Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

Resumo

Apresentamos uma configuração e protocolo de gravação de comportamento que permitem análise automatizada do nematóide, preferência de Caenorhabditis elegans por compostos solúveis em um ensaio populacional. Este artigo descreve a construção de uma câmara de comportamento, o protocolo de ensaio comportamental e o uso de software de análise de vídeo.

Resumo

O nematóide, o sistema nervoso compacto de Caenorhabditis elegans de apenas 302 neurônios, está subjacente a um variado repertório de comportamentos. Para facilitar a dissecação dos circuitos neurais subjacentes a esses comportamentos, é necessário o desenvolvimento de ensaios comportamentais robustos e reprodutíveis. Estudos comportamentais anteriores de C. elegans usaram variações de um "teste de queda", um "teste de quimiotaxis" e um "ensaio de retenção" para investigar a resposta de C. elegans a compostos solúveis. O método descrito neste artigo procura combinar os pontos fortes complementares dos três ensaios acima mencionados. Resumidamente, um pequeno círculo no meio de cada placa de ensaio é dividido em quatro quadrantes com controle e soluções experimentais colocadas alternadamente. Após a adição dos vermes, as placas de ensaio são carregadas em uma câmara de comportamento onde câmeras de microscópio gravam os encontros de vermes com as regiões tratadas. A análise de vídeo automatizada é então realizadaE um valor de índice de preferência (PI) para cada vídeo é gerado. A aquisição de vídeo e os recursos de análise automatizada deste método minimizam o envolvimento do experimentador e quaisquer erros associados. Além disso, quantidades minúsculas do composto experimental são usadas por ensaio e a configuração de câmara múltipla da câmara de comportamento aumenta o rendimento experimental. Este método é particularmente útil para a realização de telas comportamentais de mutantes genéticos e novos compostos químicos. No entanto, este método não é apropriado para estudar a navegação por gradiente de estímulo devido à proximidade das regiões de controle e solução experimental. Também não deve ser usado quando apenas uma pequena população de vermes está disponível. Embora adequado para ensaiar respostas apenas a compostos solúveis na sua forma atual, este método pode ser facilmente modificado para acomodar interação sensorial multimodal e estudos optogenéticos. Este método também pode ser adaptado para ensaiar as respostas quimiossensíveis de outras espécies de nemátodos.

Introdução

Foraging animals deve integrar entradas de múltiplas modalidades sensoriais e selecionar estratégias comportamentais apropriadas para navegar com sucesso em seu ambiente. Compreender como as entradas sensoriais externas são recebidas e transduzidas em informações neurais para orientar a seleção de ações é um objetivo central no campo da neurobiologia. O nematóide geneticamente tratável, C. elegans , é um organismo modelo atraente no qual estudar os mecanismos neurais subjacentes à biologia sensorial e à integração multimodal. Embora C. elegans tenha apenas 302 neurônios, pode detectar e discriminar entre uma ampla variedade de estímulos ambientais, incluindo compostos solúveis, odorantes voláteis e temperatura ambiente ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . oO nematóide C. elegans depende fortemente de seu aparelho quimiosensorial para localizar fontes alimentares e se alertar para ameaças potenciais. Assim, os ensaios comportamentais projetados para rastrear as respostas de C. elegans de tipo selvagem e mutante para estímulos químicos desempenham um papel crucial na dissecação dos mecanismos genéticos, celulares e neurais subjacentes às capacidades sensoriais notáveis ​​de C. elegans .

Para ensaiar a resposta a compostos solúveis, três tipos de ensaios foram descritos - o teste de queda, o teste de quimiotaxia e o ensaio de retenção. No teste de queda, uma pequena gota do composto é colocada na cauda de um sem-fim móvel e a decisão do vermeiro de reverter ou avançar uma vez que o líquido atinge o aparelho sensitivo anterior é marcada ⁴ . O teste de queda requer pouca preparação experimental e é útil quando o tamanho da amostra de vermes é pequeno, como no caso de vermes operados a laser. No entanto, como apenas um wormPode ser ensaiado de cada vez e o experimentador deve estar presente ao longo da duração do ensaio, o teste de queda pode levar muito tempo. O teste de queda também é vulnerável às variações na entrega de queda entre cada verme dentro de uma amostra, o que pode influenciar os resultados globais do ensaio. Outra limitação do teste de queda é que ele só pode ser usado para testar a resposta do verme a compostos aversivos, pois não é possível discriminar entre um efeito atraente ou neutro do composto do movimento para a frente do sem-fim.

O teste de quimiotaxia para compostos solúveis geralmente envolve dividir uma placa de ágar em quatro quadrantes, com a solução experimental misturada no agar de dois quadrantes opostos e a solução de controle misturada nos outros dois quadrantes ^{8 , 9} . No início do ensaio, uma gota de tampão contendo vermes é colocada no centro da placa e o número de vermes em Cada quadrante é marcado em diferentes pontos de tempo. O teste de quimiotaxia fornece maior poder estatístico em comparação com o teste de queda, pois um grande número de vermes são testados em cada ensaio. No entanto, uma limitação deste método é que a preparação das placas de ensaio de quimiotaxia requer grandes quantidades do composto experimental. Isso tornará difícil a realização de telas de comportamento em larga escala se um processo de purificação complicado com rendimentos limitados for necessário para obter o composto de interesse, como no caso das moléculas de sinalização de ascarósido ¹⁰ . Além disso, a contagem manual de worms ao longo do ensaio é susceptível a erros e a perturbação das placas durante o processo de contagem pode afetar os resultados.

