Summary
Les neurones sensoriels olfactifs expriment une grande variété de molécules de tri d'axones pour établir des circuits neuronaux appropriés. Ce protocole décrit une méthode de coloration immunohistochimique pour visualiser les expressions combinatoires des molécules de tri d'axones aux extrémités axonaires des neurones sensoriels olfactifs.
Abstract
Le système olfactif de souris est souvent utilisé pour étudier les mécanismes de formation de circuits neuronaux en raison de sa structure anatomique simple. Un neurone sensoriel olfactif (OSN) est une cellule bipolaire avec un seul dendrite et un seul axone non ramifié. Un OSN n'exprime qu'un seul gène de récepteur olfactif (OR), les OSN exprimant un type donné d'OR convergent leurs axones à quelques ensembles de glomérules invariants dans l'ampoule olfactive (OB). Une caractéristique remarquable de la projection OSN est que les OR exprimés jouent des rôles instructifs dans la projection axonale. Les ORs régulent l'expression de multiples molécules de tri d'axones et génèrent le code moléculaire combinatoire des molécules de tri d'axones à la terminaison axonale OSN. Ainsi, pour comprendre les mécanismes moléculaires des mécanismes de guidage de l'axone spécifiques à l'OR, il est essentiel de caractériser leurs profils d'expression au terminus de l'axone OSN dans le même glomérule. Le but de cet article était d'introduire des méthodes pour collecter autant de glomérules que possibleE sur une seule section OB et pour effectuer l'immunocoloration en utilisant plusieurs anticorps. Cela permettrait la comparaison et l'analyse des modèles d'expression des molécules de tri d'axones sans variation de coloration entre les sections OB.
Introduction
Pendant le développement, les neurones sont précisément connectés les uns aux autres pour former des circuits neuronaux appropriés, ce qui est essentiel pour la fonction cérébrale normale. Étant donné que les circuits neuronaux aberrants dans le cerveau sont considérés comme la cause de troubles mentaux tels que l'autisme et la schizophrénie, la compréhension des mécanismes de la formation de circuits neuronaux est l'un des principaux défis dans le domaine des neurosciences.
Dans le système olfactif de souris, chaque neurone sensoriel olfactif (OSN) dans l'épithélium olfactif (OE) exprime un seul gène de récepteur olfactif fonctionnel et les OSN exprimant le même OR convergent leurs axones à une paire spécifique de glomérules à des emplacements stéréotypés dans le Ampoule Olfactive (OB) 1 , 2 . Le système olfactif de souris est un excellent système modèle pour étudier les mécanismes moléculaires de la formation de circuits neuronaux parce que les chercheurs peuvent utiliser l'expression OR pour identifier une s spécifiqueUbtype des OSN et visualiser les sites de projection des axones OSN comme des structures glomérulaires claires. Une caractéristique remarquable de la projection OSN est que les OR jouent des rôles instructifs dans la projection des axones OSN à l'OB 3 , 4 , 5 , 6 . Plus précisément, après que les axones OSN sont guidés pour approximer les régions cibles, ils sont séparés pour former un glomérule de manière dépendant de l'OR. Des études antérieures ont montré que les molécules OR contrôlent l'expression des molécules de tri d'axones, qui régulent la ségrégation glomérulaire 7 , 8 . De plus, des preuves accumulées suggèrent que les molécules OR génèrent le code d'identité neuronal par une combinaison unique de molécules de tri axonal 9 . Ainsi, pour comprendre le mécanisme de la ségrégation glomérulaire dépendante de l'OR, il est nécessaire de caractériser les profils d'expression du moût de l'axoneDans les OSN.
L'immunocoloration fluorescente est une méthode commune pour visualiser l'expression de gènes spécifiques. Étant donné que les protéines des molécules de tri d'axones sont principalement localisées dans les axones OSN, les chercheurs doivent utiliser des sections OB pour caractériser leurs modèles d'expression dans les OSN. La sectionnement coronaire de l'OB a été habituellement utilisée pour l'immunocoloration. Cependant, cette préparation perd l'information topographique le long de l'axe antérieur-postérieur dans la même section OB. Nous avons donc développé une préparation parasagitique du côté médian de l'OB, qui peut monter autant de glomérules environnants que possible sur la même section OB. Combinée avec l'immunocoloration à l'aide d'anticorps multiples, cette préparation permet de comparer et d'analyser les profils d'expression des molécules de tri d'axones sans variation de coloration entre les sections OB.
