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Varredura Retroviral: Mapeamento de sites de integração MLV para definir regiões reguladoras específicas de células

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DOI:

10.3791/55919

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28 de maio de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genome Research, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, 2Laboratory of Chromatin and Gene Regulation During Development, Imagine Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, CNR, 4Généthon, 5Sorbonne Paris Cité - Université Paris Descartes

Neste artigo

Resumo

Descrevemos aqui um protocolo para o mapeamento gen�ico dos s�ios de integra�o de vectores retrovirais baseados em v�us de leucemia murina de Moloney em c�ulas humanas.

Resumo

Os vectores retrovirais baseados em vírus da leucemia murina de Moloney (MLV) integram-se predominantemente em intensificadores e promotores acetilados. Por esta razão, os locais de integração mLV podem ser utilizados como marcadores funcionais de elementos reguladores activos. Aqui, apresentamos uma ferramenta de varredura retroviral, que permite a identificação genoma-wide de potenciadores e promotores específicos de células. Resumidamente, a população de células alvo é transduzida com um vector derivado de mLV e o ADN genómico é digerido com uma enzima de restrição de corte frequente. Após ligação dos fragmentos genómicos com um ligador de ADN compatível, a reacção em cadeia da polimerase mediada por ligante (LM-PCR) permite a amplificação das junções do genoma do vírus-hospedeiro. A sequenciação maciça dos amplicões é utilizada para definir o perfil de integração de mLV em todo o genoma. Finalmente, agrupamentos de integrações recorrentes são definidos para identificar as regiões reguladoras específicas de células, responsáveis ​​pela ativação de programas de transcrição específicos de células.

por exemplo , células estaminais somáticas) que não possuem marcadores robustos para isolamento prospectivo.

Introdução

A identidade celular é determinada pela expressão de conjuntos específicos de genes. O papel dos elementos reguladores cis, tais como promotores e intensificadores, é crucial para a activação de programas de transcrição específicos do tipo celular. Estas regiões reguladoras são caracterizadas por características específicas da cromatina, tais como modificações peculiares das histonas, factores de transcrição e ligação dos co-factores e acessibilidade à cromatina, que têm sido amplamente utilizados para a sua identificação genómica em vários tipos de células 1 , 2 , 3 . Em particular, o perfil gen�ico de acetila�o da histona H3 lisina 27 (H3K27ac) � comummente utilizado para definir promotores activos, potenciadores e super-potenciadores 4 , 5 , 6 .

O vírus da leucemia murina de Moloney (MLV) é um gamma-retrovírus que é amplamente utilizado para o geneTransferência em células de mamíferos. Depois de infectar uma célula alvo, o genoma retroviral de ARN é retrotraducido numa molécula de ADN de cadeia dupla que se liga a proteínas virais e celulares para montar o complexo de pré-integração (PIC). O PIC entra no núcleo e liga a cromatina da célula hospedeira. Aqui, a integrase viral, um componente PIC chave, medeia a integração do ADN proviral no genoma da célula hospedeira. A integração de mLV no DNA genómico não é aleatória, mas ocorre em elementos reguladores cis-activos, tais como promotores e intensificadores, numa forma específica de célula 7 , 8 , 9 , 10 . Este perfil de integração peculiar é mediado por uma interacção directa entre a integrase de mLV e as proteínas do domínio do bromodominio celular e do domínio extraterminal (BET) 11 , 12 , 13 . As proteínas BET (BRD2, BRD3 eBRD4) atuam como uma ponte entre a cromatina do hospedeiro e o PIC mLV: através de seus bromodominios eles reconhecem regiões reguladoras cis altamente acetiladas, enquanto que o domínio extraterminal interage com a integrase mLV 11 , 12 , 13 .

Aqui, descrevemos a varredura retroviral, uma nova ferramenta para mapear regiões cis-reguladoras ativas com base nas propriedades de integração de mLV. Resumidamente, as células são transduzidas com o vector retroviral derivado de mLV que expressa o gene repórter de proteína fluorescente verde aumentada (eGFP). Após a extracção do ADN genómico, as junções entre a repetição terminal longa (LTR) 3 'do vector mlV e o ADN genómico são amplificadas por PCR (LM-PCR) mediada por ligantes e sequenciadas maciçamente. Os locais de integração de mLV são mapeados para o genoma humano e as regiões genómicas altamente direccionadas por mLV são definidas como agrupamentos de locais de integração de mLV.