Ao contrário dos dois métodos acima mencionados, o ensaio de retenção utiliza visão de máquina, o que minimiza o erro durante o processo de pontuação e reduz a interferência do experimentador durante o ensaio > 11. A análise computadorizada de gravações de vídeo do comportamento de vermes também pode potencialmente revelar dinâmicas comportamentais mais sutis que serão perdidas quando a pontuação só é realizada em alguns pontos de tempo discretos. No ensaio de retenção, duas manchas de soluções são adicionadas nos lados opostos de um pequeno parto alimentar bacteriano circular, seguido da colocação de um pequeno número de vermes no meio do remendo alimentar. O comportamento dos vermes é, então, gravado em vídeo, analisado, e um valor de índice de preferência é calculado com base no número total de pixels de sem-fim em cada região de solução. Embora a presença de um parto de comida atraente permita que pequenas populações de vermes sejam usadas em cada ensaio, os alimentos já demonstraram sensibilizar comportamentos de evitação para repelentes solúveis ¹² . Além disso, os vermes exibem uma resposta fotofóbica a luz de curto comprimento de onda e o uso de fontes de luz de microscópio que emitem luz branca na configuração de gravação de comportamento pode afetar o comportamentoS = "xref"> 13.

O objetivo do método discutido neste artigo é registrar e analisar a preferência de C. elegans por compostos solúveis usando um ensaio baseado em população. Para este fim, o método atual integra e melhora aspectos de todos os três métodos discutidos anteriormente. Permite que grandes populações de vermes sejam testadas e requerem pequenas quantidades de solução experimental a serem utilizadas em cada ensaio. Além disso, o ensaio é conduzido dentro de uma câmara de comportamento fechada customizada com retroiluminação de LED infravermelho para minimizar os efeitos da luz de curto comprimento de onda no comportamento. Cada câmara também pode ser equipada com múltiplas câmeras de microscópio, o que aumenta a produção experimental sem comprometer o espaço do banco. Finalmente, o software de análise de vídeo produz o valor do índice de preferência para cada vídeo, bem como um gráfico de ocupação de vermes que acompanha para visualizar a dinâmica do comportamento da população ao longo do tempo. A configuração da câmara e umO protocolo Ssay pode ser modificado para estudar as respostas do comportamento multimodal, como o efeito de odorantes ou a temperatura nos comportamentos quimiossensivos.

Este artigo descreve a construção da câmara de comportamento e do protocolo de ensaio. Também demonstra a utilidade deste método ao ensaiar a resposta de vermes de tipo selvagem e mutantes defeituosos quimiossensíveis para o repelente solúvel conhecido, íons de cobre ⁴ . Finalmente, o processo de análise de vídeo usando o software fornecido é detalhado.

Protocolo

1. Assembléia da Câmara de Comportamento

NOTA: A câmara de comportamento consiste em uma armação em forma de cubo em barras de alumínio extrudado, cobertas com tampas opacas de tecido, com um fundo de acrílico transparente e suportes de câmera. As juntas entre as barras de alumínio extrudado que formam a câmara de comportamento são todas perpendiculares e são protegidas usando suportes de canto em forma de "L" (1 polegada de largura com pernas de 1 polegada) que prendem uma perna de suporte de canto a cada barra com parafusos e deslize T-nuts. Cada junta é segura com um ou dois suportes de canto como descrito abaixo. As tampas de tecido sobre a câmara estão presas às barras de armação de alumínio com os mesmos parafusos e porcas T deslizantes, mas através de aparas nos cantos do tecido. Os parafusos são devidamente inseridos no lado amassado das porcas em T deslizantes, não no lado com o lábio saliente. Ao colocar um conjunto de fixador de parafuso / tampa em T numa barra de alumínio, deslize a porca em T para dentro do canalNa face apropriada da barra com a cabeça do parafuso saindo da ranhura.

