Artigo de método

Modelos experimentais para estudar a neuroproteção do pós-condicionamento ácido contra a isquemia cerebral

DOI:

10.3791/55931

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31 de julho de 2017

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1Institute of Pharmacology & Toxicology, College of Pharmaceutical Sciences, Department of Pharmacology, Key Laboratory of Medical Neurobiology of The Ministry of Health of China, Zhejiang Province Key Laboratory of Neurobiology, Zhejiang University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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O pós-condicionamento ácido protege contra a isquemia cerebral. Aqui apresentamos dois modelos para executar a APC. Eles são obtidos, respectivamente, transferindo fatias corticostriatais para o tampão ácido após a privação de oxigênio-glicose in vitro e pela inalação de 20% de CO 2 após a oclusão da artéria cerebral média in vivo .

Resumo

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O acidente vascular cerebral é uma das principais causas de mortalidade e incapacidade em todo o mundo, com abordagens terapêuticas limitadas. Como uma estratégia endógena para a neuroproteção, os tratamentos pós-condicionamento provaram ser terapias promissoras contra a isquemia cerebral. No entanto, procedimentos complicados e possíveis problemas de segurança limitam sua aplicação clínica. Para superar estas desvantagens, desenvolvemos pós-condicionamento ácido (APC) como terapia para isquemia cerebral focal experimental. APC refere-se ao tratamento de acidose leve por inalação de CO 2 durante a reperfusão após isquemia. Aqui apresentamos dois modelos para executar APC in vitro e in vivo , respectivamente. O tratamento de privação de oxigênio-glicose (OGD) de camundongos e a oclusão corticostriatal e oclusão da artéria cerebral média (MCAO) de camundongos foram empregados para imitar a isquemia cerebral. APC pode ser simplesmente conseguido através da transferência de fatias de cérebro para tampão ácido borbulhado com 20% de CO 2 , oR por camundongos que inalam 20% de CO 2 . A APC mostrou efeitos protetores significativos contra a isquemia cerebral, como reflete a viabilidade do tecido e o volume do infarto cerebral.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O acidente vascular cerebral é uma das principais causas de mortalidade e incapacidade em todo o mundo. Grandes esforços foram feitos para encontrar tratamentos efetivos para AVC nas últimas décadas, no entanto, a conquista é bastante insatisfatória. O pós-condicionamento é um processo manipulado por tensões subtoxicas após um episódio isquêmico. O pós-condicionamento, incluindo o pós-condicionamento isquêmico, hipóxico, baixo teor de glicose e remoto, desencadeia mecanismos adaptativos endógenos e provou ser terapias promissoras contra a isquemia cerebral 1 , 2 , 3 , 4 . Contudo, o pós-condicionamento isquêmico pode introduzir lesões adicionais. O pós-condicionamento isquêmico remoto dos membros geralmente precisa de vários ciclos de 5 a 20 min de oclusão e reperfusão nos membros traseiros ipsilaterais ou bilaterais 5 , 6 , 7 . ºPortanto, essas manipulações pós-condicionamento são perigosas ou impraticáveis ​​na prática clínica. Para superar essas desvantagens, desenvolvemos APC como terapia para isquemia cerebral focal em camundongos 8 . Induzido simplesmente por inalação de 20% de CO 2 , APC reduz significativamente a lesão cerebral isquêmica de uma maneira mais viável e segura. Recentemente, provamos que a APC estende a janela de reperfusão, destacando o significado da APC para terapia de AVC 9 .

Aqui apresentamos dois modelos experimentais para estudar a neuroproteção de APC contra isquemia cerebral. O primeiro é o modelo de privação de oxigênio-glicose (OGD) em fatias corticostriatais de camundongos. A rápida preparação e transferência das fatias do cérebro para um ambiente artificial, geralmente fluido cerebrospinal artificial (ASCF), pode manter a viabilidade celular e circuitos neuronais, o que possibilita o estudo da função cerebral in vitro 10 11 . OGD em ASCF imita a isquemia cerebral e induz a lesão isquêmica 12 , 13 , 14 . Após OGD, as fatias de cérebro são atualizadas em ASCF (r-ASCF) regulares para fornecer reperfusão e depois tratadas com APC usando ASCF ácido borbulhou com 20% de CO 2 . A fatia corticostriatal mantém a caracterização histológica intacta em comparação com células primárias cultivadas.

