Artigo de método

Tomografia de coerência óptica Mouse ultra alta resolução para auxiliar a injeção intra-ocular em pesquisa de terapia de genes da retina

DOI:

10.3791/55894

⸱

2 de novembro de 2018

 , 
1Research Service, VA Western New York Healthcare System, 2Department of Ophthalmology, (Ross Eye Institute), Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 3Pharmacology/Toxicology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 4Physiology/Biophysics, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 5Neuroscience Program, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 6The RNA Institute, University at Buffalo- SUNY, 7The SUNY Eye Institute

Neste artigo

Resumo

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Aqui vamos demonstrar uma nova abordagem para usando a tomografia de coerência óptica espectral-domínio de alta resolução (HR-SD-OCT) para auxiliar entrega de agentes de terapia do gene para o espaço subretinal, avaliar sua cobertura areal e caracterizar vitalidade fotoreceptor.

Resumo

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HR-SD-OCT é utilizado para monitorar a progressão da degeneração fotorreceptoras em modelos do rato ao vivo, avaliar a entrega de agentes terapêuticos para o espaço subretinal e para avaliar a toxicidade e eficácia na vivo. HR-SD-OCT usa perto de luz infravermelha (800-880 nm) e tem ótica especificamente projetada para a única ótica do olho do rato com resolução axial mícron-sub-2. Modelos de rato transgénico da degeneração retiniana externa (fotorreceptor) e controles foram fotografados para avaliar a progressão da doença. Microagulhas puxado de vidro foram usadas para entregar sub retiniana injeções de vírus adeno-associado (AAV) ou nanopartículas (NP) através de uma abordagem trans-escleral e trans-coroide. Cuidado de posicionamento da agulha no espaço subretinal foi necessário antes uma injeção de pressão calibrado, que proporciona o fluido para o espaço da retina sub. Tempo real de cirurgia subretinal realizou-se na nossa imagem sistema (RIS) da retina. HR-SD-OCT demonstrou progressiva degeneração retinal uniforme devido a expressão de uma tóxica mutante humana mutante rodopsina (P347S) transgene (RHOP347S) em ratos. HR-SD-OCT permite a quantificação rigorosa de todas as camadas da retina. Medidas de comprimento (OSL) espessura e fotorreceptoras do segmento externo camada nuclear externa (ONL) correlacionam-se com vitalidade fotoreceptor, degeneração ou resgate. O sistema de entrega RIS permite a visualização em tempo real de injeções subretinal em neonatal (~ P10-14) ou ratos adultos e HR-SD-OCT imediatamente determina o sucesso de entrega e mapeia a extensão de areal. HR-SD-OCT é uma ferramenta poderosa que pode avaliar o sucesso da cirurgia subretinal em camundongos, além da vitalidade dos FOTORRECEPTORES em vivode medição. HR-SD-OCT também pode ser usado para identificar o uniformes coortes animais para avaliar o grau de degeneração da retina, toxicidade e resgate terapêutico em estudos de pesquisa de terapia de gene pré-clínicos.

Introdução

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Os investigadores estão a desenvolver terapias do gene para uma variedade de doenças degenerativas da retina e da retina com esperanças de traduzir novas terapêuticas em tratamentos para doenças humanas1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. no domínio do tempo ou a tomografia de coerência óptica de do....

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Protocolo

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Protocolos de animais foram revistos e aprovados pelo cuidado de Animal institucional e comissões de utilização do VA porque HCS e Universidade de Buffalo-SUNY. Os animais foram utilizados de acordo com as estipulações da Associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) e a declaração de Helsinque.

1. Mouse modelos

  1. Identifica modelos de rato a ser avaliada, incluindo controles.
    Nota: Imagem latente foi realizada por um C57BL/6(J), mWT hC1/hC1 / / / mWT, um modelo de degeneração da retina do rato parcialmente humanizado homozigoto para humano mutante RHOP347S hC1 alelos no selvagem-tip....

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Resultados

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Avaliar a presença, a taxa e a uniformidade da degeneração da retina exterior do modelo
Medições de Oni foram gravadas desde o OPL para o ELM, definindo os limites da Oni usando a ferramenta paquímetro fornecida no software do instrumento. O objetivo era mapear a progressão da degeneração da retina exterior em um modelo do rato de adRP parcialmente humanizado. Imagens comparáveis de um rato C57BL/6(J) de controle e um mWT hC1/hC1 / / / modelo de mouse mWT, expressando .......

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Discussão

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HR-SD-OCT fornece um método simples para a caracterização de potenciais modelos animais de doença humana para determinar sua utilidade na terapêutica potencial de teste. A capacidade de rapidamente e confiantemente caracterizam um potencial modelo animal de doença humana é fundamental para o processo de descoberta de drogas terapêuticas (por exemplo, terapia de substituição genética, terapia de gene "knockdown" ribozima ou shRNA, terapia genética combinada). HR-SD-OCT fornece um método simples, rápido e não-inva.......

