo menos 2 h antes da medição de FRAP para estabelecer um equilíbrio térmico e diminuir a possibilidade de deriva. Se possível, mantenha uma atmosfera de CO2 de 5%.
  2. Insira a câmara no porta-amostras do palco.
  3. Encontre um conjunto de cardiomiócitos transfectados usando um objetivo de óleo de 1,4 NA (aumento de 400 x) e luz de excitação laser de 561 nm com baixa potência de laser, com uma faixa de detecção de 570-680 nm.
    NOTA: A definição das configurações do FRAP, a aquisição da imagem e a análise foram feitas usando o software específico do microscópio (veja a Tabela de Materiais ).
  4. Ative os botões "z-Stack", "Time Series", "Blanqueamento" e "Regiões" no "Gerenciador de Configuração".
  5. Defina os parâmetros FRAP.
    1. Defina as configurações de aquisição de imagem no menu "Modo de Compra", definindo o "tamanho do quadro"4; Para 512 x 512, o "passo da linha" para 1, e o "tempo de digitalização" para <1 s.
    2. No menu "Canais", ajuste as configurações de potência, deslocamento e gancho do laser para obter a máxima fluorescência da excitação mínima do laser ( por exemplo, potência do laser: 1-5%); Ajuste para evitar saturação de intensidade. Defina o "tamanho do pinhole" para 2 μm.
    3. Em seguida, no menu "Regiões", selecione a "ferramenta de desenho ROI" e use o cursor para marcar a célula alvo, a célula de referência e a área de fundo. Se necessário, selecione várias células alvo para fotoblanquear.
    4. Ajuste as configurações de fotobloco no menu "Branqueamento" ( por exemplo, iterações: 9-14, potência do laser para fotoblanqueamento: 100%, intervalo de aquisição de imagem: 60 s, ciclos: 15). Defina o início do branqueamento após 3 exames iniciais.
    5. No menu "z-Stack", defina os limites para a aquisição da pilha z, dependendo da espessura das células. Ajuste o "número oF z-layers "para 12-15.
    6. Comece o experimento FRAP e registre a recuperação de fluorescência.
      NOTA: Uma vez que as configurações de um experimento FRAP dependem do tipo de célula, do corante fluorescente e do sistema de microscópio, é melhor realizar experiências piloto para determinar os parâmetros ótimos para FRAP. O branqueamento deve ser suficiente para reduzir a intensidade de fluorescência inicial em pelo menos 50%. Normalmente, a recuperação de fluorescência deve ser registrada a cada 30-60 s até atingir a fase do platô.

5. Análise de dados

  1. Crie projeções máximas das pilhas z adquiridas e obtenha valores de intensidade de fluorescência das células alvo branqueadas, a célula de referência e o plano de fundo. Usando o software específico do microscópio, clique em "Processar" → "Projeção de intensidade máxima" → selecione o arquivo → "Aplicar".
    1. Alternativamente, use uma ferramenta equivalente de análise de imagem ( eg, ImageJ).
  2. Copie os dados de intensidade de fluorescência em todos os pontos de tempo da célula alvo, o plano de fundo e a célula de referência em uma planilha.
    1. Subtrair a intensidade de fundo e a intensidade da célula de referência dos valores de intensidade da célula alvo para corrigir o fotobloco causado durante o processo de aquisição. Execute as correcções de células de fundo e referência para cada ponto de tempo.
    2. Normalize os dados de FRAP corrigidos para a intensidade de fluorescência inicial antes do branqueamento, dividindo cada valor pela fluorescência inicial.
    3. Para obter as curvas FRAP, defina a linha de base para a intensidade de fluorescência imediatamente após o branqueador, subtraindo-se dos valores de intensidade de cada ponto do tempo.

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Resultados

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Aqui, apresentamos a microscopia 3D-FRAP como uma técnica não-invasiva para estudar o deslocamento juncional do miARN fluorescente nos cardiomiócitos neonatais. Os cardiomiócitos isolados revelaram o típico padrão de α-aletina estriada e continham grandes placas de Cx43 ao longo das bordas das células celulares ( Figura 1A , pontas de flecha brancas), o que permitiu o alto fluxo intercelular de moléculas. A pureza dos cardiomiócitos isolados foi avaliada pel...

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Discussão

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Os miRNAs são atores-chave na fisiologia celular e demonstraram que atuam como moléculas de sinalização usando-entre outros - GJs como um caminho para a troca intercelular 11 , 12 , 22 . O protocolo atual apresenta uma técnica de imagem de células vivas in vitro para caracterizar esta rodovia dependente de GJ usando miARNs fluorescentes dentro dos clusters celulares.

O protocolo foi d...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo Ministério Federal da Educação e Pesquisa da Alemanha (FKZ 0312138A e FKZ 316159), o Estado Mecklemburgo-Pomerânia Ocidental com Fundos Estruturais da UE (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 e ESF / IVBM-B35-0010 / 12), o DFG (DA1296-1) e a Fundação Alemã do Coração (F / 01/12). Além disso, o RD é suportado pelo Programa FORUN do Centro Médico da Universidade Rostock (889001), a Fundação DAMP e o BMBF (VIP + 00240).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
camundongos NMRI neonataisCharles River
GelatinSigma AldrichG70410,1% solução em PBS, PBS esterilizado
Pan BiotechP04-53500
Dulbecco&agudo; s meio modificadoPan BiotechP04-03550
Penicilina/EstreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122100 U/mL, 100µ g/mL
Soro bovino fetalPan BiotechP30-3306
Plástico de cultura celularTPP
Kit de isolamento de cardiomiócitos primáriosThermo Fisher Scientific88281
HBSSThermo Fisher Scientific88281incluído no kit de isolamento de cardiomiócitos primários
Azul de tripanoThermo Fisher Scientific15250061
microRNA marcado com miRIDIAN Dy547 MimicDharmaconCP-004500-01-05dissolve em água livre de RNAse, solução estoque 20µ M
Fosfato de sódio monobásicoSigmaS3139
Fosfato de sódio dibásicoCarl RothT877.2
Cloreto de potássioSigmaP9333
Cloreto de magnésioServa28305.01
Succinato de sódioCarl Roth3195.1
Solução de tripsina / EDTA a 0,05%MerckL2153
4-well- Lâminas de câmara de fundo de vidroIBIDI80827revestidas com solução de gelatina a 0,1%
Amaxa Nucleofector IIO programa Lonza G-009 foi usado para eletroporação 
LSM 780 ELYRA PS.1 sistemaZeiss
Excel softwareMicrosoft
α-actinina anticorpoAbcamab9465diluição 1:200
Connexin43 anticorpoSanta Cruzsc-9059diluição 1:200
cabra anti-camundongo Alexa 594 anticorpoThermo Fisher ScientificA-11005diluição 1:300
anticorpo anti-coelho de cabra Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11034diluição 1:300
Conexina43 siRNAThermo Fisher ScientificAM16708 ID158724concentração final 250 nM
Near-IR Kit de coloração de células vivas/mortasThermo Fisher ScientificL10119
CellTrace Calcein Red-OrangeThermo ScientificC34851
DAPI coloração nuclearThermo ScientificD1306

Referências

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