Varredura retroviralNing foi usado para definir elementos específicos reguladores de células específicas em várias células primárias humanas 14,15. MLV co-mapeados com promotores epigenicamente definidos e potenciadores, a maioria dos quais abrigou marcas de histonas activas, tais como H3K27ac, e foram específicos de células. A varredura retroviral permite a identificação genômica de elementos reguladores do DNA em populações de células purificadas prospectivamente 7,14 , bem como em populações celulares retrospectivamente definidas, como as células-tronco de queratinócitos, que carecem de marcadores efetivos para o isolamento prospectivo 15 .

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Protocolo

1. Transdução MLV de Células Humanas

  1. Isolar as c�ulas alvo e transduzi-las com um vector retroviral derivado de mLV contendo o gene rep�ter eGFP e pseudotipado com o VSV-G de estomatite vesicular ou a glicoprote�a de envelope anfotr�ico 16 .
    1. Manter as células simuladas transduzidas como um controlo negativo para as seguintes análises. Uma vez que os vectores retrovirais baseados em mLV podem transduzir células de divisão eficiente, cultivar a população de células alvo em condições que estimulam a divisão celular. As condições de transdução precisam ser especificamente optimizadas para cada tipo de célula em estudo. As condições de crescimento celular e transdução para progenitores hematopoiéticos humanos, células T e células epidérmicas estão descritas nas Referências 7, 14, 15 e 17.
  2. 48 h após a transdução, ressuspender 100 000 células em 300 μL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) contendo 2% de soro bovino fetal e medir a expressão de eGFP por fBaixa citometria (laser de excitação de 488 nm). Utilizar células transduzidas de forma simulada como controlo negativo. Para a recuperação ideal do local de integração, purifique as células GFP + por Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS).
  3. Recolher 0,5 a 5 milhões de células para a preparação de DNA genômico. É preferido um período de cultura mais longo (> 7 dias) para diluir o provírus não integrado e necessário quando se analisa a progénie a longo prazo de células estaminais de boa fé (ver Secção de Discussão e referência 15 ). Os grânulos de células podem ser congelados instantaneamente e armazenados a -80 ° C até à sua utilização.