Para estudar a função cerebral in vivo , emprega-se o modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) do mouse. A artéria cerebral média é bloqueada pela inserção de um monofilamento inflamado através da artéria carótida comum. Como um dos modelos de AVC mais amplamente utilizados, o modelo MCAO mostra relevância clínica e a aplicação de um monofilamento torna mais fácil a reperfusão. Simplesmente pela inalação de gases mistos normoxicos contendo 20% de CO 2 após o início do reperfusioN, a APC mostrou efeitos protetores significativos contra a isquemia cerebral indicada por volumes reduzidos de infarto cerebral.

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Protocolo

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Todos os experimentos foram aprovados e conduzidos de acordo com as diretrizes éticas do Comitê de Experimentação Animal da Universidade de Zhejiang e estavam em completa conformidade com os Institutos Nacionais de Guia de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Foram feitos esforços para minimizar qualquer dor ou desconforto, e o número mínimo de animais foi usado.

1. OGD de fatias Corticostriatal

  1. Preparação da solução:
    1. Preparar 1000 ml de r-ACSF (124 mmol / L, NaCl, 5 mmol / L de KCl, 1,25 mmol / L KH 2 PO 4, 2 mmol / L de MgSO4, 26 mmol / L NaHCO3, 2 mmol / L de CaCl 2, 10 mmol / L de glicose, pH final 7,4). Bolha com 5% de CO 2 e 95% de O 2 ao longo da experiência.
    2. Preparar 200 mL ACSF sem glicose (GF-ACSF) como acima mas excluindo a glucose, borbulhar com 5% de CO 2 e 95% de N2. Bolha os gases por 30 min antes de aplicar para brEm fatias para reduzir o teor de oxigênio na solução. Continue borbulhando até o procedimento OGD terminar.
    3. Prepare ácida ACSF (a-ACSF) equilibrando 200 ml de r-ACSF com 20% de CO 2 e 80% de O 2. Bolha os gases durante 30 minutos antes de aplicar a fatias do cérebro para reduzir o pH da solução para pH 6.8 e continuar borbulhando até o procedimento APC terminar.
    4. Coloque três suportes de tecido em r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF, respectivamente.
  2. Preparação da fatia do cérebro:
    Nota: foram utilizados camundongos C57Bl / 6J de oito semanas de idade neste estudo. Os animais foram alojados sob temperatura controlada (22 ± 2 ° C), com um período de ciclo de luz-escuro de 12 h e acesso a alimentos e água com sedimentos.
    1. Sacrifique um mouse com uma overdose de isoflurano em uma câmara de indução. Decapite o mouse. Dissecesse o cérebro usando pequenas tesouras e fórceps. Remova o cérebro com uma espátula fina e coloque-o cuidadosamente em um copo de vidro comtenção gelada r-ACSF equilibrada com 5% de CO 2 e 95% de O 2.
      NOTA: Estas etapas devem ser feitas de forma rápida, mas meticulosamente possível.
    2. Mantenha o cérebro no r-ACSF gelado por 5 min. Ajuste a pressão do gás para evitar movimentos do cérebro.
    3. Coloque cola de crioprecipitado na placa de vibração em duas tiras. Coloque um pedaço de agarose a 3% sobre a tira de cola para longe da lâmina para suportar o cérebro.
    4. Inverta uma placa de Petri de 10 cm sobre gelo e depois coloque um papel de filtro no prato. Humedecer o papel de filtro com gotas de r-ACSF geladas.
    5. Transfira o cérebro para o papel de filtro com fórceps. Corte o poste frontal e o cerebelo com lâmina e pinça.
      NOTA: As seções transversais devem ser tão lisas quanto possível e vertical para o plano sagital.
    6. Coloque o tecido cerebral restante verticalmente sobre a outra tira de cola e mantenha o cérebro encostado à agarose. Adicione o r-ACSF gelado ao reservatório de corte paraMergulhe o cérebro e adicione gelo na área do suporte de gelo. Manter o r-ACSF no reservatório borbulhar com 5% de CO 2 e 95% de O 2.
