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Artigo de método

Indução e diagnóstico de tumores em

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⸱

DOI:

10.3791/55901

⸱

25 de julho de 2017

 , 
1Structural Biology Center, National Institute of Genetics and Department of Genetics, School of Life Science, SOKENDAI, 2Graduate School of Media and Governance, Keio University

Neste artigo

Resumo

A análise do clone de mosaico no epitélio do disco imaginal de Drosophila é um sistema modelo poderoso para estudar os mecanismos genéticos e celulares da tumorigênese. Aqui descrevemos um protocolo para induzir tumores em discos imaginários da asa de Drosophila usando o sistema GAL4-UAS e introduzir um método de diagnóstico para classificar os fenótipos do tumor.

Resumo

Nos estágios iniciais do câncer, as células mutantes transformadas apresentam anormalidades citológicas, começam o excesso de crescimento descontrolado e interromperam progressivamente a organização do tecido. Drosophila melanogaster emergiu como um sistema modelo experimental popular em biologia do câncer para estudar os mecanismos genéticos e celulares da tumorigênese. Em particular, as ferramentas genéticas para discos imagólicos de Drosophila (desenvolvimento de epitélios em larvas) possibilitam a criação de células pro-tumorais transformadas dentro de um tecido epitelial normal, uma situação semelhante às etapas iniciais do câncer humano. Um estudo recente da tumorigênese em discos imaginários da asa de Drosophila , no entanto, mostrou que a iniciação do tumor depende da citoarquitetura do tecido intrínseco e do microambiente local, sugerindo que é importante considerar a susceptibilidade específica da região aos estímulos tumorigênicos na avaliação de fenótipos tumorais em imaginações Discos. Para facilitar a análise fenotípica do tumor progressiEm discos imaginais, aqui descrevemos um protocolo para experiências genéticas usando o sistema GAL4-UAS para induzir tumores neoplásicos em discos imaginais de asa. Além disso, introduzimos um método de diagnóstico para classificar os fenótipos das lesões clonais induzidas em epitélios imaginais, pois um método de classificação claro para discriminar vários estágios de progressão tumoral (como hiperplasia, displasia ou neoplasia) não havia sido descrito anteriormente. Esses métodos podem ser amplamente aplicáveis ​​à análise clonal de fenótipos tumorais em vários órgãos em Drosophila .

Introdução

Os tecidos epiteliais são sistemas altamente organizados que possuem a habilidade homeostática notável para manter sua organização através do desenvolvimento e do turnover celular. Este robusto sistema de auto-organização, no entanto, é progressivamente interrompido durante o desenvolvimento do tumor. No início do desenvolvimento do tumor, as células mutantes individuais decorrentes da ativação do oncogene ou da inativação do gene supressor de tumor emergem dentro de uma camada epitelial. Quando esta "célula pro-tumoral" transformada evade um ambiente supressivo, interrompe a organização epitelial e começa a proliferação descontrolada, a tumorigênese ocorre 1 . Durante as últimas décadas, os avanços tecnológicos notáveis ​​em genética e biologia molecular fizeram progressos notáveis ​​na pesquisa do câncer. Em particular, estudos recentes utilizando ferramentas de análise de mosaico genetico em Drosophila melanogaster , como o recombinante mitótico recombinante FLP-FRT (flipase recombinase / flippase recombinase)Os sistemas 2 e flip-out-GAL4-UAS (seqüência de ativação upstream) 3 contribuíram grandemente para uma melhor compreensão dos mecanismos genéticos envolvidos na formação e metástase dos tumores 4 , 5 , 6 .

Estudos de um grupo de genes de supressores de tumores Drosophila conservados, larvas gigantes letais ( lgl ), discos grandes ( dlg ) e rabiscos ( scrib ), evidenciaram a relação crítica entre perda de organização epitelial e desenvolvimento tumoral, pois esses genes desempenham papéis fundamentais Na regulação da polaridade das células basais apical e da proliferação celular nos tecidos epiteliais 7 . Enquanto os discos imaginários de Drosophila são normalmente epitélios monocamadas, mutações homozigóticas em qualquer um desses três genes fazem com que as células perdam estrutura e polaridade, não conseguem diferenciarRentiate, overproliferate e, finalmente, formam massas amorfas multicamadas que se fundem com tecidos adjacentes 7 . Da mesma forma, a interrupção desses genes em mamíferos está envolvida no desenvolvimento de tumores malignos 8 , 9 . Os fenótipos neoplásicos exibidos pelos tecidos mutantes levaram à classificação desses três genes como genes supressores tumorais neoplásicos (nTSGs) 7 , 8 preservados. No entanto, quando as células mutantes nTSG homozigóticas são geradas esporadicamente no desenvolvimento de discos imaginais de tipo selvagem usando a recombinação mitótica mediada por FLP-FRT, as células mutantes são eliminadas do tecido através da apoptose dependente da quinase N-terminal N-terminal (JNK) 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , extrusão 15 , 16 , ou engulfment e fagocitose por vizinhos 17 . Neste epitelio de mosaico genetico, a apoptose é principalmente detectada em células mutantes nTSG localizadas no limite do clone, sugerindo que as células normais adjacentes desencadeiam a apoptose de células mutantes nTSG 10 , 11 , 12 , 18 . Estudos recentes em células de mamíferos confirmaram que esta eliminação dependente da competição celular das células pro-tumorais é um mecanismo de autodefesa epitelial conservado evolutivamente contra o câncer 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .

Um estudo recente em discos imagólicos de Drosophila , no entanto, mostrou que os clones de nTSG-knockdown em mosaico induzem tumores neoplásicos em especificaçõesRegiões ic de discos ideais de asa 16 . A formação inicial do tumor sempre foi encontrada na região periférica da "dobradiça" e nunca observada na região central da "bolsa" do epitélio do disco de asa, sugerindo que o potencial tumorigênico das células nTSG-knockdown depende do ambiente local. A região da bolsa central funciona como uma "mancha fria do tumor" onde as células pró-tumorais não apresentam crescimento excessivo displásico, enquanto que a região da dobradiça periférica se comporta como um "ponto crítico do tumor" 16 . Nas regiões da bolsa "coldspot", as células nTSG-knockdown se delaminam do lado basal e sofrem apoptose. Em contraste, as células de dobradiça "hotspot" possuem uma rede de estruturas citoesqueléticas robustas em seus lados basais, as células de nTSG-knockdown se delaminam do lado apical do epitélio e iniciam o crescimento excessivo tumorigênico 16 . Portanto, a análise de fenótipos tumorais em discos imaginários exige consi cuidadoDerrame da susceptibilidade específica da região aos estímulos tumorigênicos.

Aqui, descrevemos um protocolo para induzir a formação de tumor neoplásico nos discos imaginários da asa Drosophila utilizando o sistema GAL4-UAS- RNAi pelo qual as células nTSG-knockdown são geradas em epitélio de disco de asa normal. Embora esses sistemas experimentais sejam úteis para estudar os estágios iniciais do câncer, um método de classificação claro para avaliar os estágios da progressão tumoral no epitélio de disco imaginal não foi claramente descrito anteriormente. Portanto, também propomos um método de diagnóstico para classificar os fenótipos clonais pro-tumorais induzidos no epitélio do disco de asa em três categorias: hiperplasia (acumulação de um número excessivo de células que aparecem normalmente com aumento da proliferação), displasia (tecido pré-maligno composto de aparência anormal Células) e neoplasia (tumor benigno ou maligno composto de células com aparência anormal e padrão de proliferação anormal).

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Protocolo

1. Fly Crosses e Clone Induction

  1. Remova todas as moscas no frasco 12 h antes de coletar moscas virgens.
  2. Anestesiar as moscas dentro do recipiente através da injecção de gás de CO2 e voa lugar numa almofada de mosca de CO 2.
  3. Transfira 10 - 20 fêmeas virgens e 10 machos da almofada de mosca CO 2 para um frasco fresco e incubar durante 1 dia a 25 ° C.
  4. Transfira essas moscas para um frasco fresco e incube durante 12 h a 25 ° C.
    NOTA: Descarte o primeiro frasco para injectáveis, pois as fêmeas virgens não colocam ovos suficientes no primeiro dia.
  5. Para as linhas Enhancer-GAL4, remova as moscas adultas e incuba o frasco para injectáveis ​​a 25 ° C até a dissecção.
  6. Para indução de clones de mosaico por flip-out-GAL4, remova as moscas adultas e incuba o frasco para 2-4 dias a 25 ° C. O tempo de incubação antes do choque térmico depende do propósito experimental. Um choque térmico 2 dias após a deposição de ovos (AED) gera clones de mosaico em um segundo imaturoInstado imaginal epitélio. Um choque térmico após 3 ou 4 dias AED gera clones de mosaico em epitélio imaginal diferenciado de início a médio e terceiro instar.
    NOTA: É importante examinar o efeito do tempo de choque térmico alterado em fenótipos tumorigênicos.
  7. Para a indução de clones de mosaico por flip-out-GAL4, choque calor o frasco por imersão em um banho de água a 37 ° C durante 10 a 45 minutos seguido de incubação durante 2 a 3 dias a 25 ° C.
    NOTA: A informação do tempo de choque térmico, tempo e tempo de incubação em cada experiência é mostrada nas legendas da figura.