1. Prepare capas de tecido.
   1. Use uma tesoura para cortar cinco partes do tecido de poliéster opaco para cobrir a parte superior e os quatro lados da câmara.
      1. Corte uma tela quadrada de 14 x 14 polegadas ² para o topo da câmara. Corte quatro folhas de tecido rectangulares de 11 x 14 polegadas e ² para os lados da câmara.
   2. Instale manchas nos cantos das folhas de tecido.
      1. Marque uma linha de referência de 0,5 polegadas de cada borda de todas as cinco folhas de tecido de poliéster usando um lápis e uma ponta.
      2. Para as quatro folhas retangulares, use alicate de aparas para inserir os ombros centrados onde as linhas de lápis se cruzam em cada canto (ou seja, 4 grommets por folha).
      3. Para a folha quadrada, insira dois grommets ao longo de cada borda com cada grommet centrado na linha de lápis e posicionado a 1,5 polegadas do final de cada um dosAs quatro linhas de lápis (ou seja, 8 grommets totais, duas próximas a cada canto).
   3. Insira um parafuso em cada furo de aparafusar e prenda uma porca em T de forma frouxa para cada um.
2. Fabricação de barras de montagem da câmera.
   1. Use uma serra de fita ou equivalente para cortar uma peça de extrusão de alumínio de 2 polegadas de comprimento para cada câmera, garantindo que a extremidade cortada da barra seja perpendicular ao comprimento da barra para facilitar a montagem posterior.
   2. Use uma broca com uma broca de 0,25 polegada de diâmetro para perfurar um furo através das redes centrais de cada barra de montagem da câmera, 0,75 polegadas de uma extremidade, de modo que o orifício seja perpendicular às faces superior e inferior e passa pela linha central da barra . Opcionalmente, perfure o furo usando uma broca elétrica portátil com broca de 0,25 polegadas, mas assegure-se de que o orifício seja perpendicular às faces superior e inferior da barra.
3. Prepare todos os suportes de canto.
   1. Insira um parafuso no orifícioCada perna do suporte de canto, inserindo o parafuso do lado angular interno. Enfriar facilmente uma porca em T para cada parafuso.
4. Prepare o conjunto de montagem da câmera ( Figura 1B , camada 2).
   NOTA: O conjunto de montagem da câmera é um conjunto em forma de "H" que suporta os três coldres da câmera.
   1. Anexe as barras de montagem da câmera à barra central do conjunto de montagem da câmera.
      1. Coloque as três barras de montagem da câmera fabricadas no passo 1.2 com os orifícios perfurados orientados verticalmente. Deslize dois suportes de canto nos lados de cada barra de montagem no extremo mais distante do furo.
      2. Posicione os suportes de canto com as pernas dos suportes nivelados com a extremidade da barra e aperte os parafusos para fixar no lugar. Isso forma uma forma de "T" com o furo perfurado na parte inferior do "T".
      3. Coloque uma extrusão de alumínio de 1 pé na superfície de trabalho. Deslize as porcas em T de uma barra de montagem de câmera(Do passo anterior) em um lado da barra de 1 pé. Centre a barra de montagem ao longo do comprimento da barra de 1 pé e aperte os parafusos para fixar no lugar. Deslize as outras duas barras de montagem no lado oposto da barra de 1 pé.
      4. Posicione as duas barras equidistantes do meio da barra de 1 pé, com os suportes de canto internos a aproximadamente 2,5 centímetros de distância. Deslize os suportes de canto nos lados da barra de 1 pé, dois em cada extremidade da barra. Posicione os suportes de canto com as pernas dos suportes nivelados com as extremidades da barra e aperte os parafusos para fixar no lugar.
   2. Anexe as barras de extremidade à barra central.
      1. Deslize duas extrusões de alumínio de 1 pé nas porcas em T em cada extremidade da montagem do passo anterior formando uma forma de "H". Centre cada barra de extremidade na barra central e segure apertando os quatro parafusos.
      2. Deslize quatro suportes de canto na parte superior das duas barras de extremidade adicionadas no passo anterior, uma em cada extremidadeDe cada bar. Posicione os suportes dos cantos com as pernas dos suportes niveladas com as extremidades das barras e aperte os parafusos para fixar no lugar.
   3. Anexe os suportes da câmera e os coldres ao conjunto de montagem da câmera.
      1. Para cada um dos três suportes de câmera do microscópio, remova o coldre da câmera soltando o parafuso de aperto manual e deslizando a haste do suporte.
      2. Para cada barra de montagem da câmera (agora fixada à barra central do "H"), coloque uma arruela sobre um parafuso de cabeça redonda, deslize o parafuso através do orifício perfurado na barra de montagem da câmera e coloque outra arruela sobre o parafuso . Arraste o orifício roscado da barra do suporte da câmera para baixo no parafuso, apertando firmemente contra a barra de montagem da câmera.
      3. Repita as etapas 14.3.2 para as outras duas barras de montagem da câmera.
      4. Deslize um coldre da câmera em cada barra de suporte da câmera com a abertura mais larga orientada para a barra de montagem da câmera e parafuso. Fixar temporariamente o coldre ao suporte da câmera rOd com o parafuso de pulso do coldre.
         NOTA: A posição operacional final será definida na seção 2.
5. Monte o quadro da câmara de comportamento ( Figura 1A ).
   NOTA: Para facilidade de construção, monte o quadro de cabeça para baixo, começando com o "topo" do quadro da câmara na superfície de trabalho ( Figura 1B , camada 1) e trabalhando para cima em direção aos "pés" do quadro ( Figura 1B , camada 3).
   1. Para montar a camada superior da câmara de comportamento, prenda quatro barras de alumínio extrudido de 1 pé na folha de poliéster quadrada ( Figura 1B , camada 1).
      1. Deslize uma barra nas duas porcas em T ao longo de cada borda da folha de tecido, centrando a barra ao longo da largura do tecido. Aperte os parafusos para fixar a folha de tecido a cada barra.
      2. Espalhe a folha de poliéster quadrada na superfície de trabalho wiAs quatro barras de alumínio em anexo. Deslize oito suportes de canto nas superfícies superiores das quatro barras de alumínio, uma em cada extremidade de cada barra. Posicione os suportes das esquadrias nas barras, com as pernas verticais dos suportes niveladas com as extremidades das barras. Fixe apertando os parafusos nas porcas em T.
   2. Por sua vez, em cada esquina, levante uma extrusão de alumínio adicional de 1 pé no vertical, deslizando a extrusão sobre as porcas em T nas duas pernas do suporte de canto.
   3. Proteja a barra vertical das barras horizontais apertando os parafusos, juntando as duas barras horizontais adjacentes.
      NOTA: Quando completadas, as oito extrusões (quatro horizontais e quatro verticais) formam um anel quadrado na mesa com quatro posts que ficam para cima ( Figura 1B , camada 1).
   4. Deslize as porcas T soltas do conjunto de montagem da câmera em forma de "H" da seção 1.4 para baixo nos montantes da moldura da etapa anterior. Deixe o "H & #34; Deslize todo o caminho para baixo para descansar sobre os suportes de canto em cada canto do quadro. Prenda o conjunto de montagem da câmera no lugar apertando os quatro parafusos do suporte de canto.
   5. Monte a camada inferior da câmara usando as quatro barras finais de alumínio extrudido de 1 pé ( Figura 1B , camada 3).
      1. Deslize um suporte de canto em cada extremidade de cada barra de 1 pé, posicione os suportes de canto com as pernas das braçadeiras niveladas com as extremidades da barra e aperte os parafusos para fixar no lugar.
      2. Deslize as barras para baixo entre os montantes da armação com as porcas T soltas nos canais dos montantes. Posicione as barras para que as bordas superiores dos seus suportes de canto estejam a uma polegada abaixo da extremidade aberta dos montantes e seguras no lugar apertando os parafusos do suporte de canto.
6. Deslize as porcas em T das quatro folhas de poliéster rectangulares para baixo nos canais das barras de extrusão verticais para cobrir os lados do chambeE aperte os parafusos para fixar no lugar.
7. Selecione um lado para ser uma porta para acessar o interior da câmara e remova os dois parafusos e porcas em T na camada inferior da câmara.
   NOTA: Quando o quadro é virado para a posição vertical, a parte inferior desta tampa ficará solta na parte inferior e pode ser levantada para acessar o interior da câmara.
8. Coloque uma tampa de plástico na extremidade superior de cada membro da esquina para servir como pés para o quadro completo. Vire o quadro do lado direito para cima. Insira dois suportes de painel por lado dentro da camada de base do quadro e torça para protegê-los no lugar ( Figura 1B , camada 3). Coloque uma polegada ² pedaço de acrílico transparente na parte superior dos suportes de painel 12 x 12 para proporcionar um palco para placas de ensaio (Figura 1B, a camada 3).

