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Artigo de método

Estudos de vírus da influenza A em um modelo do rato da infecção

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DOI:

10.3791/55898

⸱

7 de setembro de 2017

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

Neste artigo

Resumo

Vírus da influenza A (IAVs) são importantes patógenos respiratórios humanos. Para entender a patogenicidade de IAVs e realizar testes pré-clínicos de vacina romance abordagens, modelos animais, imitando a fisiologia humana são necessários. Aqui, descrevemos técnicas para avaliar a patogênese do IAV, respostas humorais e eficácia de vacina usando um modelo do rato da infecção.

Resumo

Vírus da gripe causam mais de 500.000 mortes em todo o mundo1 e estão associados a um custo anual de US $ 12 bilhões nos Estados Unidos sozinho, considerando médica direta e as despesas de hospitalização e de absentismo de trabalho2. Modelos animais são cruciais em estudos de Influenza A virus (IAV) para avaliar a patogênese viral, as interações patógeno-hospedeiro, respostas imunes, e a eficácia da vacina atual e/ou nova abordagens bem como antivirais. Ratos são um modelo animal pequeno vantajoso porque seu sistema imunológico é evolutivamente semelhante ao encontrado em seres humanos, eles estão disponíveis de fornecedores comerciais como indivíduos geneticamente idênticos, há múltiplas variedades que podem ser exploradas para avaliar a base genética das infecções, e são relativamente baratos e fáceis de manipular. Para recapitular infecção IAV nos seres humanos através das vias aéreas, os ratos são primeiro anestesiados antes da inoculação intranasal com infecciosas IAVs sob contenção adequada de biossegurança. Após a infecção, a patogênese da IAVs é determinada pelo monitoramento diário da morbidade (perda de peso de corpo) e a taxa de mortalidade (sobrevivência). Além disso, a patogênese viral também pode ser avaliada por avaliar a replicação do vírus no superior (mucosa nasal) ou inferior (pulmões) do trato respiratório de ratos infectados. Respostas humorais após infecção IAV podem ser rapidamente avaliadas por sangramento não-invasiva e detecção do anticorpo secundário ensaios destinados a detectar a presença de total ou anticorpos neutralizantes. Aqui, descrevemos os métodos comuns usados para infectar camundongos practicar (i.n) com IAV e avaliar a eficácia de proteção, humorais respostas imunes e patogênese.

Introdução

IAVs são vírus envelopadas classificados na família Orthomyxoviridae 3. Eles contêm oito moléculas de RNA único-encalhado com polaridade negativa3. Em humanos, IAVs causam epidemias sazonais e ocasionais pandemias de consequência importante quando novos vírus são introduzidas na população humana4. Além disso, IAVs sazonais são altamente e rapidamente transmitidos entre os seres humanos, produzindo uma elevada perda econômica em todo o mundo a cada ano2,5. IAV os sintomas incluem tosse, congestão nasal, febre, mal-estar, dor de cabeça, anorexia e mialgia, mas o vírus também pode produzir uma doença mais grave em pacientes imunocomprometidos6. Na verdade, a Organização Mundial de saúde (OMS) calcula que os vírus da gripe sazonal com 300.000-500.000 mortes em todo o mundo que cada ano1. Existem apenas duas classes de drogas atualmente aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) para a profilaxia de gripe e tratamento em seres humanos: inibidores de neuraminidase (NA) (por exemplo, oseltamivir) e bloqueadores do canal de íon M2 (por exemplo, Amantadina); no entanto, o surgimento de variantes do vírus resistentes aos medicamentos é uma preocupação crescente. Vacinação, portanto, continua a ser a melhor opção de médica para proteger os humanos contra infecções IAVs. Até à data, três tipos de gripe, as vacinas licenciadas pelo FDA para uso humano estão disponíveis: vacinas de proteína hemaglutinina viral recombinante (HA), inactivadas (IIV) vacinas contra a gripe e viver-atenuado gripe vacinas (LAIV)5, 7. as três vacinas são projetadas para induzir resposta imune adaptativa contra a proteína viral HA, o alvo principal dos anticorpos contra IAVs neutralizantes.

Um modelo de mouse validado para estudar IAV infecção na vivo

Modelos animais têm sido usados para estudar, entre outros, IAV patogênese8,9,10,11, virais fatores que contribuem para doença12 e/ou transmissão viral13 ,14, e testar a eficácia de novas vacinas ou antiviral drogas9,10,15. Camundongos (Mus musculus) são o modelo animal mais extensivamente usado para pesquisa IAV por vários motivos: 1) o sistema imunológico é evolutivamente semelhante ao que se apresentam nos seres humanos; 2) compra animal de baixo custo, incluindo, moradia e reprodução; 3) pequeno tamanho facilmente manipular e armazenar; 4) variabilidade do anfitrião mínima para obter respostas homogêneas e resultados; 5) amplo conhecimento da biologia de ratos, incluindo a sequência do genoma; 6) muitos disponíveis de biologia molecular e/ou reagentes Imunologia; 7) disponível nocaute (KO) ratos para estudar a contribuição de uma proteína do hospedeiro na infecção viral; e, 8) múltiplas variedades do mouse que podem ser exploradas para avaliar as bases genéticas de infecções.

