Isolamento de Pericitos Tipo I e Tipo II de Músculos Esqueléticos de Rato

Resumo

Este trabalho descreve um protocolo baseado em FACS que permite o isolamento fácil e simultâneo de pericitos tipo I e tipo II dos músculos esqueléticos.

Resumo

Pericitos são células multipotentes perivasculares que mostram heterogeneidade em diferentes órgãos ou mesmo dentro do mesmo tecido. Nos músculos esqueléticos, há pelo menos duas subpopulações de pericitos (chamadas de tipo I e tipo II), que expressam diferentes marcadores moleculares e possuem distintas capacidades de diferenciação. Utilizando ratinhos duplamente transgénicos NG2-DsRed e Nestin-GFP, os pericitos de tipo I (NG2-DsRed ⁺ Nestin-GFP-) e de tipo II (NG2-DsRed ⁺ Nestin-GFP ⁺ ) foram isolados com sucesso. Contudo, a disponibilidade destes ratinhos duplamente transgénicos impede o uso generalizado deste método de purificação. Este trabalho descreve um protocolo alternativo que permite o isolamento fácil e simultâneo de pericitos tipo I e tipo II a partir de músculos esqueléticos. Este protocolo utiliza a técnica de triagem de células activada por fluorescência (FACS) e alvos PDGFRβ, em vez de NG2, juntamente com o sinal de Nestin-GFP. Após o isolamento, o tipo I e tyOs pericitos II apresentam morfologias distintas. Adicionalmente, os pericitos de tipo I e de tipo II isolados com este novo método, como os isolados a partir de ratinhos duplamente transgénicos, são adipogénicos e miogénicos, respectivamente. Esses resultados sugerem que este protocolo pode ser utilizado para isolar subpopulações de pericitos dos músculos esqueléticos e, possivelmente, de outros tecidos.

Introdução

A distrofia muscular é uma desordem músculo-degenerativa que não tem nenhum tratamento eficaz até agora. O desenvolvimento de terapias que promovem a regeneração de tecidos tem sido sempre de grande interesse. A regeneração e reparação dos tecidos após os danos dependem das células estaminais / células progenitoras residentes ¹ . As células satélites são células precursoras miogénicas comprometidas que contribuem para a regeneração muscular ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 ,}

Protocolo

Os ratinhos transgénicos de tipo selvagem e Nestin-GFP foram alojados na instalação animal na Universidade de Minnesota. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Minnesota e estavam de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Dissecção muscular e isolamento de célula única

1. Euthanize camundongos adultos (6-10 semanas, ambos do sexo masculino e feminino) com tribromoetanol (250 mg / kg, ip) e esterilizar a pele do abdômen com etanol 70%.
   NOTA: O tribromoetanol foi usado aqui em vez de cetamina para anest....

Resultados

Os parâmetros FACS, incluindo a intensidade do laser e a compensação do canal, são corrigidos com base nos resultados de controles sem cor e controles de cor única. O controlo PDGFRβ-PE-FMO é utilizado para definir o gating para a população de PDGFRβ-PE ⁺ ( Figura 1A ). Entre as células PDGFRβ-PE, duas populações que representam as células Nestin-GFP ⁺ e Nestin-GFP estão claramente separadas ( Figura 1A ). .......

Discussão

Os pericitos são células perivasculares multipotentes ^{22 , 23} localizadas na superfície abluminal dos capilares ^{21 , 26} . Nos músculos esqueléticos, os pericitos são capazes de diferenciar ao longo das vias adipogénicas e / ou miogénicas ^{19 , 20 , 24} . Estudos recentes revelaram duas subpopulações de pericitos, .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Classificador de Células	Sony	SH800
Configuração Automática de Contas	Sony	LE-B3001
DMEM	Gibco	11995
Avertin	Sigma	T48402
Meio de Crescimento de Perócitos	ScienCell	1201
MSC Basal Medium (Mouse)	Stemcell Technologies	5501
Suplemento Estimulador Adipogênico (Mouse)	Stemcell Technologies	5503
Soro Fetal Bovino	Gibco	16000
Soro de Cavalo	Sigma	H1270
Colagenase Tipo 2	Worthington	LS004176
0,25% Tripsina/EDTA	Gibco	25200
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140
PDL	Sigma	P6407
PDGFRβ-PE Anticorpo	eBioscience	12-1402
Anticorpo Perilipin	Sigma	P1998
Anticorpo S-Miosina	DSHB	MF-20
Alexa 555-anti-coelho anticorpo& nbsp;	ThermoFisher Scientific	A-31572
Alexa 555-anti-mouse anticorpo	ThermoFisher Scientific	A-31570
Meio de montagem com DAPI	Vector Laboratories	H-1200
DAPI	ThermoFisher Scientific	D1306
HEPES	Gibco	15630
EDTA	Fisher	BP120
BSA	Sigma	A2058
NH4Cl	Fisher Scientific	A661
KHCO3	Fisher Scientific	P184
PBS	Gibco	14190
18 G Agulhas	BD	305196
10 mL Pipeta sorológica	BD	357551
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111