2. Posicionamento do modelo de câmera e palco

1. Baixe e instale o software de aquisição de vídeo da câmera do microscópio no computadorDo site do fabricante.
2. Deslize uma câmera de microscópio em cada um dos três coldres da câmera com a ótica da câmera apontada para o estágio acrílico e a luz de fundo. Conecte as câmeras às portas USB do computador. Posicione o painel de luz de fundo do infravermelho LED sob a moldura, centrando-se sob o estágio. Conecte o painel de luz de fundo para ligar.
3. Imprima os modelos fornecidos de colocação de solução e alinhamento de placas em folhas transparentes (consulte o arquivo suplementar ).
   NOTA: no modelo de posicionamento da solução, o círculo perimetral da placa é de 3,8 cm de diâmetro e o círculo de região interna de interesse é de 0,9 cm de diâmetro.
4. Corte ao longo das linhas de grade para obter peças de transparência retangulares que encerram os modelos circulares.
5. Inicie o software de aquisição de vídeo e clique nas miniaturas numeradas na parte superior da janela para ver os feeds das câmeras.
6. Ajuste o alinhamento e a ampliação da câmera do microscópio.
7. Posicione um modelo de alinhamento de placa sob uma lente de câmera de microscópio ( Figura 2B ).
8. Altere a distância de trabalho deslizando verticalmente o coldre da câmera ao longo da barra de suporte da câmera e ajuste a ampliação da câmera girando o botão de ampliação da câmera até que os marcadores de números do modelo estejam claramente visíveis nas bordas do campo de visão da câmera.
9. Tape o modelo de alinhamento de placa para o estágio de acrílico.
10. Coloque uma placa de amostra de vermes no modelo de alinhamento da placa sob a câmera do microscópio e aperfeiçoe a ampliação e a distância de trabalho até obter uma imagem nítida dos sem-fins enquanto ainda mantém os marcadores de números dentro do campo de visão.
11. Repita as etapas 2.6.1-2.6.4 para as outras duas câmeras de microscópio.

3. Nematode Crescimento e Sincronização

1. Quatro dias antes das experiências, semente vinte e quatro 60 mmPlacas de agar Nematode Growth Media (NGM) com 50 μL de OP50 Escherichia coli no caldo Luria-Bertani (LB) (ver secção 5 para a receita).
   NOTA: Cada placa de 60 mm fornecerá worms suficientes para uma placa de ensaio. É recomendável a aquisição de seis repetições por tratamento ou genótipo.
2. Deixe as placas semeadas secar verticalmente com as tampas ligadas, durante a noite à temperatura ambiente.
3. No dia seguinte, transfira quinze hermafroditas gravidas bem-alimentadas em cada placa semeada e permita que os vermes ponham ovos por seis horas. Isso produzirá> 360 ovos por placa.
4. Após 6 h, remova os vermes das placas semeadas e deixe a progênie crescer por três dias em adultos a 20 ° C.