Existem várias cepas de rato atualmente disponíveis para estudar IAV na vivo. Idade, estado imune, sexo, estirpe genética de fundo e mouse, bem como rotas de infecção, dose e estirpes virais influenciam o resultado da infecção do IAV em camundongos. As cepas de rato mais comuns utilizadas na investigação IAV são C57BL/6, BALB/C e, mais recentemente, DBA.2 ratos, desde que eles são mais suscetíveis à doença do IAV que as duas linhagens ex16,17,18, 19 , 20. importante, a resposta imune também pode ser diferente dependendo o rato estirpe18,19,20. Assim, é muito importante recuperar todas as informações disponíveis sobre o mouse e a estirpe do IAV para escolher a melhor opção para o experimento a ser realizado.

Embora o rato é um bom modelo animal de infecção para estudos em vivo com IAV, eles têm várias limitações, que precisam ser considerados no projeto experimental. Por exemplo, uma grande limitação do uso de ratos para estudos em vivo é que IAVs não transmitem entre ratos. Assim, para a transmissão de estudos, mais aceitos modelos animais (por exemplo, furões ou cobaias) são usados16,17,21. Além disso, existem várias diferenças entre as manifestações da IAV em camundongos e humanos. Ao contrário dos humanos, os ratos não desenvolvem febre após infecção IAV; por outro lado, eles apresentam com hipotermia16,17. Em camundongos, replicação IAV está concentrada no trato respiratório inferior (pulmões) em vez de vias aéreas superiores. Assim, virulência do IAV em ratos não é sempre correlacionada ao observado em seres humanos. No total, porque as vantagens superam as desvantagens limitadas, rato representa o primeiro modelo animal usado para avaliar a patogênese viral da gripe, imunogenicidade e eficácia protetora em estudos de vacina e antiviral. Além disso, não seria eticamente aceitável para realizar estudos com IAV usando modelos animais grandes sem provas anteriores em um modelo animal pequeno de infecção IAV. Neste manuscrito, descrevemos como infectar camundongos practicar (óssea) com IAV, como monitorar a gravidade e o progresso da infecção viral e como realizar as experiências necessárias para avaliar humorais respostas imunes e eficácia de proteção.

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Protocolo

todos os protocolos animais descritos aqui foram aprovados pelo cuidado Animal institucional e Comissão de utilização (IACUC) e a Comissão de biossegurança institucional (IBC) na Universidade de Rochester faculdade de medicina e odontologia e cumprir com as recomendações do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório do nacional pesquisa Conselho 22. As instalações e programas do viveiro e divisão de laboratório de medicina Animal da faculdade de medicina e odontologia são acreditados pela AAALAC International e cumprirem com a lei estadual, a lei federal e a política National Institutes of Health (NIH). Semelhantes requisitos devem ser aplicados em cada instituição a aderir aos protocolos animais descritos neste manuscrito.

1. uso de pequenos animais vertebrados

Nota: O adequado equipamento de proteção individual (EPI) é necessário para trabalhar com os ratos. Requisitos mínimos incluem fatos-macaco descartáveis, tampas da sapata, cabeça gorro, máscara e luvas.

  1. Em conformidade com o protocolo IACUC, coloque um máximo de 5 ratos por gaiola. Seguindo o protocolo IACUC, eutanásia em ratos com dois métodos de eutanásia (o segundo deve ser um método físico) para garantir que o animal está morto.
    Nota: Nos experimentos em que IAV morbidade e mortalidade são avaliadas, ratos que perderam 20% do seu peso corporal inicial foram considerados por ter atingido o ponto de extremidade experimental, em foram sacrificados com CO 2 e deslocamento cervical como o método físico secundário. Esta percentagem do peso corporal pode ser diferente em outras instituições. Nos procedimentos de pulmões de ratos e mucosa nasal são cobrados após a infecção do IAV, os ratos são sacrificados com uma dose letal de 2, 2,2-tribromoetanol (TBE), em cortando a hepática veia como método secundário de física. Femininos camundongos C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade foram comprados e mantidos na instalação de cuidado animal na Universidade de Rochester faculdade de medicina e odontologia, sob condições específicas isentos de organismos patogénicos.

2. Biossegurança

Nota: neste relatório, os IAVs usados para infectar ratos são a comum adaptado rato laboratório cepa de gripe H1N1 de Rico/8/34 A/Puerto (PR8 WT) 22 , 23 e uma temperatura sensível LAIV variante, LAIV PR8 8. Executar todos os procedimentos que envolvem infecções IAV (em vitro ou na vivo), culturas de células e amostras biológicas, em uma câmara de segurança biológica em nível de biossegurança (BSL) -2 condições. Utilizar outras BSL fatos ou condições de contenção se forem utilizadas cepas altamente virulentas do IAV.