2. Amplificação dos locais de integração de mLV por PCR ligada a ligante (LM-PCR)

  1. Preparação de ADN genómico (gDNA)
    1. Extrair gDNA usando um kit de extração de DNA baseado em coluna e seguir o protocolo para células cultivadas, de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Enzima de restrição digestiem
    1. Preparar 4 digestões de enzimas de restrição por amostra em tubos de 1,5 mL. Digerir 0,1 a 1 μg de gDNA em cada tubo adicionando 1 μL de Tru9I (10 U) e 1 μL de Tampão M num volume final de 10 μL. Incubar as reacções a 65 ° C durante 6 h ou durante a noite.
    2. Adicionar a cada reacção 1 μL de PstI (10 U), 1 μL de Tampão H e 8 μL de água. Incubar as reacções a 37 ° C durante 6 h ou durante a noite. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas.
  3. Ligação ligante
    1. Preparar uma solução de reserva de ligante Tru9I 100 μM num tubo de 1,5 mL misturando os oligonucleótidos de cadeia mais ligante e ligante menos cadeia a uma concentração de 100 μM. Colocar o tubo em água a 100 ° C e deixar arrefecer à temperatura ambiente. A solução stock do ligante Tru9I pode ser armazenada a -20 ° C até à sua utilização.
    2. Estabelecer 8 reações ligadura linker em tubos de 1,5 mL. Para cada reacção, adicione o seguinte componenteS a 10 μL de digestão com enzima de restrição: 1,4 μL de tampão de reacção de 10X T4 ADN Ligase, 1 μL de ligante Tru9I 10 μM, 1 μL (2 000 U) de T4 DNA ligase e 0,6 μL de água. Incubar a 16 ° C durante 3 a 6 h. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas.
  4. Primeiro PCR
    1. Estabelecer 48 reações de PCR (6 reações de cada tubo de ligação) em tubos de 0,2 mL. Para cada PCR, adicionar os seguintes reagentes a 2 μL de reacção de ligação: 5 μL de tampão de PCR 10X, 2 μL de Sulfato de Magnésio 50 mM, 1 μL de Mistura de desoxinucleótido 10 mM (dNTP), 1 μL de iniciador ligante 10 μM, 1 ΜL de iniciador LTR mLV-3 '10 μM, 0,3 μL (1,5 U) de Taq DNA Polimerase e 37,7 μL de água. As sequências de iniciadores são fornecidas na Tabela 1.
    2. Realizar a reacção de PCR num ciclador térmico com tampa aquecida, como se segue: 95 ° C durante 2 min; 25 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min; 72 °; C durante 5 min; Mantenha a 4 ° C. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas.
  5. Segunda PCR
    1. Configure 48 reações de PCR (1 de cada "primeiro tubo de PCR") em tubos de 0,2 mL. Para cada PCR, adicione os seguintes componentes a 2 μL da primeira reacção de PCR: 5 μL de tampão de PCR 10X, 2 μL de Sulfato de Magnésio 50 mM, 1 μL de Mistura de dNTP 10 mM, 1 μL de iniciador aninhado 10 μM, 1 Μl de iniciador aninhado mLV-3 'LTR 10 μM, 0,3 μL de Taq DNA Polimerase (1,5 U) e 37,7 μL de água. Use iniciadores aninhados projetados para a estratégia de seqüenciamento maciça específica escolhida: (i) iniciador aninhado de ligante e iniciador aninhado mLV-3 'LTR compatível com a plataforma Illumina; (Ii) iniciador aninhado de ligante e iniciador aninhado mLV-3 'LTR compatível com a plataforma Roche. As sequências de iniciadores estão listadas na Tabela 1 .
    2. Realizar a reacção de PCR num ciclador térmico com tampa aquecida, como se segue: 95 ° C durante 2 min; 25Ciclos de 95 ° C durante 15 s, 58 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min; 72 ° C durante 5 min; Mantenha a 4 ° C. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas.
    3. Juntar as 48 reacções de PCR aninhadas num tubo de 15 mL (volume final de ~ 2,4 mL). As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas.
  6. Determinar a presença e o tamanho dos produtos LM-PCR por electroforese em gel de agarose.
    1. Adicionar 4 μL de tampão de carga a 20 μL de produtos de LM-PCR e carregar a amostra num gel de agarose a 1%, juntamente com uma escada de DNA de 100 pb. Executar o gel a 5 V / cm durante 30 a 60 min e visualizar os produtos de PCR por coloração com brometo de etídio.
    2. Executar uma reacção de LM-PCR a partir da amostra transduzida de forma simulada como controlo negativo.
  7. Precipitar os amplicões adicionando 0,1 volumes de solução de acetato de sódio (3 M, pH 5,2) e 2,5 volumes de etanol a 100%. Misturar e congelar a -80 ° C durante 20 min.
    1. Girar em fuLl em uma microcentrífuga padrão a 4 ° C por 20 min. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com etanol a 70%. Girar à velocidade máxima numa microcentrífuga padrão a 4 ° C durante 5 min.
    2. Descartar o sobrenadante e secar ao ar a pastilha. Adicionar 200 μL de água de grau PCR e ressuspender o DNA. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas.
  8. Adicionar 20 μL de tampão de carga a 100 μL dos produtos LM-PCR e carregar a amostra num gel de agarose a 1%, juntamente com uma escada de ADN de 100 pb.
    1. Executar o gel a 5 V / cm durante 30 a 60 min e cortar a porção do gel contendo 150 a 500 pb de comprimento amplicons.
    2. Purificar os produtos LM-PCR com um kit de extração de gel à base de coluna e medir a concentração usando um espectrofotômetro UV.
  9. Utilizar 1 μL de biblioteca para avaliar o comprimento dos produtos LM-PCR utilizando um instrumento bioanalisador, de acordo com as instruções do fabricante.
  10. Clonagem de espingardas de amplicons
    1. Utilizar 20 ng dos produtos LM-PCR purificados e cloná-los no vector pCR2.1-TOPO, de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Efectuar reacções de sequenciação utilizando o iniciador M13 Universal, seguido de mapeamento genómico das sequências resultantes, para revelar a presença das junções do genoma viral (incluindo o iniciador aninhado LTR mLV-3 ') em> 50% dos clones para identificar amostras adequadas Para sequenciamento maciço. Exemplo de uma junção viral-genoma:
      figure-protocol-1
      O iniciador aninhado MLV-3 'LTR 454 e o iniciador aninhador ligador 454 ( Tabela 1 ) estão indicados em negrito e a extremidade 3' da LTR viral em itálico. A sequência genómica humana é realçada em texto vermelho (chr10: 6439408-6439509, hg19).

