A análise do clone de mosaico no epitélio do disco imaginal de Drosophila é um sistema modelo poderoso para estudar os mecanismos genéticos e celulares da tumorigênese. Aqui descrevemos um protocolo para induzir tumores em discos imaginários da asa de Drosophila usando o sistema GAL4-UAS e introduzir um método de diagnóstico para classificar os fenótipos do tumor.
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Artigo de método
Indução e diagnóstico de tumores em
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nos estágios iniciais do câncer, as células mutantes transformadas apresentam anormalidades citológicas, começam o excesso de crescimento descontrolado e interromperam progressivamente a organização do tecido. Drosophila melanogaster emergiu como um sistema modelo experimental popular em biologia do câncer para estudar os mecanismos genéticos e celulares da tumorigênese. Em particular, as ferramentas genéticas para discos imagólicos de Drosophila (desenvolvimento de epitélios em larvas) possibilitam a criação de células pro-tumorais transformadas dentro de um tecido epitelial normal, uma situação semelhante às etapas iniciais do câncer humano. Um estudo recente da tumorigênese em discos imaginários da asa de Drosophila , no entanto, mostrou que a iniciação do tumor depende da citoarquitetura do tecido intrínseco e do microambiente local, sugerindo que é importante considerar a susceptibilidade específica da região aos estímulos tumorigênicos na avaliação de fenótipos tumorais em imaginações Discos. Para facilitar a análise fenotípica do tumor progressiEm discos imaginais, aqui descrevemos um protocolo para experiências genéticas usando o sistema GAL4-UAS para induzir tumores neoplásicos em discos imaginais de asa. Além disso, introduzimos um método de diagnóstico para classificar os fenótipos das lesões clonais induzidas em epitélios imaginais, pois um método de classificação claro para discriminar vários estágios de progressão tumoral (como hiperplasia, displasia ou neoplasia) não havia sido descrito anteriormente. Esses métodos podem ser amplamente aplicáveis à análise clonal de fenótipos tumorais em vários órgãos em Drosophila .
Introdução
Os tecidos epiteliais são sistemas altamente organizados que possuem a habilidade homeostática notável para manter sua organização através do desenvolvimento e do turnover celular. Este robusto sistema de auto-organização, no entanto, é progressivamente interrompido durante o desenvolvimento do tumor. No início do desenvolvimento do tumor, as células mutantes individuais decorrentes da ativação do oncogene ou da inativação do gene supressor de tumor emergem dentro de uma camada epitelial. Quando esta "célula pro-tumoral" transformada evade um ambiente supressivo, interrompe a organização epitelial e começa a proliferação descontrolada, a tumorigênese ocorre
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Protocolo
1. Fly Crosses e Clone Induction
- Remova todas as moscas no frasco 12 h antes de coletar moscas virgens.
- Anestesiar as moscas dentro do recipiente através da injecção de gás de CO2 e voa lugar numa almofada de mosca de CO 2.
- Transfira 10 - 20 fêmeas virgens e 10 machos da almofada de mosca CO 2 para um frasco fresco e incubar durante 1 dia a 25 ° C.
- Transfira essas moscas para um frasco fresco e incube durante 12 h a 25 ° C.
NOTA: Descarte o primeiro frasco para injectáveis, pois as fêmeas virgens não colocam ovos suficientes no primeiro dia. - Para as linhas Enhancer-GAL4, remova....
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Resultados
Para demonstrar a formação de tumores neoplásicos induzidos experimentalmente por NTSG-knockdown mediado por RNAi em discos imaginais de asa de Drosophila , foram utilizados três drivers GAL4 diferentes para expressar UAS-RNAi para lgl ou scrib : (1) sd-GAL4, que conduz a expressão forte de UAS no Bolsa de asa e expressão suave nas regiões de dobradiça ( Figura 2 e Figura 3A .......
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Discussão
O sistema GAL4-UAS é uma das ferramentas genéticas mais poderosas para a expressão de genes direcionados em Drosophila 26 e facilita grandemente a indução e análise de células tumorais in vivo 4 . Este sistema permite a geração de clones que suportam os genes supressores de tumores ou a superexpressão de oncogenes no tecido epitelial de tipo selvagem, uma situação altamente semelhante aos estágios iniciais do câncer humano onde as células pro-tumorais tra.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a J. Vaughen pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por bolsas da JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 e The Takeda Science Foundation Research Grant to YT
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes | |||
| Fosfato tamponado solução salina (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldeído | Wako | 064-00406 | |
| albumina de soro bovino | Sigma | A7906 | |
| soro de cabra normal | Sigma | G6767 | |
| meio de montagem, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Estudos de Desenvolvimento Hybridoma Bank | 4F3 anti-discos grandes, RRID:AB_528203 | diluídos em PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 misturado 1:1:1 e diluído em PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 misturado 1:1:1 e diluído em PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 misturado 1:1:1 e diluído em PBTG, 1:40 |
| mouse-anti<-span class="font13">atubulina | Developmental Estudos Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | diluído em PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Sondas moleculares | A22283 | diluídas em PBS, 1:40 |
| anticorpo IgG anti-camundongo de cabra, Alexa Fluor 546 | Sondas moleculares | A11030 | diluídas em PBTG, 1:400 |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombinado com UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombinado com UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington | #28817 | |
| hsFLP | Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombinado com UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | cromossomo X |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | terceiro cromossomo |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | # 24650 | segundo cromossomo |
| UAS-Dicer2< / em> | Bloomington Drosophila Stock Center | # 24651 | terceiro cromossomo |
| vkg-GFP< / em> | Morin et al. 2001 | GFP armadilha de proteína |
Referências
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K.
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Reimpressões e permissões