  1. Limpar o armário com desinfectante de dióxido de cloro antes e depois de executar todos os procedimentos experimentais descritos neste manuscrito de biossegurança. Esterilize todo o material de dissecação (tesouras, bisturi e dissecando fórceps) e o homogenizador homogenizacao antes e após o uso, seguindo as recomendações de IBC adequadas. Descarte todo o material produzido durante os procedimentos sob orientações adequadas do IBC e IACUC.

3. Infecção intranasal

  1. lugar de 6 a 8 semanas de idade feminino C57BL/6 ratos sob condições específicas isentos de organismos patogénicos. Organizar e rotular o mouse gaiolas com o vírus e a dose utilizada. Identifica os ratos em cada gaiola usando um código de soco de orelha ou com outro método aprovado como pintura das caudas. Coloque um máximo de 5 ratos por gaiola.
  2. Preparar a diluição do IAV (unidades formando fluorescente (FFU) / rato) sob condições assépticas em um volume total de 30 µ l/mouse no estéril 1 x salino de tampão fosfato (PBS). Manter o inóculo de vírus no gelo. Calcular a quantidade de IAV adicionar na diluição viral com a fórmula: ((X FFU por rato/30 µ l) x volume final) / estoque título viral.
  3. Os ratos com uma escala de pesar e registrar o peso de cada rato (dia 0). Mantenha o mouse na posição dorsal por pegá-la pela nuca do pescoço entre o dedo indicador e o polegar. Segure a cauda contra a mão com o dedo mindinho.
  4. Anestesiar o mouse intraperitonealmente (i.p.) com 240-250 mg/kg de TBE, inserindo a agulha no caudal 2/3 do lado direito do abdômen. Pausar brevemente antes de retirar a agulha. Retornar o rato da gaiola e esperar 5 min.
  5. Aplicar a pomada oftálmica estéril para os olhos para evitar ressecamento enquanto o mouse é anestesiado. Verifique se o mouse é anestesiado por falta de reflexo de retirada de pedal (ou seja, pitada de dedo do pé). Se os ratos não são totalmente anestesiados eles dólares o vírus.
  6. Quando o mouse é totalmente anestesiado, posicione o mouse em prostração dorsal. Colocar a ponta da pipeta contendo 30 µ l de inóculo vírus na narina e, lentamente, mas constantemente ejetar a solução. Certifique-se de que o mouse é inalar a preparação, observando o inóculo gota desaparecendo.
  7. Verificar que o rato está respirando como TBE pode deprimir a taxa de temperatura e respiração. Devolver o animal para a gaiola, colocando-o em prostração dorsal. Monitorar os ratos por sinais de insuficiência respiratória e se observado, ajudar o mouse para respirar por animal segurando verticalmente e induzir impacto conduzido respiração 24. Monitorar o mouse até que recupere a consciência (30-45 min depois ele estava anestesiado).