2. Dissecção de Larvas

  1. Colecione larvas errantes do terceiro estádio com uma vara de madeira ou fórceps sem corte, goteje-os por marcadores fluorescentes apropriados ( por exemplo , EGFP) sob um microscópio estereoscópico de fluorescência e coloque-os em uma placa de dissecação com PBS (solução salina tamponada com fosfato).
  2. Lave as larvas em PBS por pipetagem com pipetas de transferência de plástico de 2 mL.
  3. Aperte o centro da larva com uma pinça e rasgue o corpo pela metade com a outra pinça.
  4. Aperte o gancho da boca da metade anterior com uma pinça e empurre a boca em direção ao corpo com as outras fórceps para virar o corpo para dentro.
  5. Remova materiais desnecessários, como glândulas salivares ou corpos gordurosos com fórceps.

3. Fixação e coloração de anticorpos

  1. Transfira a metade anterior dissecada do corpo larval (incluindo os discos de asa imaginal) para um tubo de plástico de 1,5 mL e conserte em 1 mL de Solução Fix (4% de Formaldeído em PBS) durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro com rotação suave.
    CUIDADO: O formaldeído é tóxico e possui potencial carcinogênico. Use luvas de proteção e roupas para evitar contato com a pele.
    NOTA: Nesta parte, todas as etapas ocorrem em um nutator à temperatura ambiente no escuro, salvo indicação em contrário.
  2. Remova a solução Fix e descarte. Lave os tecidos com 1 mL de PBT (0,3% de TritEm X-100 em PBS) três vezes por 15 min cada.
  3. Remova o PBT e adicione 1 mL de PBTG (0,2% de albumina de soro bovino e 5% de soro de cabra normal em PBT) para bloquear e introduzir 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
  4. Remova o PBTG e adicione a solução primária de anticorpos adequadamente diluída com PBTG (ver Tabela de Materiais ) e nocaute durante a noite a 4 ° C.
  5. Remova a solução primária de anticorpos e lave os tecidos com 1 mL de PBT três vezes por 15 minutos cada.
  6. Remova PBT e adicione solução de anticorpo secundário adequadamente diluída com PBTG (1: 400). Nutate durante 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
  7. Remova a solução secundária de anticorpos e lave os tecidos com 1 mL de PBT duas vezes por 15 minutos cada.
  8. Para manchar a F-actina, remova PBT e adicione a solução de Phalloidin adequadamente diluída em PBS (1:40). Em seguida, mata por 20 min. Remova a solução de Faloidina e lave os tecidos com 1 mL de PBT duas vezes por 15 minutos cada.
  9. Para contra-endurecer DNA nuclear, remova PBT e adicione solução DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindole) (0,5 μg / mL de DAPI em PBS). Em seguida, entenda 10 min.
    CUIDADO: DAPI possui potencial carcinogênico. Use luvas de proteção e roupas para evitar contato com a pele.
  10. Remova a solução DAPI e lave os tecidos com 1 mL de PBT duas vezes por 15 minutos cada.
  11. Lavar uma vez em 1 mL de PBS durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  12. Remova PBS e adicione 500 μL de 100% de glicerol como meio de pré-montagem.

4. Montagem em lâminas de microscópio

  1. Coloque os tecidos coloridos em um slide de microscópio usando uma pipeta de transferência de plástico de 2 mL.
  2. Transfira os tecidos para gotas de meio de montagem em outro slide de microscópio com fórceps.
  3. Mantenha o fim do tecido dissecado com uma pinça e retire os discos antenais do cérebro e do olho com as outras fórceps.
    NOTA: Mantenha os cérebros dissecados para colocá-los perto dos discos imaginários da asa. Os cérebros atuam como uma plataforma que impede o lamínula de esmagar os discos imaginais da asa.
  4. Para isolar os discos imaginais da asa, mantenha pressionada a extremidade do tecido dissecado com uma pinça e raspe suavemente a parede do corpo e rasgue os discos com as outras fórceps.
    NOTA: Se é difícil encontrar discos imaginais da asa, descasque a traquea do lado posterior ao anterior. Os discos imaginários da asa mantêm a traquéia.
  5. Cubra suavemente os discos imaginais com uma lamínula e selar com esmalte de unhas; Armazenar a 4 ° C.

5. Microscopia confocal

  1. Para adquirir imagens confocais usando um microscópio confocal, configure os parâmetros de aquisição de imagem, incluindo a amplitude de onda de emissão, a intensidade do laser, o ganho, o deslocamento, a velocidade de digitalização e o tamanho da imagem 24 .
    NOTA: Para obter um procedimento detalhado de configurações de aquisição de imagem, consulte o manual de instruções fornecido por cada fabricante de microscópio.
  2. Para capturar um único coSeções nfocais de um disco imaginal inteiro da asa, use uma lente objetiva 20X.
  3. Adquira imagens tridimensionais por varredura de pilha z em tamanho de passo de 0,5 - 1,0 μm usando lentes 40X ou 60X.
    NOTA: Para analisar fenótipos celulares em alta resolução, o tamanho da imagem deve ser maior do que 512 x 512 pixels.