3. Seqüenciamento maciço de sites de integração mLV

NOTA: Produtor LM-PCRPodem ser sequenciados usando plataformas comerciais (escolhendo o par de iniciadores aninhados apropriado na segunda reação de PCR, veja a subseção 2.5.1). Para seqüenciamento pela plataforma de pirosequenciação Roche GS-FLX, consultar os artigos anteriores 7 , 14 , 15 . Nesta seção, um protocolo recém-otimizado para a plataforma de sequenciamento Illumina é descrito.

  1. Preparação da biblioteca
    1. Estabelecer 1 reação de PCR de indexação por amostra em tubos de 0,2 mL. Para cada PCR, adicionar os seguintes reagentes a 5 μL (150-170 ng) de produto de LM-PCR purificado: 5 μL de Index Primer 1, 5 μL de Index Primer 2, 25 μL de 2X Master Mix e 10 μL de PCR- Grau água. Use uma combinação de índice diferente para cada amostra.
    2. Realizar as reacções de PCR num termociclador com tampa aquecida, como se segue: 95 ° C durante 3 min; 8 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 30 s; 72 ° C durante 5 mdentro; Mantenha a 4 ° C.
    3. Purificar os produtos de PCR utilizando um protocolo de isolamento de grânulos de imobilização reversível em fase sólida (SPRI): em tubos novos de 1,5 mL, adicionar 56μL de esferas a cada amostra e seguir as instruções do fabricante. Eluir em 25 μL de Tris-HCl 10 mM. As bibliotecas podem ser armazenadas a -20 ° C até à sua utilização.
  2. Verificação de biblioteca
    1. Utilizar 1 μL de amostra para avaliar o tamanho da biblioteca utilizando um instrumento de bioanálise.
    2. Utilizar 1 μL de amostra para quantificar a molaridade da biblioteca utilizando um ensaio de PCR em tempo real baseado em fluorescência, de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Diluição e sequenciação da biblioteca
    1. Diluir as bibliotecas até 10 nM utilizando Tris-HCl 10 mM. Para pooling bibliotecas, transferir 5 μL de cada biblioteca diluída para um novo tubo de 1,5 mL e, em seguida, diluir o pool para 4 nM em Tris-HCl 10 mM.
    2. Misture 5 μL de solução diluída com 5 μL de NaOH 0,2 N em uma nova solução de 1,5 mL tubo, vórtice brevemente, spin-down e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para desnaturar as bibliotecas.
    3. Coloque os tubos em gelo e adicione 990 μL de tampão de hibridização pré-refrigerado (HT1). Alíquota 300 μL de pool desnaturado em um novo tubo de 1,5 mL e adicione 300 μL de HT1 pré-resfriado para obter um pool de biblioteca final de 10 pM.
    4. Em paralelo, misturar 2 μL de biblioteca de controlo PhiX (10 nM) com 3 μL de Tris-HCl 10 mM num tubo de 1,5 mL. Adicionar 5 μL de NaOH 0,2 N, agitar vortex brevemente, centrifugar e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para desnaturar a PhiX diluída. Coloque o tubo em gelo e adicione 990 μL de HT1 pré-resfriado.
    5. Alíquota de 300 μL de PhiX desnaturado num novo tubo de 1,5 mL e adicione 300 μL de HT1 pré-arrefecido para obter uma PhiX final de 10 μM.
    6. Num novo tubo de 1,5 mL, misturar 510 μL de pool de biblioteca desnaturado com 90 μL de biblioteca PhiX desnaturada, obtendo-se assim um pool final de 10 μM com 15% de controlo PhiX.
    7. Pipetar estes 600 μL de amostraVolume no reservatório de amostra de carga do cartucho de reagente de sequencia�o descongelado e prosseguir imediatamente para executar um ciclo de 150 ciclos.
      NOTA: Os reagentes críticos e sequências de iniciadores necessários para este protocolo estão listados na Tabela 1 .

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Resultados

Fluxo de trabalho do procedimento de varredura retroviral

O fluxo de trabalho do procedimento de varrimento retroviral é esquematizado na Figura 1 . A população de células alvo é purificada e transduzida com um vector retroviral derivado de mLV que expressa um gene repórter eGFP. O transgene é flanqueado pelas duas repetições terminais longas idênticas (5 'e 3' LTR), assegurando a síntese, a ...