4. Caracterização de patogênese Viral ( Figura 1)

  1. avaliação da morbidade e mortalidade ( Figura 1 e Figura 2)
    1. Infectar óssea 3-4 grupos de ratos fêmeas de C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade (pelo menos 5 ratos por grupo, n = 5) com doses 10 vezes (10, 10 2, 10 3 e 10 4 FFU/rato) de WT PR8 conforme descrito na seção 3.
    2. Monitor e pesar os ratos com uma escala durante os próximos 14 dias aproximadamente o mesmo tempo para minimizar as variações de peso devido a ingestão de alimentos. Eutanásia em ratos que perdem 20% do seu peso corporal inicial, conforme descrito na seção 1.
    3. Após 14 dias, eutanásia os ratos que sobrevivem a infecção viral, conforme descrito na seção 1.
    4. Calcular o viral do mouse 50% dose letal (MLD 50) baseado nos dados de sobrevivência obtidos usando o método de Reed e Muench 25. Primeiro, calcular a distância de proporção (PD):
      figure-protocol-1
      1. , em seguida, calcular o MLD 50 pela seguinte fórmula:
        figure-protocol-2
  2. avaliação de títulos virais nos pulmões e mucosa nasal ( Figura 1 e Figura 2. )
    1. recuperação dos pulmões e mucosa nasal
      1. infectar camundongos C57BL/6 6 a 8-semana-idade fêmeas de óssea (n = 6) com a dose viral para testar 10 10 4 FFU de PR8 WT, conforme descrito na seção 3.
      2. Recolher o rato pulmões e mucosa nasal em dias 2 (n = 3) e 4 (n = 3).
        1. Eutanásia os ratos com uma dose letal (i.p.) de TBE (500 mg/kg). Coloque o animal em prostração dorsal e desinfectar a pele sobre o tórax com etanol a 70%. Corte a pele com um bisturi do esterno à base do abdômen. Fazer cortes de 1 cm da base da incisão para as partes laterais dos ratos com a tesoura.
        2. Cortar a veia hepática com uma tesoura para sangrar o mouse como o método de eutanásia secundário. Coloque o animal em posição ventral e esperar 2 minutos para permitir que o sangue escorrer para fora. Este passo é importante para reduzir o sangue nos pulmões.
        3. Remover a pele da parte superior inteira do mouse (incluindo a cabeça) para a base do abdômen onde a primeira incisão foi feita com o auxílio de fórceps e a tesoura de dissecação. Cortou a cabeça com a tesoura e coloque-o em uma placa de Petri estéril seco.
        4. Corte as junções entre a maxila e mandíbula com a tesoura e elimine a mandíbula. Com a tesoura, faça dois cortes nas extremidades dos arcos zigomático e removê-los. Remova os olhos com a ajuda da pinça dissecação.
        5. Segura o crânio com a pinça de dissecação e cortar o crânio ao longo da sutura sagital com um bisturi. Levante as duas metades do crânio com o cérebro para ver a mucosa nasal. As mucosas nasais são cercados pelos ossos etmoidais anteriores ossos do crânio, incluindo o nasal, maxilar, Palatino, zigomático e.
        6. Com o bisturi, corte a parte do crânio com o cérebro e descarte. Coloque a outra parte do crânio com a mucosa nasal em um tubo estéril. Armazenar o tubo no gelo (4 ° C), se as amostras são processadas no mesmo dia, ou em gelo seco para congelá-los rapidamente se as amostras serão processadas depois.
        7. Para evitar a contaminação das amostras, limpar e desinfectar as ferramentas de dissecção entre cada tecido recuperado e entre cada animal dissecação com desinfectante de dióxido de cloro.
        8. Para coletar os pulmões, coloque o animal em prostração dorsal e corte da pleura com a tesoura. Abra a caixa torácica por cortar as costelas em 1 cm em ambos os lados do esterno. Fazer os cortes da base da caixa torácica para a parte superior com a tesoura.
        9. Fazer um corte com a tesoura entre as duas incisões na parte superior da caixa torácica e retire a placa do peito. Mantenha os pulmões com a pinça, corte na extremidade da traqueia (antes dos pulmões), com a tesoura e coloque os pulmões em um tubo estéril. Armazenar o tubo no gelo (4 ° C), se as amostras são processadas no mesmo dia, ou em gelo seco para congelá-los rapidamente se as amostras serão processadas depois.
          Nota: Homogeneizar as amostras de tecido no mesmo dia em que eles são recolhidos e armazene a-80 ° C para analisar títulos virais mais tarde. É importante que as amostras não sejam objecto de congelamento-descongelamento repetidos ciclos antes de títulos de vírus são determinados. Alternativamente, armazenar as amostras a-80 ° C, até que eles serão processados.
    2. Homogeneização dos pulmões e mucosa nasal
      1. colocar os pulmões ou mucosa nasal em um homogeneizador homogenizacao estéril e adicionar 1 mL de mídia infecção frio. Homogeneizar a amostra, movendo o pilão acima e para baixo por aproximadamente 1 min à temperatura ambiente (RT) até que os pulmões estão completamente interrompidos. Colocar a amostra homogeneizada em um tubo estéril e loja em 4 ° C. utilizar um novo homogenizacao homogenizador para cada amostra.