4. Ensaio de preferência quimiossensorial

1. No dia anterior ao experimento, prepare placas de teste de agar NGM de 35 mm.
   1. Prepare 250 mL de agar NGM (consulte a seção 5 para a receita).
   2. Organize vinte e oito placas vazias de 35 mm em pilhas de cinco ou menos em um monte planoRface. Preencha cada placa de ensaio com 5 mL de agar NGM. Deixe as placas de ensaio secar verticalmente com as tampas ligadas, durante a noite à temperatura ambiente.
      NOTA: Como regra geral, prepare uma placa de ensaio adicional para cada tratamento ou genótipo a ser testado em caso de contingências.
2. No dia do experimento, acenda a luz de fundo, inicialize o computador e inicie o software de captura de vídeo da câmera do microscópio.
3. Conecte uma câmera de microscópio ao computador e ajuste as configurações de gravação de vídeo.
   1. Clique na miniatura da câmera numerada na parte superior da janela do software para ver a alimentação ao vivo da câmera.
   2. Puxe o menu 'Video Format' no canto superior esquerdo da alimentação da câmera e selecione 'MJPG 1280 x 1024'. Puxe o menu 'Pasta' ao lado do menu 'Formato de Vídeo' e selecione uma pasta na qual salvar os arquivos de vídeo.
   3. Clique no ícone 'Auto Exposure' no canto superior direito deA alimentação da câmera e desligue a exposição automática. Clique no ícone 'LED' imediatamente à direita do ícone 'Auto Exposure' para desligar os LEDs da câmera do microscópio embutido. Clique no ícone adjacente 'Configurações': selecione 'Monocromático', maximize 'Contraste' e ajuste 'Brilho' até que os vermes sejam distintos do fundo.
4. Adquira os vídeos de calibração.
   1. Alinhe um modelo de posicionamento de solução em cima de um modelo de alinhamento de placa de estágio ( Figura 2A ). Clique no ícone de gravação "Time-Lapsed Video" no lado esquerdo da alimentação da câmera e digite '5' s para duração e '1' para intervalo para gravar um vídeo de 5 s em 1 quadro / s. Clique em 'Iniciar' para iniciar a gravação de vídeo.
5. Repita as etapas em 4.3 e 4.4 para as outras duas câmeras de microscópio.
6. Remova o modelo de posicionamento da solução da câmara.
8. Use uma pipeta de vidro de 5 mL para adicionar 1,2 mL de tampão de NGM a uma placa de sem-fins sincronizados e agite suavemente a placa para deslocar os sem-fins no buffer. Pipetar o tampão da placa e distribuir vermes em tampão em um tubo de microcentrífuga limpo.
   NOTA: As vermes são sensíveis aos desvios em relação à sua concentração de sal em agar ¹⁴ . Para minimizar as alterações na concentração de sal de agar após a colocação de minhocas, recomenda-se o uso de tampão de NGM para o processo de lavagem (ver a seção 5 para a receita). Não use pipetas de plástico para remover os vermes das placas, pois os vermes ficarão presos aos lados. Prepare um número equivalente de tubos conforme o número de placas de ensaio a serem executadas simultaneamente.
9. Deixe os três tubos repousar durante 1-2 minutos para permitir que os vermes se depositem no fundo. Use uma ponta de pipeta de plástico para remover o máximo possível de tampão de lavagem dos tubos sem perturbar o grânulo de agregado.Worms na parte inferior dos tubos. Recarregue os tubos com 1 mL de tampão NGM limpo, cada um.
10. Repita o passo 4.7.2 uma vez.

Adicionar soluções de tampão CuCl ₂ e M13 10 mM para placas de ensaio (ver secção 5 para receitas).

1. Tape um modelo de posicionamento de solução em cima do estágio do microscópio de dissecação.
2. Coloque uma tira de fita dupla face em ambos os lados de um modelo de alinhamento de placa. Certifique-se de que a fita se sobrepõe ao círculo perimétrico da placa, mas não occlua a região de gravação de interesse no centro do modelo.
3. Alinhe o perímetro da placa de ensaio com o círculo no modelo de alinhamento da placa e pressione para baixo até o modelo aderir ao fundo da placa. Alinhe os marcadores do número do modelo da placa de ensaio com os marcadores do modelo de posicionamento da solução no microscópio de dissecação.
4. Use uma pipeta P2 e uma ponta de plástico para colocar 1 μL do tampão M13 cada nos quadrantes 1 e 4 ( 2 10 mM cada em quadrantes 2 e 3 ( Figura 2A ).
5. Repita as etapas 4.8.2-4.8.4 para as outras duas placas de ensaio.

Uma vez que as gotas da solução foram completamente absorvidas no agar, use uma pipeta de Pasteur de vidro para transferir vermes lavados de cada tubo de microcentrífuga para a placa de ensaio correspondente.

Coloque uma gota de vermes cada uma na área acima e abaixo da região tratada circular. Dobre um tecido quatro vezes e use a borda sem corte para absorver o excesso de tampão de lavagem em todas as placas de ensaio.