    7. Levante o reservatório e ajuste a posição da navalha para colocar a navalha tão perto do cérebro quanto possível e logo acima do cérebro.
    8. Escolha o modo "CONT" para cortar as seções do cérebro continuamente. Defina a espessura de corte para 400 μm, a freqüência de vibração para 6 a 8 e a velocidade para 3 - 4. Pressione o botão "iniciar / parar" para iniciar o corte automático.
    9. Corte a ponta de uma pipeta Pasteur de 3 mL para fazer uma abertura correspondente ao tamanho das fatias do cérebro.
      NOTA: A abertura deve ser grande o suficiente para evitar danos adicionais nas fatias do cérebro.
    10. Extrair cinco fatias de cérebro de um por um, com a pipeta de ponta-cutPasteur e colocá-los no suporte do tecido em gelada r-ACSF borbulhar com 5% de CO 2 e O 2 95%. Não colete a primeira fatia produzida. Ajuste a pressão do gás para avoiD movimentos das fatias do cérebro.
      NOTA: As fatias do cérebro não devem cobrir uma a outra.
    11. Coloque fatias de cérebro com r-ACSF à temperatura ambiente durante 30 min e depois a 37 ° C em banho-maria por mais 10 min para recuperar funções sinápticas.
  3. OGD e APC:
    1. Coloque gf-ACSF e a-ACSF em um banho-maria a 37 ° C e borbulhe os tampões com os gases correspondentes, conforme mencionado acima em 1.1.2 e 1.1.3 durante 30 min.
    2. Deixe uma fatia no r-ACSF como um controle. Transfira as outras quatro fatias de cérebro no suporte de tecido com gf-ACSF pré-aquecido com cuidado e incube durante 15 min. Transfira as fatias de volta para o suporte de tecido em r-ACSF para obter reperfusão.
    3. Para estudar a janela de tempo da APC, transfira uma fatia diretamente de gf-ACSF para a-ACSF. Transfira as outras três fatias para o r-ACSF em primeiro lugar, e depois transfira duas delas para o suporte de tecido em a-ACSF 5 e 15 min após a reperfusão, respectivamente.
    4. IncubatE as duas fatias em a-ACSF por 3 min e depois transferi-las de volta para r-ACSF. Incube as três fatias em r-ACSF por mais 1 h. Defina as restantes fatias no r-ACSF como o grupo OGD.
    5. Para um estudo de resposta à dose, transferir as quatro fatias para o suporte de tecido em r-ACSF no início após OGD e incubar durante 5 min. Em seguida, deixe uma fatia no r-ACSF como o grupo OGD e transfira as outras três fatias para a-ACSF. Incubar as fatias em a-ACSF por 1, 3 e 5 min, respectivamente, e depois transferi-las para r-ACSF. Incube as três fatias em r-ACSF por mais 1 h.
  4. Determinação da viabilidade da fatia:
    1. Preparar 0,25% de solução salina normal de cloridrato de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC). Adicione 1,25 g de pó de TTC a 500 ml de solução salina normal.
      NOTA: Depois que o pó se dissolver completamente, transfira a solução para uma placa de 24 poços (500 μL por poço) coberta de papel alumínio e guarde-a a 4 ° C. TTC e tecido corado com TTC são light senSitive.
    2. Transfira as fatias para uma placa de 24 poços (uma fatia por poço) contendo solução de TTC e estique a fatia na solução. Incubar as fatias na solução de TTC a 37 ° C num banho de água pouco profunda durante 30 min.
    3. Transfira as fatias para limpar os tubos de centrífuga de 1,5 mL cobertos com papel alumínio e medir o peso seco das fatias.
    4. Adicionar etanol / sulfóxido de dimetilo (1: 1) nos tubos da centrífuga (v: w = 10: 1) para extrair o formazan. Incubar as fatias em etanol / dimetilsulfóxido à temperatura ambiente longe da luz durante 24 h.
    5. Adicione todo o etanol / sulfóxido de dimetilo nos tubos em uma placa de 96 poços e mede a absorvância a 490 nm por um leitor de placas.
    6. Normalize a absorvância para o peso seco da fatia e viabilidade expressa como a porcentagem da fatia de controle.