      2. Centrifugar as amostras a 300 x g, durante 5-10 min a RT. recolher o sobrenadante em um tubo estéril de novo. Armazenar o sobrenadante a 4 ° C, se a titulação viral é executada no mesmo dia e descartar a pelota. Alternativamente, congelar as amostras (-80 ° C) o sobrenadante do homogeneizado para avaliar títulos virais mais tarde.
    3. Titulação do vírus por imunofluorescência indireta
      1. no dia anterior a titulação, semente placas de 96 poços com células epiteliais Madin-Darby Canine renal (MDCK) (4 x 10 4 células/poço) para alcançar a confluência de ~ 80-90% em meios de cultura de tecido. Coloca as células em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO 2. O dia da titulação viral, verificar as células sob o microscópio para confirmar uma monocamada antes de iniciar a infecção viral.
      2. 01:10 de preparar diluições do sobrenadante das amostras homogeneizadas (pulmão ou mucosa nasal) em meios de infecção em uma placa de 96 poços. Realizar a titulação viral triplica para determinar com precisão a concentração viral.
        1. Adicionar 90 µ l de mídia de infecção a cada um dos poços da placa de 96 poços. Adicione 10 µ l de um do sobrenadante das amostras homogeneizadas poços A1, A2 e A3 para avaliar a titulação viral de cada amostra em triplicado. Adicione 10 µ l do sobrenadante outra das amostras homogeneizadas para poços, A4, A5 e A6. Executar a mesma diluição consecutivamente com o resto das amostras.
        2. Após a adição da amostra sobrenadante com a linha A, usar uma pipeta multicanal para misturar pipetando para cima e para baixo. Transferir 10 µ l de linha A linha b alteração as pontas entre diluições e misture bem. Repita isto até atingir a última linha (H).
      3. Remover o meio de cultura de tecido (passo 4.2.3.1) usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo de células MDCK em placas de 96 poços e lavar duas vezes com 100 µ l/poço de 1X PBS.
        4. Células
      4. transferir 50 µ l/poço do sobrenadante das amostras homogeneizadas para a placa de 96 poços com MDCK serialmente diluído. Comece a transferir as diluições superiores (linha H) para as diluições inferiores (linha A). Neste caso, não é necessário alterar as pontas entre diferentes linhas.
      5. Colocar as placas de 96 poços em uma plataforma de balanço por 1h no RT para permitir que a adsorção viral. Após a adsorção viral, remover o inóculo usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo e adicionar 100 µ l/poço de pós-infecção mídia. Incube as células infectadas para 8 h em uma incubadora de 33 ° C ou a 37 ° C com 5% de CO 2. Proceder à fixação, coloração, imagem e cálculo de título viral, conforme descrito nas etapas 4.2.3.6 – 4.2.3.12.
      6. Remover o meio de cultura de tecidos das placas de 96 poços, usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo. Corrigir e permeabilize as células com 100 µ l/poço de solução de fixação/permeabilização por 20 min no RT.
        Atenção: Use a solução de permeabilização/fixação em uma coifa para evitar a exposição do formol.
      7. Remover a solução de fixação/permeabilização usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo, lave com PBS 1x e incube as celulas fixas com bloqueio solução por 1h na loja RT. as células no bloqueio a 4 ° C ou prosseguir para a próxima etapa.
      8. Remover a solução de bloqueio. Adicionar 50 µ l/poço de anticorpo monoclonal (mAb) 1 µ g/mL anti-NP HB-65 diluído em solução de diluição de anticorpo. Incubar durante 1 h a 37 ° C. Different mAb ou polyclonAl (pAb) de anticorpos anti-PR8 pode ser usado.
      9. Entretanto, diluir a 1: 200 o isotiocianato de fluoresceína (FITC)-anticorpo secundário conjugado do anti-rato na solução de diluição de anticorpo. Centrifugue a solução a 1.700 x g, durante 5-10 min à RT Podem ser usados outros anticorpos secundarios conjugados com outros fluorophores.
      10. Remover o anticorpo primário e lavar 3 vezes com 100 µ l/poço de 1X PBS. Adicionar 50 µ l/poço de diluição o anticorpo secundário e incube por 30-45 min a 37 ° C. Remove o anticorpo secundário e lavagem 3 vezes com 100 µ l/poço de 1X PBS. Embora a última lavagem da placa.
      11. Observar as células sob um microscópio de fluorescência para determinar o número de células (verdes) manchadas positivas. Calcule o título viral contando FFU/mL. Calcular o título viral expressado em FFU/mL da diluição com 30-50 células coradas positivas, usando a fórmula: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/diluição.