6. Análise de imagens usando ImageJ

  1. Use Fiji, um software ImageJ de código aberto focado na análise de imagens biológicas (https://fiji.sc/) 25 , para adquirir e analisar imagens confocadas de pilhas z.
  2. Para adquirir seções verticais, abra as imagens da pilha z no ImageJ e selecione o item de menu "Imagem / Pilhas / Reslice".
    NOTA: Ou o eixo XZ ou o eixo YZ podem ser selecionados no menu Reslice. A seção vertical pode ser obtida também em uma direção arbitrária, desenhando uma linha reta ou retângulo na imagem da pilha z.

7. Diagnóstico de fenótipos neoplásicos

  1. Abra a verticalSeções (eixo XZ ou YZ) obtidas a partir de um conjunto de imagens de pilhas z e analisam fenótipos morfológicos e coloração de anticorpos.
  2. Para o diagnóstico de fenótipos tumorais, concentre-se principalmente nos seguintes três pontos: (1) se uma massa celular, incluindo clones knockdown, se desvia da camada epitelial principal, (2) se a localização subcelular de proteínas juncionais é alterada nesta massa celular , E (3) se o diâmetro desta massa celular for maior do que 4 células.
  3. Categorize os fenótipos tumorais de acordo com o fluxograma descrito na Figura 1 .

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Resultados

Para demonstrar a formação de tumores neoplásicos induzidos experimentalmente por NTSG-knockdown mediado por RNAi em discos imaginais de asa de Drosophila , foram utilizados três drivers GAL4 diferentes para expressar UAS-RNAi para lgl ou scrib : (1) sd-GAL4, que conduz a expressão forte de UAS no Bolsa de asa e expressão suave nas regiões de dobradiça ( Figura 2 e Figura 3A ...

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Discussão

O sistema GAL4-UAS é uma das ferramentas genéticas mais poderosas para a expressão de genes direcionados em Drosophila 26 e facilita grandemente a indução e análise de células tumorais in vivo 4 . Este sistema permite a geração de clones que suportam os genes supressores de tumores ou a superexpressão de oncogenes no tecido epitelial de tipo selvagem, uma situação altamente semelhante aos estágios iniciais do câncer humano onde as células pro-tumorais tra...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a J. Vaughen pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por bolsas da JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 e The Takeda Science Foundation Research Grant to YT

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes
Fosfato tamponado solução salina (PBS)Wako162-19321
TritonX-100Wako168-11805
FormaldeídoWako064-00406
albumina de soro bovinoSigmaA7906
soro de cabra normalSigmaG6767
meio de montagem, VectashieldVector LaboratoriesH-1000
DAPISigmaD9542
mouse-anti-Dlg 4F3Estudos de Desenvolvimento Hybridoma Bank4F3 anti-discos grandes, RRID:AB_528203diluídos em PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1Developmental Studies Hybridoma Bank3A6B4, RRID:AB_5797803 misturado 1:1:1 e diluído em PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1Developmental Studies Hybridoma Bank3B8D12, RRID:AB_5797813 misturado 1:1:1 e diluído em PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1Developmental Studies Hybridoma Bank5H7B11, RRID:AB_5797793 misturado 1:1:1 e diluído em PBTG, 1:40
mouse-anti<-span class="font13">atubulinaDevelopmental Estudos Hybridoma BankAA4.3, RRID:AB_579793diluído em PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 PhalloidinSondas molecularesA22283diluídas em PBS, 1:40
anticorpo IgG anti-camundongo de cabra, Alexa Fluor 546Sondas molecularesA11030diluídas em PBTG, 1:400
NomeEmpresaNúmero de catálogoComments
Fly strains
sd-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center#8609recombinado com UAS-EGFP
upd-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center#26796recombinado com UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAiVienna Drosophila RNAi center#51247
UAS-scrib-RNAiVienna Drosophila RNAi center#105412
UAS-RasV12Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington#64196
UAS-Yki3SACentro de Estoque de Drosophila de Bloomington#28817
hsFLPCentro de Estoque de Drosophila de Bloomington#6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)Bloomington Drosophila Stock Center#4780recombinado com UAS-EGFP
UAS-EGFPBloomington Drosophila Stock Center#5428cromossomo X
UAS-EGFPBloomington Drosophila Stock Center#6658terceiro cromossomo
UAS-Dicer2Bloomington Drosophila Stock Center# 24650segundo cromossomo
UAS-Dicer2< / em>Bloomington Drosophila Stock Center# 24651terceiro cromossomo
vkg-GFP< / em>Morin et al. 2001GFP armadilha de proteína

Referências

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