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Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo para genoma de todo o mapeamento dos locais de integração de mLV, um retrovírus que metas regiões cromatina, epigenicamente marcado como promotores ativos e potenciadores. As etapas críticas e / ou limitações do protocolo incluem: (i) a transdução mLV da população de células alvo; (Ii) amplificação de junções vírus-hospedeiro por LM-PCR; (Iii) recuperação de uma fração elevada de locais de integração. Os vectores retrovirais baseados em mLV transduzem eficientemente células em divisão. A b...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subvenções do Conselho Europeu de Investigação (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), do Ministério italiano da Educação, Universidades e Investigação (FIRB-Futuro em Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro em Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), o Ministério Italiano da Saúde (Jovens Pesquisadores Chamam 2011 GR-2011-02352026) ea Imagine Institute Foundation (Paris, França).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PBS, pH 7.4ThermoScientific10010031ou equivalente
Soro Fetal BovinoThermoScientific16000044ou equivalente
Tubos de 0,2 mlfornecedor
Tubos de 1,5 mlfornecedor
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit QIAGEN51306ou
equivalente T4 DNA ligase England BioLabsM0202T
T4Ligante New England BioLabsM0202T
Fornecedorde oligonucleotídeos de fita5'-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3'   (Grau de purificação: SDS-PAGE)
de laboratório geralde oligonucleotídeos de fio 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (Grau de purificação: SDS-PAGE)
Tru9IRoche-Sigma-Aldrich11464825001
SuRE/Cut Buffer MRoche-Sigma-Aldrich11417983001
PstI Roche-Sigma-Aldrich10798991001
SuRE/Cut Buffer HRoche-Sigma-Aldrich11417991001
Platinum Taq DNA Polimerase Alta Fidelidade Invitrogen11304011
10 mM dNTP MixInvitrogen18427013ou equivalente
PCR grau de águade laboratório
Termociclador de 96 poços (com tampa aquecida)fornecedor
linker primerfornecedor geral de laboratório5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (Grau de purificação: grau PCR)
MLV-3' Fornecedor5'-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3' (Grau de purificação: grau PCR)
linker aninhado primer 454de laboratório geral5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG [AGGGCTCCGCTTAAGGGAC] (grau de purificação: SDS-PAGE)
MLV-3 ' LTR aninhado primer 454de laboratório geral5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC [GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC] (Grau de purificação: SDS-PAGE)
linker aninhado primer Illuminafornecedor de laboratório5 '-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC] (Grau de purificação: SDS-PAGE)
MLV-3 ' Primer aninhado LTR Illuminade laboratório geral5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Grau de purificação: SDS-PAGE)
Solução de acetato de sódio (3M) pH 5.2fornecedor
Etanol (absoluto) para biologia molecularSigma-AldrichE7023ou
equivalente Topo TA Kit de clonagem (com vetor pCR2.1-TOPO)InvitrogenK4500-01
Kit de extração de gel QIAquickQIAGEN28704
AgaroseSigma-AldrichA9539ou
brometo de etídio equivalente Sigma-AldrichE1510ou equivalente
100 bp DNA ladderInvitrogen15628019ou equivalente
6x Loading BufferThermoScientificR0611ou equivalente
NanoDrop 2000 UV-Vis SpectrophotometerThermoScientificND-2000
Nextera XT Index kitIlluminaFC-131-1001 ou FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix KAPA BiosystemsKK2601
Suporte magnético Dynal para tubos de 2 mlInvitrogen12321Dou equivalente
Kit Agencourt AMPure XP 60 mlBeckman Coulter GenomicsA63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5fornecedor
Agilent 2200 Sistema TapeStationAgilent TechnologiesG2964AAou equivalente
D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5582ou equivalente
D1000 ReagentesAgilent Technologies5067-5583ou equivalente
KAPA Library Quantification Kit para plataformas Illumina (ABI Prism)KAPA BiosystemsKK4835
ABI Prism 7900HT Sistema de PCR em Tempo Real RápidoApplied Biosystems4329003
NaOH 1.0 N, molecular de laboratório geral
HT1 (Tampão de Hibridização)Illumina Fornecido no Kit
MiSeq Kit de Reagentes MiSeq v3 (150 ciclos)IlluminaMS-102-3001
Sistema MiSeqIlluminaSY-410-1003
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
de laboratório geralde laboratório geralTampão de reação de DNA ligase New Plus de laboratório geralLigante menos fornecedor fornecedor geralgeral de laboratório geral de laboratório de primer LTR fornecedor fornecedor geral fornecedor de laboratório geralde laboratório geral fornecedor de grau biológicode Reagentes

Referências

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