5. Avaliação da resposta imune Humoral ( Figura 3)

  1. infectar óssea 3 grupos de ratos fêmeas de C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade (n = 5) com as diferentes doses (10 2, 10 3 e 10 4 FFU / rato) de LAIV PR8 e mock-infectar um grupo (n = 5) com 1X PBS estéril como controlo negativo. Executar as infecções de rato i.n, conforme descrito na seção 3.
    1. Mouse sangramento por punção submandibular
      1. 14 dias após a imunização, coletar o sangue de ratos usando submandibular sangramento uma lanceta 4mm 26, ou usando outro IACUC métodos aprovados.
        1. Segure o mouse por pegá-la pela nuca do pescoço entre o dedo indicador e o polegar. Segure a cauda contra a mão com o dedo mindinho para imobilizar o mouse.
        2. Colocar o mouse em uma posição lateral para ver o rosto. Fazer a punção na junção das veias retrô-orbital e submandibulares com a veia jugular. Afundar a lanceta (4mm) e recuperar o sangue em um tubo estéril (aproximadamente 0,2 - 0,4 mL/rato são recuperados). Aplica pressão sobre a punção com um guardanapo esterilizado por alguns segundos. Coloque o mouse volta para a jaula.
      2. Colocar os tubos para 1-2 h a 37 ° C e em seguida centrifugar-lhes a 700 x g, durante 30 min à RT para separar o soro do sangue. Transferi a camada superior que consiste o soro com uma pipeta para um novo tubo estéril. Descarte a pelota de glóbulos vermelhos (hemácias). Armazene o soro em -20 ° C.
  2. Análise de totais anticorpos contra as proteínas virais
    1. preparação dos extratos de células MDCK infectados
      1. o dia antes da infecção, semente de um prato de 100 mm com 4-5 x 10 6 células MDCK (até ~ 80-90 confluência de % no dia seguinte) em meios de cultura de tecido. Coloca as células em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO 2. O dia da infecção viral, verificar as células sob o microscópio para confirmar uma monocamada antes de iniciar a infecção viral.
      2. Preparar uma diluição viral com um multiplicity (0,001) baixa de infecção (MOI) de PR8 WT em meios de infecção no total volume final de 4 mL. Calcular a quantidade de PR8 WT com a fórmula ((MOI X x células n °) x volume final) / estoque título viral.
      3. o meio de cultura de tecido da placa de células MDCK de aspirar e lavar duas vezes com 4 mL de 1X PBS. Adicione o inóculo viral (4 mL) e colocar a placa sobre uma plataforma oscilante para 1h no RT para permitir que a adsorção viral. Remova o inóculo viral com vácuo e adicione 8 a 10 mL de pós-infecção mídia contendo 1 µ g/mL de tripsina tratada com TPCK. Incubar as células infectadas por 48-72 h numa incubadora de 33 ° C ou a 37 ° C com 5% de CO 2.
      4. Separar as células com o auxílio de um raspador de célula e coletar as células e o meio de cultura de tecido com uma pipeta em um tubo de 15 mL. Centrifugar o tubo a 400 x g, durante 5-10 min no RT. Aspire o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de tampão RIPA e coloque a mistura em um tubo estéril de 1,5 mL. Incubar no gelo por 20-30 min.
      5. Centrifugar o tubo a 1.300 x g por 20-30 min a 4 ° C. cuidadosamente, recuperar o sobrenadante. Loja a célula extrair em 100 alíquotas µ l a -20 ° C.
      6. Titular os extratos de células, como descrito por ensaio imunoenzimático (ELISA) antes avaliando-os para a presença de anticorpos 9 , 10 , 11 , 27. incluir célula extrai de células MDCK infectadas por simulação (preparadas como indicado acima) como controlo negativo.
    2. ELISA ( Figura 4)
      1. revestimento de poliestireno, placas de 96 poços com a diluição adequada de célula infectada-MDCK extrair em 1X PBS (normalmente entre 1: 200 - 1:1, 000). Revesti outra placa com a mesma diluição do extrato de células MDCK mock-infectados como controlo negativo. Incubar durante a noite (O/N) em 4 ° C.
      2. Remover o sobrenadante usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo e lave uma vez com 100 µ l/poço de 1X PBS com uma pipeta multicanal. Bloquear ligação não específica adicionando-se 100 µ l/poço de bloqueio solução por 1h no RT.
      3. Enquanto isso, fazer 2 vezes diluições em série (começando a diluição 01:50) do sera de cada rato infectado na etapa 5.1 em solução de diluição de anticorpo em uma placa de 96 poços.
      4. Retire a solução bloqueio as chapas poliestireno de 96 poços usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo. Adicionar 50 µ l de cada diluição do soro de rato no poço apropriado e incubar 1 h a 37 ° C.
      5. Remover o sera de ratos com um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo. Lave os poços 3 vezes com água destilada, usando uma pipeta multicanal. Adicione 50 µ l/poço de um anticorpo secundário anti-rato conjugado com a 1:2,000 Peroxidase de rábano (HRP) diluído em solução de diluição de anticorpo. Incubar a 1 h a 37 ° C.
      6. Remover o anticorpo secundário com um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo. Lave os poços 3 vezes com água destilada, usando uma pipeta multicanal. Preparar a solução de substrato tetrametilbenzidina (TMB) misturando a solução 1:1 A e B. Adicione 100 µ l/poço de substrato e incubar durante 5-10 min a RT no escuro.
      7. Pare a reação adicionando-se 100 µ l/poço de 0,2 N H 2 então 4. Ler as placas a 450 nm em um leitor ELISA.
      8. Subtrair o valor obtido em cada diluição MDCK mock-infectados 96 poços da placa de partir o valor obtido da placa de 96 poços MDCK infectados. Calcular os valores médios para cada diluição com o sera diferente e representá-los em um gráfico mostrando desvios padrões (DP).
  3. Análise de anticorpos neutralizantes