En outre, une méthode de coloration immunohistochimique a été présentée sans post-fixation avec PFA aNd traitement au saccharose. Cette méthode permet aux chercheurs d'obtenir suffisamment de données de coloration de haute qualité pour une analyse de données multivariables. Les protocoles présentés ici fourniront des détails sur les méthodes puissantes pour les chercheurs qui étudient la formation du circuit neuronal olfactif.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées avec l'approbation du comité d'éthique de l'expérimentation animale à l'Université de Tokyo et selon les directives de l'Université de Tokyo pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
1. Préparation des solutions
- Préparer une solution salée tamponnée au phosphate 0,01 M (PBS): ajouter un comprimé PBS (0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO 4 3- , pH 7,4) à 1 L d'eau distillée et agiter à TA jusqu'à ce qu'il soit complètement dissous.
- Préparer 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS: ajouter 4 g de PFA à 100 ml de PBS. Mélanger la solution à 60 ° C jusqu'à dissolution totale.
- Après dissolution du PFA dans le PBS, ajuster le pH de la solution à 7,4 avec de l'hydroxyde de sodium 1 N (NaOH). Ensuite, refroidissez sur de la glace et filtrez la solution à travers un papier filtre pour éliminer toute matière particulaire. Conserver à 4 ° C.
Attention: prenez soin de l'utiliser lors de l'utilisation de ces réactifs. ManipulerAvec soin et utilisez des gants, des lunettes de sécurité et des manteaux de laboratoire sous un capot chimique.
REMARQUE: Utilisez une solution fraîche de 4% de PFA préparée dans les 2 jours.
- Après dissolution du PFA dans le PBS, ajuster le pH de la solution à 7,4 avec de l'hydroxyde de sodium 1 N (NaOH). Ensuite, refroidissez sur de la glace et filtrez la solution à travers un papier filtre pour éliminer toute matière particulaire. Conserver à 4 ° C.
- Préparer un PBS 0,01 M complété par Triton X-100 à 0,3% (PBST): ajouter 3 ml de Triton X-100 à 997 ml de PBS. Remuer la solution à la température ambiante jusqu'à ce qu'elle soit complètement dissoute.
- Préparez une solution de blocage de 1% et 5%: ajouter 10 g de lait écrémé à 200 mL de PBST pour préparer une solution de blocage à 5%. Remuer à température ambiante jusqu'à ce qu'il soit complètement dissous. Diluer 5% de solution de blocage cinq fois avec du PBST pour préparer 1% de solution de blocage.
2. Préparation des sections parasagitales OB
- Utilisez des animaux entre 1-2 semaines d'âge. Ces groupes d'âge conviennent aux expériences suivantes, car les glomérules sont clairement visibles et le cerveau peut être coupé avec le crâne.
- Anesthésier l'animal avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital (50 mg / kg de poids corporel). Perfuser l'animal transcardialement avec 4% de P glacéFA dans PBS. Manipuler avec précaution et utiliser des gants, des lunettes de sécurité et des manteaux de laboratoire sous un capot chimique.
- Après la perfusion, couper la tête avec des ciseaux et retirer la peau soigneusement. Ensuite, insérez une lame des ciseaux dans l'espace entre les dents supérieures et inférieures et coupez horizontalement pour enlever la mâchoire inférieure. Découper l'excès de tissu avec des pinces et des ciseaux pour laisser le tissu olfactif, y compris l'OB et l'OE.
REMARQUE: Ne retirez pas le crâne entourant l'OB car cela retient les glomérules médians alignés verticalement directement. - Immerger le tissu olfactif dans PBS pour éliminer l'air dans la cavité nasale. Couper la partie postérieure du cerveau verticalement et placer le tissu olfactif sur le fond du moule d'encastrement avec la face de coupe vers le bas. Remplissez le moule avec un composé de température de coupe optimale (OCT) puis immergez le moule dans de l'azote liquide.