2. MCAO

  1. Preparação:
    1. Desinfecte o banco de trabalho, a superfície do Doppler Laser FlowmetrY (LDF) e seus acessórios com 70% de álcool etílico.
    2. Preparar instrumentos autoclavados: duas tesouras, 10 cm; Duas fórceps, 10 cm; Uma pinça oftálmica, 11 cm; Uma tesoura micro oftálmica, 9 cm; Uma braçadeira de microvento, 1,8 cm; Oneneedle drive, r 12,5 cm; Várias suturas cirúrgicas (△ 1/2 4 × 10); cotonetes.
    3. Prepare uma seringa (sem agulha) com solução salina para manter uma área de operação hidratada.
    4. Prepare o gás de anestesia (100% O 2 + isoflurano).
  2. Detecção do fluxo sanguíneo cerebral:
    1. Configure o instrumento LDF.
    2. Injete analgésicos por via intraperitoneal no mouse: metamizol 200 mg / kg, carprofen 4 mg / kg e buprenorfina 0,1 mg / kg.
    3. Coloque o mouse em uma câmara de indução com 4% de isoflurano em oxigênio para anestesiar até que o movimento espontâneo do corpo e a vibração parem.
    4. Coloque o mouse em posição inclinada com o nariz encaixado naE cone de nariz e manter isoflurano a 1,5% para o procedimento subseqüente.
    5. Aplique pomada de dexpantenol em ambos os olhos.
    6. Desinfecte a cabeça com 70% de álcool etílico.
    7. Faça uma incisão da pele paramediana direita entre olhos e ouvidos usando um bisturi para expor o bregma.
    8. Esfregue o crânio com algodão estéril.
    9. Aplique uma a duas gotas de cola cirúrgica na superfície do crânio.
    10. Coloque a ponta da sonda de fibra óptica de 5 mm caudal para a bregma e 6 mm lateral à linha média.
    11. Comece a gravar o fluxo sanguíneo no software do computador. Aguarde até ocorrer uma linha de base estável do fluxo sanguíneo e aplique um catalisador de 20 μL sobre a cola para consertar a sonda.
      NOTA: uma linha de base ideal deve ser mais de 500 fluxos.
    12. Se a linha de base for inferior a 200 fluxos, ajuste a posição finamente para obter uma linha de base adequada. Mantenha a sonda unida ao crânio durante a duração da experiência.
    13. Desinfecte a cabeça com iodophor afTer a sonda de fibra óptica anexada.
  3. MCAO:
    1. Coloque e repare o mouse anestesiado (com a sonda LDF anexada ao crânio) em posição supina e mantenha a temperatura do corpo usando uma lâmpada de calor ao longo da cirurgia. Desinfecte o pescoço com 70% de álcool etílico.
    2. Faça uma incisão cutânea paramediana no pescoço usando um bisturi; Dissimulam os tecidos moles com fórceps para expor os vasos. Adicione uma gota de solução salina aos tecidos expostos para mantê-los hidratados.
    3. Dissecar a artéria carótida comum do tecido circundante e do nervo vago usando pinça oftálmica. Tenha cuidado para não danificar o nervo vago. Desinfecte novamente a pele do pescoço com iodóforo após exposição à artéria carótida comum.
    4. Coloque uma braçadeira de microvasos na extremidade distal da artéria carótida comum e, em seguida, amarre um nó morto com suturas de seda 6-0 na extremidade proximal. Coloque o grampo o mais proximamente possível para operações subsequentes. Certifique-se de que o comprimento deO recipiente entre o grampo eo nó morto é o maior tempo possível para as operações subsequentes.
    5. Faça uma sutura temporária proximal ao grampo, amarrando um nó solto. Certifique-se de que haja espaço suficiente entre dois nós para a inserção de monofilamentos.
    6. Faça uma pequena incisão longitudinal entre os dois nós com tesoura micro-oftálmica. Certifique-se de que a incisão seja tão próxima ao nó morto quanto possível para as operações subsequentes. Tenha cuidado para não cortar a embarcação.
    7. Insira um monofilamento com mola de 12 mm com a incisão para entrar no lúmen da artéria e avance-o alguns mm. Aperte o nó solto em torno da ponta do monofilamento e retire o grampo.
    8. Avance o filamento para a artéria carótida interna (10 mm para ocultar a artéria cerebral média) com pinça oftálmica até o software LDF mostrar um declínio acentuado (> redução de 80% no fluxo sanguíneo basal) no fluxo sanguíneo. Registre o tempo de início da oclusão.
      NOTA: a configuração do instrumento LDF éDescrito na seção 2.2.
    9. Ocultar a artéria cerebral média durante 1 h. Corte a sonda LDF e coloque os ratos em uma incubadora de 30 ° C durante o período de oclusão.
  4. Reperfusão e APC:
    1. Re-anestesiar os animais com isoflurano como descrito acima 55 minutos após o início da oclusão. Coloque e repare ratos em posição supina. Abra a incisão do pescoço e reexponha a artéria carótida comum.
    2. Retire suavemente o filamento com pinça oftálmica após o período de oclusão para obter reperfusão e torne a sutura temporária em permanente, apertando o nó.
    3. Para o tratamento de acidose, mudar o gás inalado pelo cone de nariz para os gases de mistura contendo 20% de CO2, 20% de O2 e 60% de N 2 durante 5 min a 5, 50, ou 100 minutos após a reperfusão. Feche a incisão com uma sutura cirúrgica interrompida.
    4. Coloque ratos em uma gaiola de calor a 30 ° até que os ratos recuperem a consciênciaE depois devolver os ratos para limpar, gaiolas individuais. Forneça ratos com uma placa de Petri de água e alimentos umedecidos. Monitore os ratos de perto após a cirurgia por dor excessiva e morte.
  5. Medição do volume do infarto do cérebro:
    1. Medir o volume do infarto cerebral usando TTC coloração 24 h após a reperfusão.
    2. Prepare a solução TTC de 0,25% como mencionado no passo 1.4.1 antes do tempo designado de sacrifício. Transfira a solução para uma placa de 24 poços (1 mL por poço) coberta de papel alumínio e guarde-a a 4 ° C.
      NOTA: TTC e tecido corado com TTC são sensíveis à luz.
    3. Às 24 h após a reperfusão, sacrificar o animal com uma overdose de isoflurano em uma câmara de indução. Decapite os ratos. Dissie os cérebros usando pequenas tesouras e fórceps. Examine os pontos de sangue nos cérebros para excluir os ratos submetidos a hemorragia subaracnóidea no círculo de Willis.
    4. Coloque o cérebro em um slide de vidro limpo em -20 ° C embalagem de gelo. Coloque o cérebro e o vidro deslize em um refrigerador de -20 ° C por 5 minutos para facilitar o corte do cérebro.
    5. Retire o cérebro eo vidro deslize de -20 ° C e coloque-os de volta no pacote de gelo de -20 ° C. Dissecar o pólo frontal e o cerebelo com lâmina e pinça.
    6. Corte as seções do cérebro horizontalmente até uma espessura de 1 mm com uma lâmina para produzir 5 fatias. Transfira as fatias para dentro da placa de 24 poços contendo solução TTC (1 fatia por poço) com fórceps e estique as fatias na solução. Incubar as fatias na solução de TTC a 37 ° C num banho de água pouco profunda durante 30 min.
    7. Aspirar a solução TTC. Adicione 10% de formaldeído (1 mL por poço) e incuba à temperatura ambiente durante 30 min. Coloque as fatias na ordem em que foram cortadas em uma folha de celofane e digitalizar os segmentos na imagem fotográfica fotográfica.
    8. Analise o tamanho do infarto como uma porcentagem de toda a fatia do cérebro usando o software de análise ImageJLass = "xref"> 8 com base na identificação visual; Veja a Figura 2 (esquerda).