Coloque imediatamente as três placas de ensaio sob as câmeras do microscópio na câmara de comportamento alinhando os números nos cantos do modelo. Aguarde 2-3 minutos para permitir que os vermes se aclimatem às placas de ensaio.
NOTA: Certifique-se de que a aba da porta da câmara de comportamento esteja fechada antes de iniciar a gravação de vídeo na próxima etapa.

Repita as etapas 4.7-4.12 para a próxima rodada de placas de ensaio. Adquirir pelo menos seis repetições ou duas rodadas de gravação para cada tratamento ou genótipo.

5. Preparação do reagente

1. Preparar agar NGM e tampão.
   1. Em uma garrafa de vidro de 1 L, adicione 1,5 g de cloreto de sódio, 8,5 g de ágar e 1,25 g de peptona. Adicione 500 mL de água destilada e uma barra de agitação à garrafa. Autoclave garrafa com conteúdo.
   2. Coloque a garrafa em uma placa de agitação e ligue a função de agitação.
   3. Adicionar em ordem usando técnica estéril: 0,5 mL de colesterol 5 mg / mL, 0,5 mL de cálcio 1 MCloreto, 0,5 mL de sulfato de magnésio 1 M e 12,5 mL de fosfato de potássio 1 M.
   4. Repita as etapas 5.1.1 a 5.1.2 para fazer o tampão NGM, mas deixe de fora o agar e a peptona no passo 5.1.1.
2. Prepare o caldo LB.
   1. Em uma garrafa de vidro de 1 L, adicione 5 g de triptona, 2,5 g de extrato de levedura, 2,5 g de cloreto de sódio, 500 mL de água destilada e 0,5 mL de hidróxido de sódio 1 N. Autoclave garrafa com conteúdo.
3. Prepare o tampão M13.
   1. Em uma garrafa de vidro de 1 L, adicione 1,817 g de Tris, 2,922 g de cloreto de sódio, 0,373 g de cloreto de potássio e 500 mL de água destilada. Autoclave a garrafa com o conteúdo.
4. Prepare solução de cloreto de cobre (CuCl ₂ ).
   1. Pesar 0,134 g de CuCl ₂ . Adicione soluto a 10 mL de tampão M13 em um tubo de plástico de 15 mL para fazer solução de reserva de CuCl ₂ 100 mM. Inverta o tubo de plástico até que todo o soluto tenha disso.
   2. Use uma seringa e um filtro de membrana de 0,2 μm para filtrar a solução 100 mM de CuCl ₂ em um tubo de plástico limpo de 15 mL.
   3. Para fazer a solução de 10 mM de CuCl _2, adicionar 900 ul de M13 de tampão e 100 ul de 100 mM de solução de CuCl ₂ estoque para um tubo de microcentrífuga. Inverta o tubo de microcentrífuga para misturar bem.

6. Análise de vídeo

1. Baixe Python 3 (https://www.python.org/downloads/) e a biblioteca de software OpenCV (http://opencv.org/downloads.html).
2. Baixe os três scripts Python para análise (https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm).
   NOTA: Certifique-se de que todos os arquivos de vídeo a serem usados ​​estão no formato mp4 antes de prosseguir.
3. Para ver a função e as descrições dos parâmetros, digite 'help (digite o nome da função)' no console e pressione enter. Por exemplo, digite 'help (calibration)' e pressione enter.
4. Execute a função de calibraçãoCom parâmetros de entrada para definir as regiões de interesse de vídeo (ROI).
   1. Digite o nome do arquivo do vídeo de calibração selecionado na seção 4 para a variável 'mp4filename'. Inclua aspas ao inserir o nome do arquivo.
   2. Comece com os valores 600 e 360 ​​para as variáveis ​​'Q * x' e 'Q * y'. * Digite quadrantes dos números 1 a 4. Comece com o valor 310 para a variável 'rad'. Ajuste os valores variáveis ​​até que as máscaras ROI se alinhem com os contornos do quadrante no modelo.
   3. Registre o número total de pixels em cada ROI que será impresso no console após a execução desta função. Insira esse valor para o parâmetro 'ROI_size' na função preference_index.
5. Execute a função threshold_constant para determinar a constante de limiar apropriada. Ajuste o valor "constante" até que os vermes (brancos) possam ser vistos claramente e há ruído mínimo de sal e pimenta em segundo plano (Preto).
6. Execute a função preference_index para gerar uma folha de dados do csv, o índice de preferências do vídeo e o gráfico de ocupação do verme que acompanha.
   1. Use os valores de 'Q * x', 'Q * y', 'rad', 'ROI_size' e 'constante' determinados a partir das etapas 6.4 e 6.5 como parâmetros de entrada para a função preference_index.
      NOTA: Para cada quadro de vídeo, a função preferência_index conta o número de pixels de sem-fim em cada ROI e calcula a porcentagem de pixels sem-fim a partir do número total de pixels ROI. A função gera então um valor de índice de preferência para cada quadro de vídeo usando a fórmula:
      
      NOTA: Uma vez que o programa analisou todos os quadros no vídeo, um valor médio do índice de preferência é gerado para o vídeo. Uma trama de ocupação de vermes com o índice de preferências do vídeo impresso no topo, bem como uma folha de dados csv contendoPixel sem-fim, porcentagem de valores de ocupação de vermes e o índice de preferência para cada quadro de vídeo será salvo na pasta designada assim que o programa terminar de ser executado.