- Après que le tissu dans le composé est complètement gelé, incuber dans les cryosTat à -20 ° C pendant 1 h.
- Faire des sections parasagitales en série (10 μm) de l'OB avec un cryostat et les collecter en collant aux glissières en verre revêtues de MAS. Après avoir collé, sécher les glissières immédiatement avec un sèche-cheveux.
3. Jour 1: Immunomarquage Quadruple des tranches d'OB
- Lavez les diapositives pendant 5 minutes avec du PBS à la température ambiante. Répétez 3 fois.
- Bloquer les sites de liaison non spécifiques en incubant les diapositives pendant 1 h avec la solution de blocage à 5% à la RT.
- Incuber les diapositives O / N avec un cocktail d'anticorps primaires (400 μL chaque glissière) dans la solution de blocage à 1% à la RT. Utilisez les anticorps primaires suivants: anticorps anti-Kirrel2 (1: 1000), anticorps contre la chèvre anti-Semaphorine-7A (Sema7A) (1: 500), anticorps anti-OL-protocadhérine (OLPC) anti-OLP (1: 500) Et l'anticorps anti-vésiculaire anti-vésiculaire de souris 2 (VGLUT2) anticorps (1: 500).
4. Jour 2: Immunomarquage Quadruple de l'OBTranches
- Jeter la solution primaire d'anticorps et laver les diapositives pendant 5 minutes avec du PBST à la température ambiante. Répétez 3 fois.
- Incuber les diapositives pendant 1 h avec un cocktail d'anticorps secondaires (400 μL par coulissement) dans du PBS à la RT. Utilisez les anticorps secondaires suivants: Alexa Fluor 405 (1: 400) anti-souris et anti-souris Alexa Fluor 488 (1: 400), Alexa Fluor 488 (1: 400), coquin d'angule d'âne Alexa Fluor 555 (1: 400) Rat Alexa Fluor 647 (1: 400).
NOTE: Tous les anticorps secondaires doivent provenir des mêmes espèces hôtes. Choisissez une longueur d'onde différente de la fluorescence des anticorps secondaires pour chaque anticorps primaire afin d'éviter tout chevauchement des longueurs d'onde. - Jeter la solution et laver les diapositives pendant 5 minutes avec du PBS à la température ambiante. Répétez 3 fois.
- Monter les lamelles sur les diapositives avec le support de montage. Pour cela, appliquer 2 gouttes du support de montage sur chaque glissière, puis mettre une lamelle en retirant les bulles d'air.
5. Intensity MeAsurances
- Obtenir des images fluorescentes avec un microscope à fluorescence. Utilisez les cubes de filtre suivants: cube de filtre DAPI (excitation 360/40 nm, émission 460/50 nm et miroir dichroïque 400 nm) pour les signaux Alexa Fluor 405, cube de filtre GFP (excitation 470/40 nm, émission 525/50 nm, Et un miroir dichroïque de 495 nm) pour Alexa Fluor 488, cube de filtre TRITC (excitation de 545/25 nm, émission de 605/70 nm et miroir dichroïque de 565 nm) pour Alexa Fluor 555 et cube de filtre Cy5 (excitation de 620/60 nm, 700 / Émission de 75 nm et miroir dichroïque de 600 nm) pour Alexa Fluor 647.
Remarque: Réglez le temps d'exposition pour obtenir des signaux fluorescents de l'image sans saturation. - Définir la structure glomérulaire par des signaux d'immunofluorescence de VGLUT2. Mesurer les intensités de coloration des molécules de tri d'axones dans les glomérules avec ImageJ.
6. Analyse des données
- Soustraire les signaux de fond des intensités de coloration des molécules de tri d'axones.
- Préparez-vousMatrice de données d'expression e, qui comporte des colonnes composées de molécules et de lignes de tri axones composées de glomérules.
- Effectuez une analyse de composant principal (PCA) en utilisant l'ensemble de données d'expression préparé. Ensuite, obtenez les scores PCA, les ratios de cotisation et les charges factorielles de chaque composante principale.