    1. ensaio de inibição da hemaglutinação (HAI) ( Figura 5)
      1. antes de executar o ensaio HAI, tratar os soros de rato com receptor destruir a enzima (RDE) para eliminar todos os inibidores não específicos presentes no soro. Adicionar 1 volume de soro de rato para 4 volumes de diluição de trabalho RDE (diluição do soro é agora 1:5). Incubar O/N (12- 18 h) em banho maria a 37 ° C.
      2. Aquecer as amostras de soro a 56 ° C durante 30 min inactivar a RDE.
      3. Pre-determinar a atividade de hemaglutinação (HAU) de WT PR8 pelo padrão de ensaio HA 28. Uma vez que o HAU viral é determinado, diluir o estoque viral para 8 HAU por 50 µ l de PBS 1x.
      4. Preparar diluições em série 2 vezes (12 diluições) do RDE-tratados sera em uma placa de V-fundo de 96 poços. Use uma linha para cada amostra de soro (por exemplo, A1 a A12).
        1. Adicionar 25 µ l de 1X PBS de A1 a A12 poços. Teste cada uma das amostras de soro em uma linha. Adicione 25 µ l do soro RDE-tratada (1:5) a 25 µ l de PBS 1x no primeiro poço da coluna (A1). A primeira diluição do soro é 01:10.
        2. , Uma vez que todos os soros RDE-tratados são adicionados para a primeira coluna, (por exemplo, A1, B1, C1), usar uma pipeta multicanal para misturar os soros e 1X PBS pipetando para cima e para baixo. Transferi 25 µ l do sera diluído da primeira coluna para a segunda coluna (por exemplo, de A1 a A2). Alterar as pontas entre diluições e misture.
        3. Repetir passos 5.3.1.4.2. até atingir a última coluna (por exemplo, A12, B12, C12). Descarte a 25 µ l da última coluna, mantendo o volume consistente em todos os poços (25 µ l). Incluir uma linha de poços que contém apenas 25 µ l de PBS 1x sem qualquer soros como controlo negativo.
      5. Adicionar 25 µ l do IAV diluído a 8 µ l de HAU/50 para cada um dos poços com sera em placa de 96 poços V-fundo; o volume final em cada bem é 50 µ l, contendo 4 HAU do vírus. Misture o conteúdo por pipetagem repetidas. Incubar durante 1 h em RT.
        6. Adicionar 50 µ l de 0,5% Turquia hemácias a cada um dos poços de
      6. . Misture o conteúdo por pipetagem repetidas. Incube a placa por 30-45 min no gelo. Ler o ensaio HAI visualmente quando as hemácias em poços de controle (1X PBS) formam um precipitado vermelho (ou seja, da pelota) no fundo dos poços.
        Nota: Hemácias de outras espécies tais como frango, cobaia ou cavalo também pode ser usado.
      7. Calcular a concentração HAI identificando o último bem em que as hemácias formam uma bolinha vermelha e hemaglutinação não ocorre.
        Nota: O valor recíproco desta diluição é o título HAI. O valor recíproco é multiplicado por um fator de 20 para corrigir a 01:20 diluição do soro na primeira linha.
    2. Ensaio microneutralization de vírus (VNA) ( Figura 6)
      1. no dia anterior VNA, preparar células MDCK em uma placa de 96 poços para alcançar confluência de 80-90% no dia seguinte, conforme descrito na etapa 5.2.1.1. Preparar uma diluição de PR8 WT em meios de infecção ter 200 µ l de FFU/25.
      2. Inativar o sera rato no 56 ° C durante 1 h. fazer 2 vezes diluições em série (12 diluição) por sera de rato em triplicado usando uma placa de 96 poços.
        1. Adicionar 40 µ l de soro a 160 µ l de mídia de infecção no primeiro bem de primeira linha, (por exemplo, A1) (soro diluição 1:5). Misture por pipetagem. Adicionar 100 µ l de mídia de infecção para os outros poços (A2 a H12).
        2. Transferir 100 µ l de primeira linha para a segunda linha para fazer diluições de 1:2 (por exemplo, de A1 a A2). Trocar dicas entre diluições e mistura por pipetagem. Repita isto até a última linha (por exemplo, A12). Descartar a 100 µ l de última linha, mantendo o volume consistente em todos os poços (100 µ l).
      3. Adicione 100 µ l da diluição do IAV a todos os poços. Incubar a 1 h no RT. Enquanto isso, retire o meio de cultura de tecido as células MDCK em placa de 96 poços, usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo e lavar duas vezes com 100 µ l/poço de 1X PBS.
      4. Em cada placa de 96 poços de células MDCK, deixar duas linhas para os controles. Uma linha é o controle negativo (células sem vírus e soros), e a outra linha é o controlo positivo de infecção (células com vírus na ausência de soros ou soros de ratos infectados por simulação).
      5. Transferir 50 µ l/poço da placa de vírus-anticorpo para as placas de 96 poços de células MDCK. Ponha as placas sobre uma plataforma oscilante para 1h no RT para permitir que a adsorção viral.
      6. Remover o inóculo de vírus-anticorpo usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo e adicionar 100 µ l/poço de pós-infecção mídia contendo 1 µ g/mL de tripsina tratada TPCK.
      7. Incubar as células ~ 3-4 dias em uma incubadora de 33 ° C ou a 37 ° C com 5% CO 2 até efeito citopático (ECP) é observado no controle positivo (células infectadas na ausência de soros ou com soro de controlo).
      8. Remover o meio de cultura de tecido usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo e adicionar 100 µ l/poço de violeta de cristal de 0,1%. Incube durante 1 h em RT. Remove a solução de cristal violeta usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo. Lave os poços 3 vezes com água destilada. Seque as placas no RT.
      9. Calcular a concentração VNA identificando a maior diluição que retém uma monocamada confluente celular de células MDCK.
        Nota: O valor recíproco desta diluição correspondente é o título de anticorpos neutralizantes. O valor recíproco é multiplicado por um fator de 10 para corrigir as 01:10 diluição do sera o primeiro poço da linha.