Resultados

A Figura 3A mostra os valores do índice de preferência obtidos para diferentes tipos de genotipo e parentes de tratamento. Um valor de índice de preferência de 1 indica forte atração pela solução colocada no ROI experimental, enquanto um valor de índice de preferência de -1 indica forte repulsão. Um índice de preferência de 0,02 foi obtido quando a solução tampão M13 foi colocada tanto no ROI de controle quanto experimental, demonstrando que não há viés espacial em relação ao ROI. Os vermes N2 evitaram fortemente os íons de cobre, resultando em um índice de preferência de -0,67, o que corroborou achados prévios de que os íons de cobre são um forte repelente ( filme suplementar 1 ) ⁴ . Os mutantes osm-3 , que não possuem formação adequada dos segmentos distal dos cílios sensoriais, mostraram uma redução significativamente diminuída dos iões de cobre (PI = -0,19) ¹⁵ . Mutantes ocr-2 , que são de Eficaz em muitas respostas nociceptivas mediadas por ASH, incluindo evasão de cobre, também exibem diminuição significativamente diminuída e até mesmo alguma atração suave para íons de cobre (PI = 0,19) ( filme suplementar 2 ) ¹⁶ .

A Figura 3B mostra parcelas de ocupação de vermes representativas, que indicam a densidade de vermes no controle em relação aos ROIs ao longo do tempo em cada vídeo. Quanto mais escura a cor da área de traçado, maior o número de pixels de sem-fim no ROI. O gráfico de ocupação para worms N2 tratados com o controle de buffer M13 mostra que o número de worms em ambos os ROIs permanece semelhante ao longo do ensaio. No entanto, o gráfico de ocupação para worms N2 tratados com iões de cobre indica que os vermes evitam forte e consistentemente o ROI experimental ao longo do ensaio.

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Figura 1: Representação de foto e representação esquemática do design da câmara de comportamento. ( A ) Vista frontal da configuração da câmara de comportamento (esquerda) e representação esquemática correspondente do quadro da câmara (direita). Folhas de poliéster opacas encerram a câmara em todas as faces, exceto a face inferior, que permite a luz através do painel de luz de fundo infravermelho. Os números 1, 2 e 3 correspondem às camadas de extrusão em (B). ( B ) Esquema da vista superior das camadas de extrusão compreendendo a estrutura da câmara de comportamento. Isso inclui a camada superior (1), a camada de montagem da montagem da câmera intermediária (2) e a camada do estágio inferior (3). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 2: Modelos de colocação de solução e alinhamento de placas. ( A ) O modelo de posicionamento de solução possui quatro quadrantes e marcadores de alinhamento de números. A solução de controle é colocada nos quadrantes superior esquerdo e inferior direito enquanto a solução experimental é colocada nos quadrantes superior direito e inferior esquerdo. ( B ) O modelo de alinhamento de placas possui apenas marcadores de alinhamento de números para minimizar a oclusão dos vermes no campo de visão durante a gravação e análise de vídeo. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 3: Dados de exemplo coletados usando este ensaio. ( A ) Valores do Índice de Preferência (PI) para N2 de tipo selvagem e C. elegans mutantes m> em resposta ao tampão M13 e CuCl ₂ 10 mM. Os vermes de N2 não mostraram preferência entre o controle e os ROIs experimentais quando a solução de controle M13 foi colocada em ambos os ROIs, mas evitou fortemente o ROI experimental quando os íons de cobre foram colocados nele (PI = 0,02 e -0,67, respectivamente). Os mutantes osm-3 (p802) e os mutantes ocr-2 (ak47) mostraram diminuição significativa dos íons de cobre em comparação com N2 (PI = -0,1 e 0,2, respectivamente). N = 6 ensaios para cada emparelhamento de genótipo-tratamento,> 360 worms por ensaio, as barras de erro indicam ± 1 SEM, *** p <0,001, ANOVA unidirecional seguido do teste post-hoc de Tukey Honestly Significant Difference (HSD). ( B ) Parcelas representativas de ocupação de vermes para N2 worms com tampão M13 em ambos os ROIs (topo) e N2 worms com tampão M13 no ROI de controle e íons de cobre no ROI experimental (parte inferior). A escala de cores abaixo de cada gráfico de ocupação representa o número de pixels sem-fim.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme suplementar 1: Resposta comportamental de vermes N2 a 10 mM de cloreto de cobre. As pernas são atraídas para os quadrantes de controle com tampão M13 (superior esquerdo e inferior direito), mas evitam fortemente os quadrantes contendo íons de cobre dissolvidos em tampão M13 (superior direito e inferior esquerdo). O vídeo foi gravado em 1 quadro por segundo e acelerou 15x. Clique aqui para baixar este arquivo.