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Representative Results
La carte glomérulaire olfactive est formée par un ciblage global initial et une ségrégation glomérulaire subséquente des axones 1 , 2 de l'OSN. La ségrégation glomérulaire est régulée par les interactions axiales adhésives / répulsives médiées par des molécules de tri axonomique dont les niveaux d'expression sont déterminés par des molécules OU 7 exprimées. Les molécules de tri d'axones impliquées dans la ségrégation glomérulaire sont exprimées selon une mosaïque indépendante de la position dans l'OB 9 . Dans cette étude, nous avons sélectionné les gènes suivants: Kirrel2 , Sema7A , OLPC , BIG-2 et PCDH17 . Certaines de ces molécules de tri d'axones sont exprimées de manière dépendante de l'activité 7 , 8 , 10 .
La quadruple immunitéLa méthode d'apprentissage présentée ici a permis la visualisation des motifs d'expression de quatre molécules simultanément sur la même section. Ces molécules de tri d'axones ont montré des expressions en mosaïque indépendantes de la position, mais leurs motifs n'étaient pas identiques ( figures 1A, B ). La structure glomérulaire a été définie par des signaux fluorescents de VGLUT2 ( Figure 2A ). Les molécules de tri d'axones (Kirrel2, Sema7A, OLPC) ont été exprimées de manière différentielle dans chaque glomérule; Cependant, VGLUT2, qui a été utilisé comme marqueur glomérulaire, a été uniformément exprimé parmi les glomérules ( figures 2B, 2C ).
Un seul glomérule peut être considéré comme une unité de données qui est représentée par de multiples variables. Pour analyser ces données d'expression multivariée, l'analyse des composantes principales (PCA) a été réalisée. PCA définit un nouveau système de coordonnées, de sorte que la première coordonnée possède les ensembles de données de la plus grande variance et que chaque réussiteLa coordonnée a la plus grande variance résiduelle. L'expression des jeux de données a été soumise à PCA et tracée dans l'espace du premier et du deuxième composant principal (PC1 et PC2) ( Figure 3A ). Le ratio de contribution de chaque composante principale indique le pourcentage de pourcentage de chaque composante principale dans la tendance totale des variables. Les ratios de contribution de PC1, PC2, PC3, PC4 et PC5 étaient respectivement de 33,4%, 28,2%, 19,8%, 17,3% et 6,3% ( figure 3B ). PCA a également révélé le facteur de charge dans chaque composant principal. Les charges de facteur au carré indiquent combien le pourcentage de la variance dans une variable d'origine s'explique par un facteur. Dans PC1, les charges factorielles de Sema7A, OLPC et Kirrel2 ont été positivement chargées, alors que celles de BIG-2 et PCDH17 n'étaient pas ( Figure 3C ). Une étude antérieure a analysé l'expression de ces molécules chez les souris mutantes déficientes pour le nucléotide cyclique (CNG), qui est une composante de la transduction du signal olfactif 11 , et a montré que les modèles de changements dépendants du GNC dans les niveaux d'expression ressemblent aux charges factorielles de PC1 9 . Ces résultats ont suggéré que la variété des expressions de ces molécules a été générée par l'activité neurale médiée par un canal de GNC.