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Divulgações

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Relações comerciais: MCB: nenhum; JMS: nenhum. A imagem do sistema (RIS)23 utilizado neste estudo da retina é um dispositivo inovador de uso substancial a qualquer grupo buscando a realização de estudos de entrega de terapia de gene em ratos, roedores ou pequenos animais. Embora os autores não tenham nenhum conflito para declarar com relação a este dispositivo, neste momento, da Universidade de Buffalo - SUNY e a administração de veteranos têm direitos de propriedade intelectual e pode tentar comercializar este instrumento no futuro.

Agradecimentos

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Este material é baseado em trabalho suportado, em parte, pelo departamento de assuntos de veteranos (VA), Veterans Health Administration, escritório de pesquisa e desenvolvimento (biomédica de laboratório de pesquisa e desenvolvimento) (VA mérito Grant 1I01BX000669). JMS é empregado, em parte, como pessoal médico-cientista, Oftalmologia, por VA porque; MCB é empregado, em parte, pela VA porque. O estudo foi realizado em e apoiado em parte, os veteranos administração Western New York Healthcare System (Buffalo, NY). Conteúdo não representam a opinião do departamento de assuntos de veteranos ou o governo dos Estados Unidos. Também apoiou, em grande parte, pelo NIH/NEI R....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
C57BL6 (J)Jackson Laboratories664
N129R-N/AN/A
2HRho 1T/1TN/AN/A
Envisu R-2200 Instrumento de Tomografia de Coerência Ocular (OCT)Bioptigen90-R2200-U1-120.   
Sistema de Imagem de Retina (RIS)Microscópio internoN/A
Stemi 2000CZeiss000000-1106-133
P-97 Extrator de micropipeta flamejante/marromSutter Instrument Cop-97
MMN-33 micro manipulador Narishige USAMMN-33
PLI-100  micro injetorHarvard Apparatus64-1736
Suporte de Micropipeta (Rotativo)InternoN/A
Micropipeta Armazenamento ReceptáculoWorld Precision Instruments Inc.E210
  Tubos capilares de vidro borossilicato 1,5-1,8 X 100mm, Aparelho Harvard30-0053
2,2,2-TribromoetanolSIGMA AldrichT48402-25G
Álcool Terc-amílicoSIGMA Aldrich240486-100ML
Solução Oftálmica de Sulfato de Atropina, USP 1%Akorn Inc.NDC 17478-215-05
GonioviscBioVision LimitedNDC 17238-610-15
Solução Oftálmica de Cloridrato de Ciclopentolato, USP  2%Akorn Inc.NDC 17478-097-10
Pomada de sulfato de gentamicina USP, 0,1%PerigoNDC 45802-046-35
Systane UltraAlcon Laboratories, Inc.9006619-1013
Cloridrato de tetracaínaBausch and LombNDC 24208-920-64
Solução oftálmica, USP 0,5%Bausch e LombNDC 24208-920-64
DPBSGibco Life Technologies14190-136
Preparações de vírusViGene / UNCN / A
Nanobastões de ouroNANOPARTzD12M-850-1.75
Sulfato de fluoresceína AK-FLUOR 25%Akorn Inc.NDC 17478-250-20
LamínulasFisher Scientific12-548-A
PinçasMilton18-825
Agulhas 30 gaugeBeckton Dickenson   W11604
SeringasBeckton Dickenson   
Pacote de software BioptigenBioptigenN/A
, USP 0,5%Akorn Inc.NDC 17478-263-12
Windows ExcelMicrosoftN/A
Adobe IllustratorAdobe 
BalançaMettler
TesouraWorld Precision Instruments
Perfurador de orelhaNat' l band
CL 100 Fonte de luzWelch AllynCL100
Gás nitrogênioJackson Welding SupplyN / A
Banho-maria aquecidoNeslabRTE-140
Placa de aquecimentoIn HouseN / A
Tapete de aquecimentoCincinnatti Sub Zero273
Suporte para mouse de argilaPlast.i.clay American Art Clay Co.N/A
BetadineMedLine NDC53329-938-06
Aplicadores de Ponta de AlgodãoAmerican Health ServiceCtag
EtOH 70%Fisher ScientificBP2818-100
Luvas NitriloVWR89038-272
Diagnosys ERG Color Dome instrumentoDiagnosys Inc.D125
LentesdeInternamente N/A
Diagnosys Software DiagnosysInc.N/A
Origin 6.1 softwareOriginLab Corp.N/A
Eléctrodos de referênciaElectrodo derosca F Ocuscience (DTL) 24"
309659 Solução oftálmica de cloridrato de proparacaína contato

Referências

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  1. Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
  2. Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W.

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