6. Avaliação de vacinas de eficácia de proteção ( Figura 3)

  1. óssea vacinar um grupo de ratos fêmeas de C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade (n = 11) com a dose de PR8 LAIV para testar (FFU/mouse) e simulação-vacinar um outro grupo de camundongos (n = 11) com 1X PBS estéril. Executar as imunizações óssea de rato conforme descritas na seção 3.
  2. Quatorze dias pós-vacinação, sangrar os ratos e coletar o sera conforme descrito na seção 3. Analisar a presença de total e neutralizando anticorpos contra PR8 WT, conforme descrito na seção 5.1.1.
  3. Quinze dias pós-vacinação, medir e registrar o peso do corpo do mouse (dia 0). Desafio óssea de ratos com uma dose letal do PR8 WT (desafio homólogo), conforme descrita na seção 3.
  4. Medir o peso corporal e sobrevivência (n = 5 / grupo) durante 14 dias após o desafio de avaliar a morbidade e a mortalidade produzida pelo desafio PR8 WT em camundongos vacinados (seção 4.1).
  5. Recuperar rato pulmões e mucosa nasal (n = 3/dia) no dia 2 e dia 4 pós-desafio com PR8 peso homogeneizar e analisar os pulmões e mucosa nasal conforme descrito na seção 4.2, que avalia a replicação viral em camundongos vacinados de PR8 WT.

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Resultados

Caracterização de patogênese viral em camundongos

A patogênese da IAV está relacionada a morbidade e a mortalidade causada por sua infecção. Esses dois parâmetros podem ser avaliados em camundongos facilmente: morbidade IAV está associada a perda de peso corporal em camundongos infectados e a porcentagem de sobrevivência irá indicar a taxa de mortalidade (Figura 1). O peso corporal e sobrevivência em c...

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Discussão

O modelo do rato do IAV é amplamente utilizado na vivo estudos de eficácia de proteção, a imunogenicidade e a patogênese do IAV. O pequeno tamanho dos ratos torna fácil de manipular e armazenar em comparação com outros modelos animais, como furões ou cobaias. Além disso, a facilidade em termos de custo de animal, habitação e reprodução permitem sua utilização em testes pré-clínicos vacinação em que um grande número de animais é necessários. Notavelmente, desde que os ratos têm sido usados em pesquisa de múltipla...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Pesquisa sobre o vírus da gripe em laboratório LM-S é parcialmente financiada pelo The New York gripe centro de excelência (NYICE), um membro dos NIAID centros de excelência para a investigação de Influenza e vigilância (CEIRS). Agradecemos seu apoio nas correções do manuscrito Wendy Bates.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Células epiteliais do Rim Canino Madin-Darby (MDCK)ATCCCCL-34
Camundongos C57BL/6 fêmeas de seis a oito semanas de idadeInstituto Nacional do Câncer (NCI)01XBE
Células vermelhas de peruBiolink IncLoja em 4 ° C
Dulbecco' s Águia modificada' s médio (DMEM)Corning Cellgro15-013-CVLoja em 4 ° C
Fetal Soro Bovino (FBS)Seradigm1500-050Armazenar a -20 ° C
Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina (PSG) 100xCorning30-009-CILoja a -20 ° C
Penicilina/Estreptomicina (PS) 100xCorning30-00-CIArmazenar a -20 &graus; C
Bovin Solução de albumina (BA)Sigma-AldrichA7409Loja em 4 ° C
Bovin Albumina Sérica (BSA)Sigma-AldrichA9647Loja em 4 ° C
Tripsina tratada com tosilsulfonil fenilalanil clorometilcetona (TPCK)Sigma-AldrichT8802Armazenar a -20 ° C
Formalina tamponada neutra 10%EMD65346-85Loja na RT
Triton X-100J.T.BakerX198-07Loja na RT
Anticorpo monoclonal anti-NP Influenza A Virus HB-65ATTCH16-L10-4R5Loja em -20 ° C
Imunoglobulinas anti-camundongo de coelho policlonal / FITCDakoF0261Armazenar em 4 ° C
ECL Anti-mouse IgG, anticorpo inteiro ligado à peroxidase de rábanoGE HealthcareLNA931V/AGArmazenar a 4 ° C
Conjunto de substrato TMBBioLegend421101Armazenar a 4 ° C
Vmax Leitor de placa cinéticaMolecular Devices
Dounce Tissue GrindersThomas Scientific7722-7
Enzima destruidora de receptores, RDE (II)Denka Seiken Co.370013Armazenar a -20 &graus; C
CristalVioleta Fisher ScienctificC581-100Armazene na RT
Placa de Cultura de Células de 96 poçosGreiner Bio-one655-180
Placas de Cultura de Células 100 mmGreiner Bio-one664-160
Nunc MicroWell MicroWell Microplacas de 96 PoçosThermo Fisher Scienctific269620
Nunc 96-Well Placas de MicroWell de Fundo Cônico de PoliestirenoThermo Fisher Scienctific249570
Puralub Vet PomadaDechra9N-76855
Microscópio fluorescenteOlympusOlympus IX81

Referências

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