Figure 1: Immunomarquage quadruple d'une section OB paragénale. ( A ) Diagramme schématique de l'OE et de l'OB. ( B ) Une section OB parasagitale d'une souris de 2 semaines isolée avec des anticorps contre v GLUT2 (blanc), Kirrel2 (rouge), Sema7A (vert) et OLPC (bleu). L'image fusionnée de Kirrel2 (rouge), Sema7A (vert) et OLPC (bleu) a été affichée à droite. Barres d'échelle = 100 μm./files/ftp_upload/55893/55893fig1large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Analyse d'expression des molécules de tri d'Axon. ( A ) Une section de bulbe olfactive parasagital (OB) immunostained avec des anticorps contre VGLUT2 (violet), Kirrel2 (rouge), Sema7A (vert) et OLPC (bleu). Chaque glomérule est défini par des signaux fluorescents de VGLUT2 (marqueur pré-synaptique). Les structures glomérulaires sont entourées de lignes pointillées. ( B ) Niveaux d'expression de Kirrel2, Sema7A et OLPC dans les glomérules n ° 1, n ° 3, n ° 4 et n ° 6. Les intensités de coloration des molécules de tri d'axones ont été mesurées dans chaque glomérule. ( C ) Niveaux d'expression des molécules de tri d'axones et VGLUT2 comparés entre les glomérules. Les intensités de signal de ces molécules ont été mesurées en aCh glomérulus. Les barres grises sur les graphiques indiquent la moyenne du niveau d'expression. Barre d'échelle = 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: PCA des données d'expression des molécules de tri d'Axon. ( A ) Biplots de score d'analyse de composante principale (PCA) (PC1 vs PC2) de l'ensemble de données d'expression de cinq molécules de tri d'axone (Kirrel2, Sema7A, OLPC, BIG-2 et PCDH17). Au total, 1799 glomérules ont été analysés. ( B ) Les ratios de cotisation et les ratios de cotisation cumulative des cinq composantes principales. Les rapports de contribution de PC1, PC2, PC3, PC4 et PC5 sont respectivement de 0,334, 0,282, 0,198, 0,173 et 0,063. ( C ) Les charges factorielles de Kirrel2, Sema7A, OLPC, BIG-2 et PCDH17 dans PC1-3. Les valeurs propres de PC1, PC2 et PC3 sont respectivement 1,67, 1,16 et 0,99. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'immunocoloration quadruple des sections OB parasagitales a permis de visualiser et de quantifier les niveaux d'expression jusqu'à quatre molécules de tri axones simultanément dans un plus grand nombre de glomérules. En analysant ces données multivariables avec PCA, les caractéristiques de l'expression de ces molécules peuvent être spéculées.
Pour une coloration réussie, la préparation des échantillons de tissu est d'une importance critique. Certains protocoles suggèrent que les tissus devraient être post-fixés avec 4% de PFA et traités avec 30% de saccharose pour la cryoprotection. Cependant, ces étapes ont été omises dans ce protocole. C'est parce que, dans de nombreux cas, ces étapes réduisent l'intensité du signal de coloration et augmentent l'arrière-plan. En outre, les sections ne doivent pas être séchées à aucune étape pour éviter un fond élevé lors de la coloration.
L'état de coloration optimal est différent selon les types de tissus et les anticorps utilisés. Par conséquent, il est nécessaireY pour déterminer les conditions de coloration spécifiques pour chaque expérience. En outre, la concentration d'anticorps primaires est également importante. Lorsque la concentration est trop élevée, elle augmente l'arrière-plan. Toutefois, lorsque la concentration est trop faible, elle réduit le signal. Il est donc important d'identifier la concentration appropriée d'anticorps primaires pour obtenir des résultats de coloration de haute qualité. Une limitation est que cette méthode dépend de manière significative de la qualité des anticorps primaires et de la combinaison d'anticorps primaire par rapport aux espèces animales.
Les sections coronales de l'OB ont été habituellement utilisées pour l'immunocoloration. Cependant, dans ce protocole, des sections parasagitales du côté médian de l'OB ont été utilisées pour pouvoir placer plus de glomérules sur une seule section. Comme ces sections conservent l'ordre topographique des glomérules le long des axes dorsal-ventral et antérieur-postérieur, elles peuvent également être utilisées pour analyser les schémas de distribution deMolécules d'orientation axonale, qui déterminent les sites de projection des axones OSN.
Dans cette étude, les sections parasagitales de l'OB étaient préparées pour permettre de placer plus de glomérules sur une seule section. En outre, les sections horizontales pourraient également être utiles pour que les chercheurs révèlent les différences le long de l'axe médiane-latéral ou antérieur-postérieur. Avec le développement d'anticorps pouvant être utilisés pour des immunostabilités multiples, cette méthode de coloration quadruple peut être appliquée non seulement à l'OB, mais aussi à d'autres zones cérébrales.
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Disclosures
Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation Mitsubishi, la Takeda Science Foundation, JST PRESTO et JSPS KAKENHI Numéro de subvention 16H06144.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
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