Imunossinção Quadruple da Lâmpada Olfativa para Visualização de Códigos de Identidade Molecular de Axon Sensorial Olfativo

Summary

Os neurônios sensoriais olfatórios expressam uma grande variedade de moléculas de classificação axônica para estabelecer circuitos neurais adequados. Este protocolo descreve um método de coloração imuno-histoquímica para visualizar expressões combinatórias de moléculas de ordenação axônica no terminal axônico de neurônios sensoriais olfativos.

Abstract

O sistema olfativo do mouse é freqüentemente usado para estudar mecanismos de formação de circuitos neurais devido à sua estrutura anatômica simples. Um Neurônio Sensorial Olfatório (OSN) é uma célula bipolar com um único dendrito e um único axônio não derivado. Um OSN expressa apenas um gene de receptor olfatório (OR), OSNs que expressam um determinado tipo de OR convergem seus axônios para alguns conjuntos de glomérulos invariantes no bulbo olfatório (OB). Uma característica notável da projeção de OSN é que as OU expressadas desempenham papéis instrutivos na projeção axonal. As ORs regulam a expressão de múltiplas moléculas de classificação axônica e geram o código molecular combinatório de moléculas de classificação de axônio no terminal axônico OSN. Assim, para entender os mecanismos moleculares dos mecanismos de orientação axônica OR específicos, é vital caracterizar seus perfis de expressão no terminal axônico OSN dentro do mesmo glomérulo. O objetivo deste artigo foi introduzir métodos para coletar tantos glomeruli como possiblE em uma única seção de OB e para realizar imunocoloração usando múltiplos anticorpos. Isso permitiria a comparação e análise dos padrões de expressão de moléculas de classificação de axônio sem variação de coloração entre seções de OB.

Introduction

Durante o desenvolvimento, os neurônios estão precisamente conectados uns aos outros para formar circuitos neurais adequados, o que é crítico para a função normal do cérebro. Uma vez que os circuitos neurais aberrantes no cérebro são pensados ​​para ser a causa de transtornos mentais, como autismo e esquizofrenia, a compreensão dos mecanismos de formação de circuitos neurais é um dos principais desafios no campo da neurociência.

No sistema olfativo do mouse, cada Neurônio Sensorial Olfativo (OSN) no Epitelio Olfatório (OE) expressa apenas um gene funcional do Receptor Olfativo (OR) e OSNs expressando o mesmo OR convergem seus axônios para....

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados com a aprovação do comitê de ética de experimento animal na Universidade de Tóquio e de acordo com as diretrizes da Universidade de Tóquio para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. Preparação de soluções

1. Preparar solução salina tamponada com fosfato 0,01 M (PBS): adicionar um comprimido de PBS (NaCl 0,14 M, KCl 0,0027 M, 0,010 M PO ₄ ^3- , pH 7,4) a 1 L de água destilada e agitar à TA até dissolver completamente.
2. Preparar 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS: adicionar 4 g de PFA a 100 mL de PBS. Mexa a solução a 60 ° C até disso....

Results

O mapa glomerular olfatório é formado por alvos globais iniciais e subseqüente segregação glomerular dos axônios ^{1 , 2} do OSN. A segregação glomerular é regulada pelas interações axônicas adesivas / repulsivas mediadas por moléculas de classificação de axônio cujos níveis de expressão são determinados por moléculas OR expressas ⁷ . As moléculas de classificação axônica envolvidas na segregação glomerular s.......

Discussion

A imunotinção quádrupla das seções de parasagittal OB possibilitou a visualização e quantificação dos níveis de expressão de até quatro moléculas de triagem de axônio simultaneamente em um maior número de glomérulos. Ao analisar esses dados multivariáveis ​​com PCA, as características para a expressão dessas moléculas podem ser especuladas.

Para a coloração bem sucedida, a preparação da amostra de tecido é extremamente importante. Alguns protocolos sugerem que os tecidos devem ser post-fixad.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Comprimidos de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH7.4	TAKARA BIO	T9181
Leite desnatado	nacalai tesque	31149-75
anticorpo anti-Sema7A de cabra	R & D Systems	AF2068
anticorpo anti-OLPC de rato	Merck Millipore	MABT20
anticorpo anti-VGLUT2 de camundongo	Merck Millipore	MAB5504
anticorpo anti-BIG-2 de cabra	R & D Systems	AF2205
anticorpo anti-Kirrel2 para porcos da Operon	Biotechnologies		Os anticorpos anti-Kirrel2 foram gerados pela imunização de porquinhos-da-índia com peptídeos sintéticos conjugados com KLH (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP
burro anti-rato Alexa Fluor 405	Abcam	ab175658
burro anti-cabra Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	705-545-003
burro anti-cobaia Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21432
burro anti-rato Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153
Paraformaldeído (PFA)	Wako	162-16065
MAS revestiu os vidros de lâmina	MATSUNAMI	MAS-01
fórceps	Fine Science Tools	11253-27
Vannas	Fine Science Tools	15000-00
Microscópio
fluorescente	KEYENCE	BZ-X700
Cubo de filtro DAPI	KEYENCE	OP-87762
Cubo de filtro GFP	KEYENCE	OP-87763
Cubo de filtro TRITC	KEYENCE	OP-87764
Cubo de filtro	Cy5 KEYENCE	OP-87766
papel de filtro	ADVANTEC	00011185
O.C.T composto	Sakura Finetek	M71484