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No modelo da fatia corticostriatal descrita acima, a viabilidade corticostriatal da fatia foi quantificada por meio de ensaio TTC às 1 h após a reperfusão. A conversão TTC foi calculada normalizando a absorção a 490 nm para a fatia de controle. De acordo com a conversão de TTC, a APC protegeu contra lesões de reperfusão induzidas por OGD de uma maneira dependente de tempo e de início. Em detalhes, tanto 1 quanto 3 minutos de tratamento de acidose melhoraram significativamente a viabilida...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui apresentamos dois modelos experimentais para estudar a neuroproteção de APC contra isquemia cerebral. Em fatias de cérebro, a APC é conseguida através da incubação de fatias corticostriatais de camundongos em tampão ácido borbulhado com 20% de CO 2 após o início da reperfusão, enquanto que no modelo MCAO, a APC é conseguida inalando 20% de CO 2 para ratos após reperfusão. Ambos os modelos refletem a neuroproteção da APC contra a isquemia cerebral. A proteção foi comparável à alcançada pelo pós...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81573406, 81373393, 81273506, 81221003, 81473186 e 81402907), Fundação Provincial de Ciências Naturais de Zhejiang (LR15H310001) e o Programa para a equipe líder de Zhejiang da equipe de inovação S & T (2011R50014).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cloreto de sódioSigmaS5886
Cloreto de potássioSigmaP5405
Fosfato de potássio monobásicoSigmaP9791
Sulfato de magnésioSigmaM2643
Bicarbonato de sódioSigmaS5761
Cloreto de cálcio di-hidratadoSigmaC5080
D-(+)-glicoseSigmaG7021
VibratomeLeicaVT1000 S
cloridrato de 2,3,5-trifeniltetrazólioSigmaT8877
Etanol absolutoAladdin Industrial CorporationE111993
Dimetilsulfóxido SigmaD8418
Laser Doppler FluxometriaMoor Instruments LtdModelo Moor VMS-LDF2
Éter dietílico anidroSinopharm Chemical Reagent Corporation80059618
Tricloroacetaldeícol hidratoSinopharm Chemical Reagent Corporation30037517
10% FormalinaAladdin Industrial CorporationF111936
placas de 24 poçosJet BiofilTCP-010-024

Referências

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