Filme suplementar 2: Resposta comportamental de ocr-2 (ak47) Worms to 10 mM Copper Chloride. Worms percorre uma extensão aproximadamente igual em ambos os quadrantes de controle com tampão M13 (superior esquerdo e inferior direito) e o quadranteS contendo iões de cobre dissolvidos em tampão M13 (superior direito e inferior esquerdo) ao longo da duração da gravação. Os mutantes apresentam uma ligeira preferência pelos quadrantes que contêm iões de cobre no início da gravação. O vídeo foi gravado em 1 quadro por segundo e acelerou 15x. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar: modelos de colocação de solução e alinhamento de placas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Um passo crítico no protocolo é garantir que as placas de ensaio tenham um nível consistente de secura em diferentes dias experimentais. Diferentes níveis de secura resultarão em diferentes taxas de difusão da solução no ágar e, conseqüentemente, variações nos resultados comportamentais. Assim, as placas de ensaio devem ser sempre frescas na tarde antes de experiências. O número de vermes testados por ensaio também deve ser regulado para facilitar a comparação entre os tratamentos. Para referência, um verme de tipo selvagem coloca 4-10 ovos / h em média, produzindo> 360 vermes por ensaio se o protocolo de sincronização do sem-fim acima for seguido ¹⁷ . Se certas cepas mutantes estiverem defasadas com ovos, escolha mais worms adultos gravidos para a colocação de ovos para atingir o número-alvo da progênie. Outro passo importante no protocolo é lidar com worms suavemente durante o processo de lavagem e colocação de vermes. As vermes são sensíveis aos estímulos mecânicos, que provocam respostas de estresse como S inversões e a inibição da deposição de ovos ¹⁸ . Além disso, deve-se ter cuidado para definir o ROI com precisão e para determinar o valor constante de limiar ótimo para condições de iluminação específicas antes de prosseguir com a análise de vídeo. Também é recomendado que os processos de calibração e limiar sejam repetidos se um longo período de tempo decorrer desde o último experimento foi executado.

Uma limitação deste método é que não é adequado para ensaiar pequenas populações de vermes. No entanto, se os controles apropriados para determinar a influência da presença de alimentos no comportamento sensorial, então, a utilização de alimentos para restringir o local exploratório espacial dos vermes, como no ensaio de retenção, também é possível com esta configuração. Além disso, este método não se destina a estudar a navegação gradiente de estímulo devido à proximidade e pequenas quantidades de controle e gotas de solução experimental usadas.

E_content "> No futuro, o software de programação que permite o rastreamento multi-worm e a extração de recursos de sem-fim pode ser integrado neste sistema ^{19 , 20.} Gravando parâmetros de comportamento sutis do comportamento de sem-fim único, como velocidades de reversão e amplitude das curvas do corpo, fornecerão Uma imagem mais detalhada do comportamento quimiossensorial de um vermeiro individual no contexto de um ensaio baseado em população. O ensaio também pode ser modificado para estudar a habituação através de furos aborrecidos através do ROI usando agulhas de seringa com o tamanho adequado do calibre e preenchendo os orifícios com agar em infusão Com o composto experimental ou o tampão de controle. Isso assegurará uma concentração superficial mais consistente do composto durante um período de tempo de gravação mais longo, conforme necessário durante os estudos de habitação. Outra aplicação potencial deste método é realizar estudos comparativos de comportamento em diferentes espécies de nematóides. Além disso, a câmara de comportamentoPode ser modificado de várias formas para estudar as respostas comportamentais aos estímulos multimodais. Para aplicações optogenéticas, matrizes LED de alta intensidade podem ser anexadas ao lado da montagem da câmera para ativar seletivamente neurônios de interesse durante o ensaio. Elementos de aquecimento, sistemas de refrigeração e sensores de temperatura também podem ser adicionados à configuração para estudar os efeitos da temperatura nos comportamentos sensoriais. Além disso, sistemas de entrega de odor podem ser instalados dentro da câmara para investigar interações entre modalidades odontológicas e chemosensoriais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Extrusões de estrutura de fenda em T de alumínio	McMaster-Carr	47065T101	Perfil único, tamanho de 1", sólido
Suportes	McMaster-Carr	47065T236	1" de comprimento para extrusões de perfil único de 1" de altura
Fixadores de alimentação final compactos	McMaster-Carr	47065T139	1" (único), pacote de 4
suportes de painel sólido de torção	McMaster-Carr	47065T251	de alta extrusão de 1"
	McMaster-Carr	47065T91	Para alta extrusão de 1"
Folha de acrílico fundido opticamente transparente	McMaster-Carr	8560K211	3/16" de espessura, 12" x 12"
Tecido de poliéster revestido de vinil	McMaster-Carr	88505K57	0.027" de espessura, 61" de largura, preto
Ilhós de	latãoMcMaster-Carr	9604K22	Tamanho comercial 0, diâmetro externo de 0,545"
Arruelas de aço	McMaster-Carr	90107A029	Tamanho do parafuso de 1/4"
Parafusos de cabeça arredondada	McMaster-Carr	90272A546	Tamanho de rosca de 1/4" - 20, 1 - 1/2" de comprimento
Luz de fundo operacional padrão	Luzes Smart Vision	Veja o fornecedor local	8" x 8", infravermelho 850 nm
IVP-C1 Pote de Controle Variável	Smart Vision Lights	Veja o fornecedor
Fonte de Alimentação T1	Smart Vision Lights	Veja o fornecedor
Dino lite Pro AM4113T	Dino-Lite Microscópio Digital Veja	fornecedor
MS09B suporte para microscópio	Dino-Lite Microscópio Digital Veja	fornecedor local